實驗 細菌的培養(yǎng)方法

1.實驗室規(guī)則2．錄相：細菌標(biāo)本的采集和細菌的接種方法3．操作：⑴細菌的接種法（液體、半固體、固體1套/3人）⑵空氣中細菌的檢查（沉降法血平板1塊/6人）⑶呼吸道細菌的檢查（咳碟培養(yǎng)血平板1塊/3人）⑷隨身物品的細菌檢查（普通平板1塊/3人）4.材料：⑴大腸桿菌斜面培養(yǎng)物（1支/6人）⑵碘酒、75%酒精、棉簽等（1套/6人）

實驗內(nèi)容當(dāng)前1頁，總共38頁。教學(xué)目標(biāo)了解：培養(yǎng)基的類型與制備方法；細菌菌落的觀察常用的細菌接種方法和各種細菌的培養(yǎng)方法掌握：

1.細菌的液體、半固體、固體接種

2.空氣中細菌的檢查方法——沉降法

3.呼吸道細菌的檢查法——咳碟法

4.隨身物品的細菌檢查方法當(dāng)前2頁，總共38頁。實驗室規(guī)則1.穿白大褂，盡量少帶物件進實驗室。2.嚴格按老師及教材要求進行實驗，以獲得正確結(jié)果。3.書、筆記本、筆等文具放入實驗臺抽屜里。4.嚴禁在實驗室喝水，吃東西，用嘴咬筆或標(biāo)簽，不要用手撫摸頭、臉等部位，以免發(fā)生感染。

微生物學(xué)實驗的對象多為病原微生物，如有不慎就會發(fā)生實驗室感染。當(dāng)前3頁，總共38頁。5.實驗室不得高聲喧嘩，保持安靜，守秩序，不要隨便走動，以免影響他人實驗和安全。6.如果發(fā)生實驗室不慎，吸入菌液、劃破手指、培養(yǎng)物破損傳染物外溢，應(yīng)及時報告，及時處理。7.實驗過程中應(yīng)注意節(jié)約實驗材料、愛護儀器，損壞器材要及時報告、登記、并作相應(yīng)的賠償。實驗室內(nèi)物品，未經(jīng)老師許可，嚴禁帶出室外。當(dāng)前4頁，總共38頁。8.每次實驗之后，所用物品放回原處。需要培養(yǎng)或消毒處理的物品及時送到指定地點，用過的涂菌載玻片放入小桶內(nèi)，不得亂丟亂放。9.實驗完畢，整理桌面，肥皂洗手，值日生打掃實驗室衛(wèi)生，關(guān)好水電門窗，待老師檢查后方可離開。當(dāng)前5頁，總共38頁。

細菌和其它生物一樣，大多數(shù)屬異養(yǎng)菌，必須從周圍環(huán)境中攝取營養(yǎng)，進行新陳代謝及生長繁殖等生命活動。人為地提供細菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)（適宜的培養(yǎng)基）和創(chuàng)造適合細菌生長繁殖的有利條件如溫度、濕度、氣體等，能使細菌在體外迅速生長繁殖。細菌的人工培養(yǎng)當(dāng)前6頁，總共38頁。細菌生長繁殖的條件：1．充足的營養(yǎng)物質(zhì)2．適宜的溫度3．合適的酸堿度（pH）4．必要的氣體環(huán)境當(dāng)前7頁，總共38頁。一、細菌生長繁殖所需營養(yǎng)

1．水

營養(yǎng)的吸收與代謝均需有水才能進行。2．碳源病原菌主要從糖類獲得碳及能量。

4．無機鹽

常用元素如磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣、鐵等3．氮源其主要功能是作為菌體成分的原料。5．生長因子

某些細菌生長所必需而又不能自身合成的有機化合物。當(dāng)前8頁，總共38頁。（一）培養(yǎng)基（culturemedium）

由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。培養(yǎng)基的制備當(dāng)前9頁，總共38頁。（1）按用途劃分1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基含多數(shù)細菌生長所需要的最基本營養(yǎng)，能滿足一般細菌生長繁殖的營養(yǎng)需要，如肉湯（含有水、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等原料）。2）營養(yǎng)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、酵母浸膏等。1、培養(yǎng)基的類型及應(yīng)用當(dāng)前10頁，總共38頁。3）鑒別培養(yǎng)基4）選擇培養(yǎng)基

在培養(yǎng)基中加入一定底物和指示劑，而不同種類的細菌由于分解代謝及合成代謝能力的不同，會產(chǎn)生不同的特征性培養(yǎng)結(jié)果，從而將不同細菌區(qū)分開來的培養(yǎng)基。

在培養(yǎng)基中加入某些特殊的營養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，使之能抑制一些細菌生長，而有利于另一些細菌生長，從而將后者從混雜的細菌群體中分離出來的培養(yǎng)基。當(dāng)前11頁，總共38頁。SS瓊脂培養(yǎng)基（Salmonella-Shigellaagar）

大腸埃希菌沙門菌志賀菌當(dāng)前12頁，總共38頁。5）厭氧培養(yǎng)基

用于培養(yǎng)厭氧性細菌的培養(yǎng)基，此時需要在培養(yǎng)基中加入還原劑降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢，厭氧菌才能生長發(fā)育。

皰肉培養(yǎng)基

——不飽和脂肪酸和谷胱甘肽當(dāng)前13頁，總共38頁。（2）根據(jù)物理狀態(tài)分液體培養(yǎng)基：增菌固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為1.5％）：分離培養(yǎng)半固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為0.5%）：動力檢查

液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基當(dāng)前14頁，總共38頁。嗜冷菌（10-20℃）嗜溫菌（20-40℃）：絕大多數(shù)病原菌嗜熱菌（50-60℃）二、適宜的溫度當(dāng)前15頁，總共38頁。嗜中性菌（pH6.0-8.0）嗜酸性菌（pH<5.5）嗜堿性菌（pH>8.5）多數(shù)病原菌最適酸堿度為pH7.2-7.6霍亂弧菌耐堿(pH8.4-9.2)結(jié)核分枝桿菌耐酸(pH6.5-6.8)三、適宜的酸堿度（pH）當(dāng)前16頁，總共38頁。氧和二氧化碳1、按細菌對氧的需求可分為四種類型：

專性需氧菌（obligateaerobe）

兼性厭氧菌（facultativeanaerobe）

微需氧菌（microaerophilicbacterium）

專性厭氧菌（obligateanaerobe）四、適宜的氣體環(huán)境當(dāng)前17頁，總共38頁。2、細菌的二氧化碳培養(yǎng)法燭缸法二氧化碳孵箱

某些細菌（腦膜炎雙球菌、淋球雙球菌、布氏桿菌等少數(shù)細菌）的生長，需在孵育時加入5-10%CO2示教當(dāng)前18頁，總共38頁。1.細菌的接種法：液體、半固體、固體培養(yǎng)基2.空氣中細菌的檢查（沉降法，血平板）3.呼吸道細菌的檢查（咳碟培養(yǎng)，血平板）4.隨身物品細菌檢查（普通平板）操作內(nèi)容當(dāng)前19頁，總共38頁。

細菌的分離接種是人工分離培養(yǎng)細菌的重要步驟，是微生物學(xué)的基本技術(shù)之一，其目的是從含多種細菌的患者標(biāo)本中分離出單一病原菌，從而可以進行感染性疾病的病原學(xué)診斷。同時，在細菌學(xué)的研究，生物制品如疫苗、類毒素、抗毒素和免疫血清等的制備，基因工程及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面，人工培養(yǎng)分離細菌，都有著極為重要的意義。

操作一細菌的接種法當(dāng)前20頁，總共38頁。瓊脂平板劃線分離接種法（固體培養(yǎng)基）劃線法斜面培養(yǎng)基接種法（蛇形劃線法）半固體培養(yǎng)基接種法（穿刺法）液體培養(yǎng)基接種法（乳磨法）

接種時要注意無菌操作，避免污染，也要防止細菌外溢污染環(huán)境。細菌的分離接種方法當(dāng)前21頁，總共38頁。固體平板培養(yǎng)基的劃線接種三線法當(dāng)前22頁，總共38頁。劃線接種手法當(dāng)前23頁，總共38頁。平板劃線接種的結(jié)果——菌落觀察1．固體平板培養(yǎng)結(jié)果觀察單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面生長、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可見的有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的細菌集團，稱為菌落（colony）。菌落特征是鑒別細菌的重要依據(jù)之一。當(dāng)前24頁，總共38頁。肺炎克雷伯菌奇異變形桿菌菌落形態(tài)鏈球菌當(dāng)前25頁，總共38頁。斜面培養(yǎng)基接種——蛇形劃線當(dāng)前26頁，總共38頁。半固體培養(yǎng)基的穿刺接種及結(jié)果觀察當(dāng)前27頁，總共38頁。液體培養(yǎng)基的乳磨接種手法當(dāng)前28頁，總共38頁。液體培養(yǎng)結(jié)果觀察表面生長

沉淀生長

混濁生長

當(dāng)前29頁，總共38頁。

空氣中沒有營養(yǎng)物質(zhì)，且受日光中紫外線的作用，細菌一般不能繁殖。然而，土壤中有大量的細菌存在，可隨塵埃散布到空氣中；寄生在人和動物呼吸道及消化道中的細菌也能通過各種途徑散布到空氣中，使得空氣中也有一定量的細菌存在?？諝庵屑毦臄?shù)量和種類隨地區(qū)、季節(jié)和人口密度的不同而不同。通常，可測定單位體積空氣中所含細菌的數(shù)量來評價空氣的污染程度。操作二空氣中細菌的檢查當(dāng)前30頁，總共38頁。

沉降法是利用含有細菌的塵?；驓馊苣z粒因重力作用自然下降到培養(yǎng)基表面，通過細菌培養(yǎng)，計數(shù)菌落數(shù)，粗略評估空氣中細菌含量。

沉降法簡單易行，缺點是不夠準確。但它客觀地反映了空氣污染的程度和衛(wèi)生通風(fēng)狀況，對手術(shù)室、食品業(yè)等有重要的參考意義，是判斷空氣污染的指標(biāo)之一。當(dāng)前31頁，總共38頁。操作：將血平板打開蓋，放到教室的四個角上，靜止15分鐘后，合上蓋送37℃孵箱培養(yǎng)。

據(jù)推算，每100cm2培養(yǎng)基在空氣中暴露5min，其表面接受自然沉降的細菌數(shù)約相當(dāng)于10升空氣中所含的細菌量。那么，暴露于空氣中15min應(yīng)相當(dāng)于30升，所以，每m3空氣中活菌數(shù)=（100cm2培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)/30）x1000注意：計數(shù)菌落時，兩個或幾個菌落邊緣有重疊者，均分別計算為兩個或幾個。當(dāng)前32頁，總共38頁。

人體呼吸道與外界相通，常常有不同種類的細菌存在。其中，1/4為需氧菌，3/4為厭氧菌。這些細菌常是條件致病菌，在一般情況下并不致病。有時，正常人的呼吸道中也有致病菌的存在，如肺炎球菌、腦膜炎球菌、乙型鏈球菌、流感桿菌等，是引起疾病傳播的一個重要因素。由于寄居人體的關(guān)系，這些細菌對營養(yǎng)的要求較高，常需要用含血液成分的培養(yǎng)基進行分離。操作三呼吸道細菌的檢查—咳碟試驗當(dāng)前33頁，總共38頁。操作方法：打開血平板，將平板置于口腔前約15cm處，對準培養(yǎng)基表面用力咳嗽3～4次，然后蓋好平板蓋，放置于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：平板上可有不同的菌落長出，觀察菌落的形態(tài)、大小及溶血現(xiàn)象。當(dāng)前34頁，總共38頁。

人體的皮膚表面有多種細菌存在，用水洗手或用肥皂洗手，可以除去皮膚上的污垢和灰塵，從而減少手上細菌數(shù)量，但并不能有效的殺死細菌。日常醫(yī)療、試驗工作中常用的化學(xué)消毒劑如碘酒、酒精等有很好的殺菌作用，在臨床醫(yī)療中廣泛應(yīng)用。操作四正常人體皮膚及隨身物品的細菌檢查當(dāng)前35頁，總共38頁。1、在平板底部用筆劃分8個區(qū)，分別標(biāo)記為①②③④⑤⑥⑦⑧。2、用右手食指在①區(qū)上輕輕按一