熒光定量PCR(徐歆改)

實驗七熒光定量PCR當前1頁，總共31頁。簡介定量PCR：檢測PCR反應指數(shù)期某一點的PCR產(chǎn)物數(shù)量，由此確定初始模板的數(shù)量。熒光定量PCR（real-timeQ-PCR）：是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線或內參基因對未知模板進行定量分析的方法。1996年由美國AppliedBiosystems公司推出該技術實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點當前2頁，總共31頁。熒光定量PCR的優(yōu)點熒光信號的強弱可實時反映DNA的擴增靈敏度極高，用于準確定量初始模板數(shù)量既能用于定性，判斷一段DNA序列的有無，也可用于定量，確定起始DNA拷貝數(shù)當前3頁，總共31頁。熒光定量PCR擴增曲線熒光定量PCR擴增曲線并非標準的指數(shù)曲線，而是S形曲線，并可分為反應早期、指數(shù)期和線性期和平臺期。即使是重復實驗，保證各種條件基本一致，最后得到的DNA拷貝數(shù)也有所不同PCR結束后的DNA產(chǎn)物量不能反映起始模板量的真實情況同一樣品盡管平臺期DNA拷貝數(shù)波動很大，但指數(shù)期產(chǎn)物量相同當前4頁，總共31頁。PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號（baseline），熒光信號之后進入指數(shù)增長階段。軟件自動給出，無需手動設置。熒光域值（Threshold）為3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍（或本底的2倍）。軟件自動給出，可手動設置。Ct值：每個反應管內的熒光信號達到熒光域值時所需的循環(huán)數(shù)。熒光域值與Ct值當前5頁，總共31頁。Ct值與DNA模板每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)當前6頁，總共31頁。非特異性熒光標記SYBRGreenI常用熒光標記方法特異性熒光標記TaqManProbe當前7頁，總共31頁。游離狀態(tài)熒光很弱，但與DNA雙鏈結合后熒光強度增加1000倍！其信號強度代表了雙鏈DNA分子（即PCR產(chǎn)物）的數(shù)量SYBRGreenI染料法當前8頁，總共31頁。SYBRGreenI染料法缺點：能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結合，產(chǎn)生假陽性信號，但通過熔解曲線（meltingcurve）的分析，優(yōu)化反應條件加以解決。對引物特異性要求高（關鍵）不能進行多重定量，增加模板使用量優(yōu)點：對DNA模板沒有選擇性，適用于任何DNA使用方便，無需設計復雜探針，檢測方法簡便成本低當前9頁，總共31頁。熔解曲線分析引物二聚體PrimerdimersProductofInterest當前10頁，總共31頁。5’端標記有報告基因（Reporter，R），如FAM、VIC等3’端標記有熒光淬滅集團（Quencher，Q）探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan探針法每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步當前11頁，總共31頁。TaqMan探針法熒光標記物的選擇當前12頁，總共31頁。不同定量方法的比較當前13頁，總共31頁。絕對定量：指的是用已知的標準曲線來推算未知的樣本的量，絕對定量則需要使用標準曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度相對定量：在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的量的變化，相對定量常見于比較兩個樣本中基因表達水平的高低變化定量方法當前14頁，總共31頁。絕對定量當前15頁，總共31頁?？截悢?shù)的計算樣品DNA濃度（ng/μl）=OD260×40×稀釋倍數(shù)樣品分子量=質粒堿基對總數(shù)×660拷貝數(shù)（copies/μl）=樣品DNA濃度/樣品分子量×6.02×1014倍比梯度稀釋方法梯度1：原液（106copies/μl）梯度2：1份原液+9份稀釋緩沖液，105copies/μl梯度3：1份梯度2溶液+9份稀釋緩沖液，104copies/μl梯度4：1份梯度3溶液+9份稀釋緩沖液，103copies/μl梯度5：1份梯度4溶液+9份稀釋緩沖液，102copies/μl梯度6：1份梯度5溶液+9份稀釋緩沖液，10

copies/μl質粒標準品稀釋方法與拷貝數(shù)計算當前16頁，總共31頁。以不同稀釋度的標準品為模板進行定量PCR并獲得對應的CT，即可制作標準曲線標準曲線的繪制當前17頁，總共31頁。標準曲線的繪制以lg（CT）為縱坐標，lg（拷貝數(shù)）為橫坐標，繪制標準曲線擴增效率（E）=（10-1/斜率-1）×100%相關系數(shù)（R2）應大于0.99，越接近1越好E應介于95%與105%，越接近100%越好當前18頁，總共31頁。未知樣品拷貝數(shù)的計算將未知樣品的CT值（y）代入線性方程求得對應的x未知樣品的拷貝數(shù)=10x當前19頁，總共31頁。管家（內參）基因：維持細胞基本代謝活動所必須的基因，不隨外界刺激發(fā)生變化或變化不大常用的有：beta-actin，GAPDH，18SrRNA等原理：以管家基因的表達量為參照，定量目的基因的表達量前提：管家基因與目標基因的擴增效率相似且接近100%方法：2-△△CT（Livak）法用管家基因的CT值歸一目標基因的CT值：

△CT＝目標基因的CT－管家基因的CT

用對照組的△CT值歸一處理組的△CT值：

△△CT＝處理組△CT－對照組△CT相對表達水平比率=2-△△CT（對照組為1）相對定量當前20頁，總共31頁。?CtSample?CtNontreatedsampleHousekeepingGene?Ct?Ct??

Ct2-??

Ct

=ChangeinExpressionLevelGeneofInterest相對定量當前21頁，總共31頁。PCR反應體系以TAKARASYBR?

PremixEx

TaqTMII為例試劑使用量終濃度SYBRPremixEx-Taq(2×)10μL1×PCRForwardPrimer(10μm)0.8μL0.4μmPCRReversePrimer(10μm)0.8μL0.4μmROXReferenceDye(50×)0.41×DNA模板2μLdH2O6μLTotal20μL當前22頁，總共31頁。ABI7500Real-TimePCR System當前23頁，總共31頁。程序的設置（相對定量）背參染料的熒光強度不隨PCR反應變化，用于校正孔與孔之間的熒光干擾或反應體積變化對SYBR?GREEN熒光強度的影響當前24頁，總共31頁。兩步法PCR擴增標準程序染料法的熒光采集step在每個循環(huán)的擴增step后當前25頁，總共31頁。結果的查看當前26頁，總共31頁。數(shù)據(jù)的導出當前27頁，總共31頁。引物的設計NCBIGenbank查詢目的基因mRNA序列根據(jù)mRNA序列中的CDS設計引物要求：17~24個堿基，CG=40~60%,Tm≈60℃引物質量盡可能避免自身及上下游錯配、發(fā)卡結構跨越內含子設計引物Primer-BLAST確認引物的特異性，避免擴增出1000bp以下的非目的產(chǎn)物當前28頁，總共31頁。絕對定量與相對定量的比較方法優(yōu)點缺點適用范圍絕對定量定量準確工作量較大，需額外繪制目標基因的標準曲線所有相對定量工作量較小，直接進行PCR擴展，無需繪制保準曲線需考慮多個因素以保證準確性：所選的管家基因在各樣品中表達水平相近；目標基因和管家基因的擴增效率相似或接近100%擁有管家基因的樣品當前29頁，總共31頁。注意事項操作：取/拿PCR單管/8聯(lián)管/96孔板時，切勿觸碰管蓋或光學貼膜，最好戴一次性手套操作，勿在蓋子或貼膜