基礎(chǔ)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)雙向聚酰胺薄膜層析凝膠層析分離與魚精蛋白

（優(yōu)選）基礎(chǔ)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)雙向聚酰胺薄膜層析凝膠層析分離與魚精蛋白現(xiàn)在是1頁\一共有34頁\編輯于星期五第一部分，轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析基因表達(dá)的調(diào)控關(guān)鍵在于轉(zhuǎn)錄起始水平的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)是研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)將有助于人們認(rèn)識(shí)和研究不同轉(zhuǎn)錄因子對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的時(shí)空性?，F(xiàn)在是2頁\一共有34頁\編輯于星期五

現(xiàn)在是3頁\一共有34頁\編輯于星期五現(xiàn)在是4頁\一共有34頁\編輯于星期五現(xiàn)在是5頁\一共有34頁\編輯于星期五第二部分，DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白現(xiàn)在是6頁\一共有34頁\編輯于星期五現(xiàn)在是7頁\一共有34頁\編輯于星期五現(xiàn)在是8頁\一共有34頁\編輯于星期五背景層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography)。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。英國生物學(xué)家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。1944年出現(xiàn)紙層析以后，層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層層析、親和層析、凝膠層析、氣相層析、高壓液相層析等?，F(xiàn)在是9頁\一共有34頁\編輯于星期五現(xiàn)在是10頁\一共有34頁\編輯于星期五葉綠素通過碳酸鈣管柱所形成的色譜圖現(xiàn)在是11頁\一共有34頁\編輯于星期五層析的兩種相固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動(dòng)相：在層析過程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動(dòng)相。在柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動(dòng)相）中的分布程度不同，即各組分所受的固定相的阻力和流動(dòng)相的推力影響不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。現(xiàn)在是12頁\一共有34頁\編輯于星期五按層析過程的機(jī)理分類：分配層析:

根據(jù)不同組分在不同溶劑中分配系數(shù)不同而使物質(zhì)分離的方法稱為分配層析。吸附層析:吸附是兩相成一界面，溶質(zhì)在表面密集的現(xiàn)象。以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)稱為吸附層析。常用吸附劑：活性碳、硅。離子交換層析:

是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)酸堿度、極性和分子大小差異而將物質(zhì)予以分離的一種方法。凝膠層析（分子篩）利用凝膠顆粒形成具有三維空間多孔性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，不帶電荷，可起濾過或“篩”的作用。親和層析是利用生物分子間所具有的專一性親和力的層析技術(shù)。層析法分類現(xiàn)在是13頁\一共有34頁\編輯于星期五層析法分類按兩相所處的狀態(tài)分類：流動(dòng)相有兩種狀態(tài)：液體作為流動(dòng)相氣體作為流動(dòng)相固定相也有兩種狀態(tài)：固體吸附劑作為固定相以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的狀態(tài)分為：液相層析和氣相層析流動(dòng)相固定相液體（液相層析)氣體（固相層析）液體液-液層析氣-液層析固體液-固層析氣-固層析現(xiàn)在是14頁\一共有34頁\編輯于星期五層析法分類名稱操作形式適用范圍柱層析將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。柱層析是常用的層析形式，適用于大量樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。薄層層析將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開，使各組份分離薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測(cè)分析和少量分離制備，通常為一次性使用。按操作形式不同分類：現(xiàn)在是15頁\一共有34頁\編輯于星期五吸附層析原理：任何兩個(gè)相都可以形成表面，其中一個(gè)相的物質(zhì)或溶解在其中的溶質(zhì)在此表面密集現(xiàn)象稱為吸附，利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)具有不同吸附力使混合物得到分的現(xiàn)象就叫吸附層析。凡能將其他物質(zhì)聚集到自己表面的物質(zhì)稱吸附劑，包括硅皮、氧化鋁、活性炭、淀粉、纖維素及陶土，而聚集于聚集于吸附劑表面的物質(zhì)稱被吸附劑。吸附劑與被吸附劑之間的作用除了物理作用外，還有化學(xué)作用，如DNS-氨基酸雙向聚酰胺薄膜層析時(shí)中被分離的物質(zhì)之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之間形成氫鍵?，F(xiàn)在是16頁\一共有34頁\編輯于星期五分配層析技術(shù)（液-液層析法）原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動(dòng)相）之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。紙層析是最廣泛的一種分配層析。特點(diǎn)：液-液層析法適合于分離同系物或同分異構(gòu)體現(xiàn)在是17頁\一共有34頁\編輯于星期五分配層析技術(shù)分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中分配的數(shù)量多，移動(dòng)快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相中分配的數(shù)量多，移動(dòng)慢。因此可彼此分開。分配系數(shù)主要與下列因素有關(guān)：①被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)；②固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)；③層析柱的溫度。相關(guān)的概念（一）：分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在固定相和流動(dòng)相兩相內(nèi)的濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)(Kd)。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)Kd=Cs/Cm

其中Cs:固定相中的濃度，Cm:流動(dòng)相中的濃度現(xiàn)在是18頁\一共有34頁\編輯于星期五分配層析技術(shù)相關(guān)的概念（二）：遷移率：在一定條件下，在相同的時(shí)間內(nèi)某一組分在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相本身移動(dòng)的距離之比值。常用Rf來表示。物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，Rf值也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來鑒定被分離的物質(zhì)。Rf=色斑中心至原點(diǎn)中心的距離溶劑前緣至原點(diǎn)中心的距離現(xiàn)在是19頁\一共有34頁\編輯于星期五親和層析法親和層析（AffinityChromatography）是利用生物分子間專一性親和力而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。如我們熟悉的：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補(bǔ)的DNA等。親和層析的分離原理簡單的說就是通過將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。親和層析可用于純化生物大分子、稀釋液的濃縮、不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏、從純化的分子中出去殘余的污染物、用免疫吸附劑吸附純化對(duì)此尚無互補(bǔ)配體的生物大分子，分離核酸是親和層析應(yīng)用的重要方面。親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。對(duì)分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。缺點(diǎn)是針對(duì)某一分離對(duì)象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件限制了其使用?，F(xiàn)在是20頁\一共有34頁\編輯于星期五親和層析示意圖現(xiàn)在是21頁\一共有34頁\編輯于星期五離子交換層析離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。離子交換劑包括交換樹脂和交換纖維素兩種。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合，形成一個(gè)帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。現(xiàn)在是22頁\一共有34頁\編輯于星期五凝膠層析技術(shù)概念：凝膠層析又稱分子篩層析、排阻層析，當(dāng)生物大分子隨流動(dòng)相通過裝有作為固定相的凝膠顆粒的層析柱時(shí)，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來?，F(xiàn)在是23頁\一共有34頁\編輯于星期五凝膠層析的原理分子大小不同混合物上柱；洗脫開始，小分子擴(kuò)散進(jìn)人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；大小分子分開：大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中。現(xiàn)在是24頁\一共有34頁\編輯于星期五凝膠顆粒是一類具有三維空間多孔性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，不帶電荷，可起濾過或“篩”的作用?，F(xiàn)在是25頁\一共有34頁\編輯于星期五凝膠層析的基本概念外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動(dòng)相的體積。內(nèi)水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積?；|(zhì)體積是指凝膠顆粒實(shí)際骨架體積。柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。我們?cè)O(shè)柱床體積為Vt，外水體積為Vo，內(nèi)水體積為Vi，基質(zhì)體積為Vg，則有：

Vt＝Vo＋Vi＋Vg

由于Vg相對(duì)很小，可以忽略不計(jì)，則有：

Vt＝Vo＋Vi現(xiàn)在是26頁\一共有34頁\編輯于星期五凝膠層析柱各種體積示意圖（陰影部分）外水體積（V0）內(nèi)水體積（Vi）基質(zhì)體積（Vg）基質(zhì)體積（Vt）現(xiàn)在是27頁\一共有34頁\編輯于星期五當(dāng)分子的Kd＝0時(shí)，Ve＝Vo即該分子被完全排阻于凝膠顆粒之外，全部分布于流動(dòng)相里，固定相里分布為零（A)；當(dāng)分子的Kd＝1時(shí)，Ve＝Vo+Vi即該分子完全不被排阻，均勻的分布在流動(dòng)相和固定相里，兩相比值為1(C)；當(dāng)0<Kd<1時(shí)，Ve=Vo+Kd*Vi即表明分子受到部分排阻(B)。樣品的量洗脫體積現(xiàn)在是28頁\一共有34頁\編輯于星期五原理聚酰胺薄膜層析是一類特殊的分配層析?；旌衔镫S流動(dòng)相通過聚酰胺薄膜時(shí)，由于被分離物質(zhì)與薄膜形成氫鍵，而各物質(zhì)形成氫鍵的能力不同，決定吸附力的差異，吸附力強(qiáng),展層速度慢，吸附力弱，展層速度快。展層溶劑與被分離物質(zhì)在聚酰胺離子表面競爭形成氫鍵，選擇適當(dāng)?shù)恼箤尤軇贡环蛛x物質(zhì)在溶劑與聚酰胺薄膜表面之間的分配系數(shù)有最大差異。易溶于展層劑的所受的動(dòng)力作用大，展層速度快，反之，速度慢。

DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析現(xiàn)在是29頁\一共有34頁\編輯于星期五本實(shí)驗(yàn)中，聚酰胺上的氨基與氨基酸（AA）的羰基形成氫鍵，酰胺基團(tuán)上羰基與AA中羥基或酚基形成氫鍵。由于有些AA結(jié)構(gòu)相似，如只采用一種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行單向?qū)游?，難達(dá)到完全分離的目的。因此可選擇另一溶劑系統(tǒng)進(jìn)行第二向?qū)游觥＿@種層析方法稱為雙向?qū)游?。第一向：苯－冰醋酸溶劑第二向：甲酸－水顯色：二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可與氨基酸的游離氨基結(jié)合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黃色熒光。DNS-Cl+AADNS-AA+HCl現(xiàn)在是30頁\一共有34頁\編輯于星期五實(shí)驗(yàn)操作DNS-氨基酸的制備（已完成）混合DNS－氨基酸的雙向?qū)游鳇c(diǎn)樣：在薄膜右下角距兩邊各0.6cm，直徑控制在2～3mm之間，點(diǎn)在無光澤面，可重復(fù)點(diǎn)樣2-3次；苯－冰醋酸層析：將點(diǎn)好樣品的薄膜用回形針固定放入展層劑中，展層劑前緣在距薄膜頂端2mm處即可停止,冷風(fēng)吹干，紫外燈下觀察；甲酸－水層析：調(diào)轉(zhuǎn)90度與第一相垂直，放入展層劑中，熱風(fēng)吹干，紫外燈下觀察，用鉛筆輕輕標(biāo)記（以免損壞薄膜表面）；分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；將層析后標(biāo)記好的薄膜以點(diǎn)樣點(diǎn)為左下角貼于實(shí)驗(yàn)報(bào)告中?，F(xiàn)在是31頁\一共有34頁\編輯于星期五3、操作注意事項(xiàng)：嚴(yán)格控制點(diǎn)樣位置以及點(diǎn)樣直徑。展層時(shí)勿將點(diǎn)樣點(diǎn)浸入展層劑中。展層后必