第二章色譜法導論

第二章色譜法導論第一頁，共七十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)概述1、色譜法的概念概念色譜法又稱色層法、層析法，是用于多組分有機混合物的一種高效分離技術(shù)。特點選擇性好、分離效能高、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點。先進性已逐步實現(xiàn)儀器化、自動化、高速化，并從分離手段發(fā)展到分析手段，應(yīng)用范圍不斷擴大，分離的對象早已不限于有色物質(zhì)，但“色譜法”這一名稱一直被沿用。范圍色譜法與現(xiàn)代新檢測技術(shù)和計算機技術(shù)相結(jié)合，已廣泛食品質(zhì)量與安全等的有關(guān)工作，如樣品中農(nóng)藥殘留量的測定、農(nóng)副產(chǎn)品分析、食品質(zhì)量檢驗、生物制品的分離制備等。第二頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、色譜法的起源1906年，俄國植物學家茨維特首創(chuàng)了這種分離技術(shù)，他把植物葉綠體色素的石油醚浸漬液倒入一根裝有碳酸鈣吸附劑的細直玻璃柱中，再加入純石油醚，任其自由流下，原混合物開始被分離成不同顏色的譜帶(色素的分離)，且以不同速度通過子，然后按譜帶顏色對混合物進行鑒定分析。茨維特把這種分離結(jié)果稱為色譜圖，把這種分離方法命名為色譜法（chromatography）。此后，出現(xiàn)了種類繁多的各種色譜法。第三頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、色譜法的本質(zhì)色譜法共同的基本特點是具備兩個相：不動的一相，稱為固定相；另一相是攜帶樣品流過固定相的流動體，稱為流動相。當流動相中樣品混合物經(jīng)過固定相時，就會與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。色譜法是基于混合物各組分在兩相(固定相和流動相)之間的不均勻分配進行分離的一種方法。目前色譜法已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，成為十分重要的分離分析手段。許多氣體、液體和固體樣品都能找到合適的色譜法進行分離和分析。第四頁，共七十八頁，2022年，8月28日Temporalcourse色譜分離淋洗液慢中等快第五頁，共七十八頁，2022年，8月28日4、色譜法的分類（1）按兩相狀態(tài)分類氣體為流動相的色譜稱為氣相色譜（GC），氣固色譜（GSC）固定相是固體吸附劑；氣液色譜（GLC）固定相是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機化合物液體）。液體為流動相的色譜稱液相色譜（LC），液固色譜（LSC）；液液色譜（LLC）。超臨界流體為流動相的色譜稱為超臨界流體色譜（SFC）。隨著色譜工作的發(fā)展，通過化學反應(yīng)將固定液鍵合到載體表面，這種化學鍵合固定相的色譜又稱化學鍵合相色譜（CBPC）。第六頁，共七十八頁，2022年，8月28日第七頁，共七十八頁，2022年，8月28日（2）按分離機理分類吸附色譜法：利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強弱不同而得以分離的方法。分配色譜法：利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達到分離的方法。離子交換色譜法：利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達到分離的方法。凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法：利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達到分離的方法。親和色譜法：最近，又有一種新分離技術(shù)，利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進行分離的技術(shù)，常用于蛋白質(zhì)的分離。第八頁，共七十八頁，2022年，8月28日a.吸附色譜法原理:被分離物與吸附劑表面分子相互作用而被吸附，由于不同化合物結(jié)構(gòu)及性質(zhì)上的差異，在吸附劑上的吸附性能是不同的，在色譜分離過程中，用一定的溶劑系統(tǒng)洗脫柱子時，由于溶劑(洗脫劑)與混合物里各組分爭奪吸附劑的活性表面，解吸出來的組分與溶劑始終存在著對吸附劑的競爭吸附，洗脫劑對不同的物質(zhì)的洗脫能力也是不同的。特點:因此吸附與解吸始終貫穿整個色譜過程，吸附與解吸是吸附色譜法的理論基礎(chǔ)。吸附過程無選擇性，吸附與解吸附過程可逆，但吸附強弱和先后順序都基本遵循“相似相吸附”的經(jīng)驗規(guī)律。吸附力最弱的組分隨溶劑首先流出。常用極性吸附劑:硅膠、氧化鋁、聚酰胺。第九頁，共七十八頁，2022年，8月28日第十頁，共七十八頁，2022年，8月28日b.分配色譜原理:將兩相溶劑中的一相涂覆在硅膠等載體上作為固定相，再用與固定相不相混溶的另一相溶劑作為流動相，物質(zhì)可在兩相溶劑相對做逆流移動過程中不斷進行動態(tài)分配而得以分離。分類:

正相色譜：固定相采用強極性溶劑，如水、緩沖溶液等，流動相則用氯仿等弱極性溶劑，稱之為正相(normalphase)色譜；反相色譜：以弱極性成分如石蠟油為固定相，流動相則以水、乙腈、甲醇強極性溶劑，則兩相可以顛倒，稱之為反相(reversephase)色譜，更適合于水溶性成分的分離。液—液分配色譜的分離條件可以基于相應(yīng)的正相及反相分配薄層層析結(jié)果加以選定。第十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日c.離子交換色譜原理:以離子交換樹脂或表面涂有液體離子交換樹脂的固體顆粒為固定相，裝在柱中，以水或含水溶劑為流動相，使樣品溶液流過交換柱，溶液中的中性分子及具有與離子交換樹脂可交換基團相反電荷的離子通過柱子從柱底流出，而具有相同電荷的離子則與樹脂上的交換基團進行離子交換并被吸附到柱上。規(guī)律：由于不同離子與同一樹脂交換能力不同，移動速度也不同，在柱上形成色譜帶，另選一適當?shù)南疵搫?含有比吸附物質(zhì)更活潑的離子)進行洗脫交換，可將吸附物質(zhì)按先后順序從柱上洗脫下來，即可實現(xiàn)不同組分物質(zhì)的分離。范圍：主要用于分離氨基酸，生物堿，糖類化合物。

第十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日d.凝膠色譜法原理:也叫分子篩過濾，利用分子篩分離物質(zhì)的一種方法。所用載體，如葡聚糖凝膠，是不溶于水，但可在水中膨脹的球形顆粒，具有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當在水中充分膨脹后裝入層析柱中。加入樣品，用同一溶劑洗脫時，由于凝膠網(wǎng)孔半徑的限制，大分子將不能滲入凝膠顆粒內(nèi)部(即被排阻在凝膠顆粒外部)，所以在顆粒間隙移動，并隨溶劑一起從柱底先流出，小分子因可自由滲入并擴散到凝膠顆粒內(nèi)部，故通過層析柱時阻力增大、流速變緩，較晚流出。分類:

(1)葡聚糖凝膠(2)羥丙基葡聚糖凝膠(SephadexLH-20)。第十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日過程:樣品混合物中各個成分因分子大小各異，滲入至凝膠顆粒內(nèi)部的程度也不盡相同，故在經(jīng)歷一段時間流動并達到動態(tài)平衡，即按分子由大到小次序先后流出并得到分離。第十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日e.親和色譜第十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日(3)按固定相的外形分類固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為柱色譜。固定相呈平板狀的色譜法，稱為平板色譜，它又可分為薄層色譜和紙色譜。根據(jù)以上所述，將色譜法的分類總結(jié)于下表中。第十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日第十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語1、色譜流出曲線和色譜峰樣品各組分在色譜柱中得到分離后隨流動相依次流出色譜柱，先后到達檢測器。經(jīng)檢測器把各組分的濃度信號轉(zhuǎn)變成電信號，然后用記錄儀或工作站軟件將組分的信號記錄下來，這種組分響應(yīng)信號大小隨時間變化所記錄下來的曲線稱為色譜流出曲線，也叫做色譜圖。第十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日色譜圖中曲線突起的部分稱為色譜峰，由于響應(yīng)信號的大小或強度與物質(zhì)的量或物質(zhì)的濃度成正比，色譜流出曲線實際上是物質(zhì)的量或濃度—時間曲線。第十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日

如果進樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線的線性范圍內(nèi)，色譜峰如果對稱，可用Gauss正態(tài)分布函數(shù)表示：式中：C—不同時間t時某物質(zhì)在柱出口處的濃度，C0—進樣濃度，tr—保留時間，σ—標準偏差。第二十頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、基線在實驗操作條件下，柱中僅有流動相通過時，檢測器響應(yīng)訊號的記錄值，即圖中O-t線。它應(yīng)該是一條直線，若是斜線就稱為基線漂移，如果基線出現(xiàn)上下波動則稱為噪聲。保持基線平穩(wěn)，是進行色譜分析的最基本要求。3、峰高色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以h表示，如圖中B′A。是色譜定量分析的依據(jù)之一。第二十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日4、保留值(retentionvalue)（1）死時間tm不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積，如圖中O′A′。因為這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與流動相的流動速度相近．測定流動相平均線速ū時，可用往長L與tm的比值計算。第二十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日（2）保留時間tR試樣從進樣開始到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)歷的時間，稱為保留時間，如圖中的O′B．它相應(yīng)于樣品到達柱末端的檢測器所需的時間．第二十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日（3）調(diào)整保留時間tR′

某組份的保留時間扣除死時間后稱為該組份的調(diào)整保留時間，即

tR′=tR-tm由于組份在色譜柱中的保留時間tR包含了組份隨流動相通過柱子所需的時間和組份在固定相中滯留所需的時間，所以tR實際上是組份在固定相中停留的總時間。保留時間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組份的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積等參數(shù)進行定性檢定．第二十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日（4）死體積Vm指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和．當后兩項很小而可忽略不計時，死體積可由死時間與流動相體積流速F0（mL／min）計算：Vm=tmF0(5)保留體積VR指從進樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。保留時間與保留體積的關(guān)系：VR=tR·F0第二十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日（6）調(diào)整保留體積VR′某組分的保留體積扣除死體積后，為該組分的調(diào)整保留體積VR′=VR-Vm(7)相對保留值r2.1某組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比，稱為相對保留值：由于相對保留值只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此，它是色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛使用的定性數(shù)據(jù)。必須注意，相對保留值絕對不是兩個組份保留時間或保留體積之比。第二十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日5、選擇因子在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標準（s），然后再求其它峰（i）對這個峰的相對保留值。此時，ri/s可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常選擇一對最難分離的物質(zhì)對，將它們的相對保留值作為重要參數(shù)。在這種特殊情況下，可用符號α表示：式中，tr′(i)為后出峰的調(diào)整保留時間，所以這時α總是大于1的。相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標，又稱選擇因子。第二十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日6、區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動力學因素。度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法：a.標準偏差σ

即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半，如圖中EF距離的一半。b.半峰寬W1/2即峰高一半處對應(yīng)的峰寬，如圖中GH間的距離．它與標準偏差σ的關(guān)系是：W1/2=2.354σc.峰底寬度W即色譜峰兩側(cè)拐點上的切線在基線上的截距，如圖中IJ的距離。它與標準偏差σ的關(guān)系是：W=4σ

在相同的色譜操作條件下獲得色譜峰的區(qū)域?qū)挾戎翟叫。f明色譜柱的分離效能越好，柱效越高。第二十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日7.峰面積由色譜峰與基線之間所圍成的面積稱為峰面積，用“A”表示，是色譜定量分析的基本依據(jù)，對理想的對稱峰，峰面積與峰高，半峰寬的關(guān)系為A=1.065h

×W1/2。第二十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日一組分的色譜流出曲線對色譜分析十分重要，從色譜圖上可以獲得以下信息：（l）根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所合組份的最少個數(shù)。（2）根據(jù)色譜峰的保留值(或位置），可以進行定性分析。(3)根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進行定量分析。（4）色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u價色譜柱分離效能的依據(jù)。（5）色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(和流動相)選擇是否合適的依據(jù)。第三十頁，共七十八頁，2022年，8月28日第三節(jié)色譜法基本原理色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離。組分要達到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學性質(zhì)有關(guān)。兩組分分配系數(shù)相差越大，兩色譜峰間的距離就越大。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學和動力學兩方面來研究色譜行為。色譜分析的基本理論有兩個：一個是以熱力學平衡為基礎(chǔ)的塔板理論；另一個是以動力學為基礎(chǔ)的速率理論，兩個理論相輔相成，較為滿意地揭示了色譜分析中的有關(guān)問題和現(xiàn)象。第三十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日1、分配系數(shù)K和分配比k（1）分配系數(shù)K分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復(fù)多次地分配過程，而吸附色譜的分離是基于反復(fù)多次地吸附一脫附過程。這種分離過程經(jīng)常用樣品分子在兩相間的分配來描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)K。它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值，即分配系數(shù)是由組分和兩相的熱力學性質(zhì)決定的。第三十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日例：逆流分配色譜取一系列試管，向1號管加入互不相溶的兩種溶劑，A溶劑為上相（動相），B溶劑為下相（靜相），體積相等。加入物質(zhì)Y（K=1）和物質(zhì)Z（K=1/3）的混合物，各組分物質(zhì)將按自己的分配系數(shù)在上下相中進行分配。平衡后，將上相轉(zhuǎn)移到2號管內(nèi)，其中含有相同體積的新下相，從1號轉(zhuǎn)移來的樣品將在2號管的上下相中再分配。與此同時，向1號管內(nèi)加入新的上相，這里也將發(fā)生樣品的再分配?！ぁぁぁぁぁぁさ谌摚财呤隧?，2022年，8月28日第三十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日第三十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日分配系數(shù)小的物質(zhì)Z沿一系列分溶管的“移動”速度比分配系數(shù)大的物質(zhì)Y快。那么它流出色譜柱。每一種物質(zhì)在一系列分溶管中是相當集中的，分溶曲線呈峰形，只要使用足夠數(shù)目的分溶管，繼續(xù)進行分配，就可以使兩峰彼此分來。一定量的某一溶質(zhì)在一定量的溶劑系統(tǒng)中分配時，轉(zhuǎn)移次數(shù)越多，即分溶管數(shù)越多，其分溶曲線越集中，即峰形窄而高，有利于各物質(zhì)的完全分離。第三十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日（2）分配比k分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比。即

k值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當于柱的容量大，因此又稱分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數(shù)。k值也決定于組分及固定相熱力學性質(zhì)。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動相及固定相的體積有關(guān)。第三十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日滯留因子Rs分配比k值可直接從色譜圖測得。設(shè)流動相在柱內(nèi)的線速度為u，組分在柱內(nèi)線速度為us，由于固定相對組分有保留作用，所以us＜u．此兩速度之比稱為滯留因子Rs。它反映了組分在流動相中的分配比例數(shù)。例如，某組分完全不被固定相滯留，即該組分100％分配在流動相中。第三十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日(3)分配系數(shù)K與分配比k的關(guān)系其中β稱為相比率，它是反映各種色譜柱型特點的又一個參數(shù)。例如，對填充柱，其β值一般為6～35；對毛細管柱，其β值為60～600。Cs，Cm分別為組分在固定相和流動相中的濃度；Vm為柱中流動相的體積，近似等于死體積；Vs為柱中固定相的體積。第三十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日(4)分配系數(shù)K及分配比k與選擇因子α的關(guān)系對A、B兩組分的選擇因子，用下式表示：上式表明：通過選擇因子α把實驗測量值k與熱力學性質(zhì)的分配系數(shù)K直接聯(lián)系起來，α對固定相的選擇具有實際意義。如果兩組分的K或k值相等，則α=1，兩個組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。

第四十頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、踏板理論最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個精餾塔，柱內(nèi)由許多想像的塔板組成,沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標。第四十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日該理論假定：

（i）在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度H。（ii）以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連續(xù)進行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積（ΔVm）。（iii）所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。（iv）分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。為簡單起見，設(shè)色譜往由5塊塔板（n=5，n為柱子的塔板數(shù)）組成，并以r表示塔板編號，r=1，2…，n-l；某組分的分配比k=1。第四十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日

根據(jù)上述假定，在色譜分離過程中，該組分的分布可計算如下：開始時，若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1μg）的該組分加到第0號塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ms=mm故mm=ms=0.5。當一個板體積（lΔV）的載氣以脈動形式進入0號板時，就將氣相中含有mm部分組分的載氣頂?shù)?號板上，此時0號板液相（或固相）中ms部分組分及1號板氣相中的nm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號板上所含組分總量為0.5，其中氣液（或氣固）兩相各為0.25，而1號板上所含總量同樣為0.5，氣液（或氣固）相亦各為0.25。塔板號r0123進樣mm0.5ms0.5進氣1ΔVmm0.250.25ms0.250.25進氣2ΔVmm0.1250.250.125ms0.1250.250.125進氣3ΔVmm0.0630.1880.1880.063ms0.0630.1880.1880.063第四十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日按上述分配過程，對于n=5，k=1，m=1的體系，隨著脈動進入柱中板體積載氣的增加，組分分布在柱內(nèi)任一板上的總量（氣液兩相中的總質(zhì)量）見表：第四十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日經(jīng)N次轉(zhuǎn)移后，在各塔板上組分含量的分布符合（ms+mm）N的二項式展開式。如N=4、k=1時，展開式為：ms4+4ms3mm+6ms2mm2+4msmm3+mm4對于各塔板上組分分布計算得到：0.063，0.25，0.375，0.25，0.063，由二項式展開的值與上表相一致。

如果色譜柱的塔板數(shù)n大于50，組分在柱內(nèi)就可得到較多次的平衡分配，如果以組分流出色譜柱的濃度或量為縱坐標對相應(yīng)的流出時間，作圖，所得到的色譜流出曲線趨于正態(tài)分布。此時，進入色譜柱的流動相塔板體積數(shù)N已足夠大，二項式分布完全可以用正態(tài)分布來表示。第四十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日由塔板理論的流出曲線方程可導出理論塔板數(shù)n與色譜峰底寬度的關(guān)系。根據(jù)流出曲線的正態(tài)分布方程，可有另一表達式：m為組分質(zhì)量，Vr為保留體積，n為理論塔板數(shù)。當V=Vr時，C值最大，即第四十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日由流出曲線方程可推出n與保留時間tr、半峰寬W1/2、峰底寬W的關(guān)系：從而求得理論塔板高度H，即：L為色譜柱的長度第四十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日從上兩式可以看出，色譜峰W越窄，塔板數(shù)n就越多，而理論塔板高度H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標。通常填充色譜柱的n＞103，H＜1mm。而毛細管柱n=105--106，H＜0.5mm。由于死時tm包括在tr中,而實際的tm不參與柱內(nèi)分配,所計算的n值盡管很大，H很小,但與實際柱效能相差甚遠。所以，提出把tm扣除，采用有效理論塔板數(shù)neff和有效塔板高Heff評價柱效能。第四十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日塔板理論用熱力學觀點形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中的分配平衡和分離過程，導出流出曲線的數(shù)學模型，并成功地解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，還提出了計算和評價柱效的參數(shù)。但由于它的某些基本假設(shè)并不完全符合柱內(nèi)實際發(fā)生的分離過程，例如，縱向擴散是不能忽略的。它也沒有考慮各種動力學因素對色譜柱內(nèi)傳質(zhì)過程的影響，因此它不能解釋造成譜帶擴張的原因和影響板高的各種因素，也不能說明為什么在不同流速下可以測得不同的理論塔板數(shù)，這就限制了它的應(yīng)用。第四十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、速率理論1956年荷蘭學者vanDeemter等在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學理論——速率理論。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程，從而在動力學基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、液相色譜都適用。vanDeemter方程的數(shù)學簡化式為：式中u為流動相的線速度；A，B，C為常數(shù)，分別代表渦流擴散項系數(shù)、分子擴散項系數(shù)、傳質(zhì)阻力項系數(shù)。第五十頁，共七十八頁，2022年，8月28日(1)渦流擴散項在填充色譜柱中，當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似“渦流”的流動，故稱渦流擴散，形象地如圖所示。

第五十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日由于填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長短不一，因而同時進色譜柱的相同組分到達柱出口的時間并不一致，引起色譜峰的變寬。色譜峰變寬的程度由下式?jīng)Q定：A＝2λdp上式表明，A與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子λ有關(guān)，與流動相的性質(zhì)、線速變和組分性質(zhì)無關(guān)。為了減少渦流擴散，提高柱效，使用細而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對于空心毛細管，不存在渦流擴散，因此A＝0。第五十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日（2）分子擴散項B/u（縱向擴散項）縱向分子擴散是由濃度梯度造成的。組分從柱人口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。如圖所示。它隨著流動相向前推進，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)地向前和向后擴散，造成譜帶展寬。第五十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日分子擴散項系數(shù)為B＝2γDg式中γ是填充柱內(nèi)流動相擴散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況。Dg為組分在流動相中擴散系數(shù)（cm2·s-1）。另外，縱向擴散與組分在色譜柱內(nèi)停留時間有關(guān)，流動相流速小，組分停留時間長，縱向擴散就大。因此，為降低縱向擴散影響，要加大流動相流速。對于液相色譜，組分在流動相中的縱向擴散可以忽略。第五十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日（3）傳質(zhì)阻力項Cu由于氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，它們的傳質(zhì)過程不完全相同，現(xiàn)分別討論。a.氣相色譜對于氣液色譜，傳質(zhì)阻力系數(shù)C包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg和液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl兩項，即C＝Cg＋Cl第五十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日氣相傳質(zhì)過程是指試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程。這一過程中試樣組分將在兩相間進行質(zhì)量交換，即進行濃度分配。有的分子還來不及進入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進人兩相界面又來不及返回氣相。這樣，使得試樣在兩相界面上不能瞬間達到分配平衡，引起滯后現(xiàn)象，從而使色譜峰變寬。對于填充柱，氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg為：式中k為容量因子。由上式看出，氣相傳質(zhì)阻力與填充物粒度dp的平方成正比、與組分在載氣流中的擴散系數(shù)Dg成反比。第五十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日液相傳質(zhì)過程是指組分從固定相的氣-液界面移動到液相內(nèi)部，并發(fā)生質(zhì)量交換，達到分配平衡，然后又返回氣-液界面的傳質(zhì)過程。此時氣相中組分的其他分子仍隨載氣不斷向柱出口運動，于是造成峰形擴張。液相傳質(zhì)阻力系數(shù)C1為：由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴散系數(shù)D1大，則液相傳質(zhì)阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值隨之變小，又會使C1增大。當固定液含量一定時，液膜厚度隨載體的比表面積增加而降低，因此，一般采用比表面積較大的載體來降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分離。雖然提高柱溫可增大Dl，但會使k值減小，為了保持適當?shù)腃l值，應(yīng)控制適宜的柱溫。

第五十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日將上面式總結(jié)，即可得氣液色譜速率板高方程這一方程對選擇色譜分離條件具有實際指導意義，它指出了色譜柱填充的均勻程度，填料顆粒的大小，流動相的種類及流速，固定相的液膜厚度等對柱效的影響。第五十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日b.液相色譜對于液液分配色譜，傳質(zhì)阻力系數(shù)（C）包含流動相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cm）和固定相傳質(zhì)系數(shù)（Cs），即:C＝Cm＋Cs其中Cm又包含流動的流動相中的傳質(zhì)阻力和滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力，即:

式中右邊第一項為流動的流動相中的傳質(zhì)阻力。當流動相流過色譜柱內(nèi)的填充物時，靠近填充物顆粒的流動相流速比在流路中間的稍慢一些，故柱內(nèi)流動相的流速是不均勻。ωm是由柱和填充的性質(zhì)決定的因子。第五十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日第六十頁，共七十八頁，2022年，8月28日右邊第二項為滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力。這是由于固定相的多孔性，會造成某部分流動相滯留在一個局部，滯留在固定相微孔內(nèi)的流動相一般是停滯不動的。流動相中的試樣分子要與固定相進行質(zhì)量交換，必須首先擴散到滯留區(qū)。如果固定相的微孔既小又深，傳質(zhì)速率就慢，對峰的擴展影響就大。ωsm是一系數(shù)，它與顆粒微孔中被流動相所占據(jù)部分的分數(shù)及容量因子有關(guān)。液液色譜中固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cs）可用下式表示：第六十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日綜上所述，對液液色譜的VanDeemter方程式可表達為：

該式與氣液色譜速率方程的形式基本一致，主要區(qū)別在液液色譜中縱向擴散項可忽略不計，影響柱效的主要因素是傳質(zhì)阻力項。第六十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日（4）流動相線速率對板高的影響a.LC和GC的H-u圖表明，對于一定長度的柱子，柱效越高，理論塔板數(shù)越大，板高越小。但究竟控制怎樣的線速度，才能達到最小板高呢？根據(jù)vanDeemter公式分別作LC和GC的H-u圖，見圖（a）和（b）。由圖（a）和（b）不難看出：LC和GC的H-u圖十分相似，對應(yīng)某一流速都有一個板高的極小值，這個極小值就是柱效最高點；LC板高極小值比GC的極小值小一個數(shù)量級以上，說明液相色譜的柱效比氣相色譜高得；LC的板高最低點相應(yīng)流速比起GC的流速亦小一個數(shù)量級，說明對于LC來說，為了取得良好的柱效，流速不一定要很高。

第六十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日b.分子擴散項和傳質(zhì)阻力項對板高的貢獻第六十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日（5）固定相粒度大小對板高的影響固定相粒度對板高的影響是至關(guān)重要的。實驗表明不同粒度，H-u曲線也不同（如圖）：粒度越細，板高越小，并且受線速度影響亦小。這就是為什么在HPLC中采用細顆粒作固定相的根據(jù)。當然，固定相顆粒愈細，柱流速愈慢。只有采取高壓技術(shù)，流動相流速才能符合實驗要求。第六十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日4、分離度右圖說明了柱效和選擇性對分離的影響。圖中（a）兩色譜峰距離近并且峰形寬。兩峰嚴重相疊，這表示選擇性和柱效都很差。圖中（b）雖然兩峰距離拉開了，但峰形仍很寬，說明選擇性好，但柱效低。圖中（c）分離最理想，說明選擇性好，柱效也高。

第六十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日由此可見，單獨用柱效或選擇性不能真實反映組分在色譜柱中分離情況，故需引人一個綜合性指標——分離度R。分離度是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標，稱總分離效能指標。分離度又叫分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。一般說，當R＜1時，兩峰有部分重疊；當R＝1時，分離程度可達98％；當R＝1．5時，分離程度可達99．7％。通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。第六十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日下圖表示了不同分離度時色譜峰分離的程度。第六十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日5、基本色譜方程分離度R的定義并沒有反映影響分離度的諸因素。實際上，分離度受柱效（n）、選擇因子(α)和容量因子（k）三個參數(shù)的控制。對于難分離物質(zhì)對，由于它們的分配系數(shù)差別小，可合理地假設(shè)k1