微生物學(xué)第五章 微生物的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)

微生物的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)第五章5．1

微生物的營(yíng)養(yǎng)

營(yíng)養(yǎng)素:

指具有營(yíng)養(yǎng)功能的物質(zhì)。在微生物學(xué)中，還包括光能這種非物質(zhì)形式的能源在內(nèi)。通過(guò)新陳代謝，微生物與外部環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)和能量交換，從環(huán)境中獲得各種物質(zhì)以合成細(xì)胞物質(zhì)。微生物的營(yíng)養(yǎng)物可為它們正常生命活動(dòng)提供結(jié)構(gòu)物質(zhì)、能量、代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)和良好的生理環(huán)境。

22023/3/28微生物的六種營(yíng)養(yǎng)要素：

碳源氮源能源生長(zhǎng)因子無(wú)機(jī)鹽水5.1.1微生物的六大營(yíng)養(yǎng)素32023/3/28(1)碳源定義：凡能夠提供微生物營(yíng)養(yǎng)所需碳元素的營(yíng)養(yǎng)源?？稍谖⑸矬w內(nèi)通過(guò)一系列復(fù)雜的化學(xué)變化合成細(xì)胞物質(zhì)。并為機(jī)體提供生理活動(dòng)所需要能量。異養(yǎng)微生物：凡必需利用有機(jī)碳源的微生物。自養(yǎng)微生物：凡能利用無(wú)機(jī)碳源的微生物。對(duì)異養(yǎng)微生物來(lái)說(shuō)，它的碳源同時(shí)又可作能源。42023/3/28碳源種類(lèi)：有機(jī)碳源、無(wú)機(jī)碳源碳源來(lái)源：糖類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和脂類(lèi)等。碳源利用效果：?jiǎn)翁?gt;雙糖>己糖>戊糖>淀粉>纖維素微生物發(fā)酵工業(yè)所利用物質(zhì)：葡萄糖、糖蜜（制糖工業(yè)副產(chǎn)物）、淀粉（玉米、土豆、大米、山芋等）、纖維素52023/3/28(2)氮源定義：凡能提供微生物生長(zhǎng)繁殖所需要氮元素的營(yíng)養(yǎng)源。氮源種類(lèi)：

①空氣中分子態(tài)的氮，只有少數(shù)具有固氮能力的微生物能利用。

②無(wú)機(jī)氮化合物（如銨態(tài)氮、硝態(tài)氮）和簡(jiǎn)單有機(jī)氮化物（如尿素），大多數(shù)微生物都能利用。62023/3/28③有機(jī)氮化合物，大多數(shù)寄生性微生物和一部分腐生性微生物需要其為必須氮素營(yíng)養(yǎng)，這類(lèi)微生物可稱“氨基酸異養(yǎng)型微生物”。所有的動(dòng)物和大量的異養(yǎng)微生物是氨基酸異養(yǎng)型生物；所有的綠色植物和很多的微生物都是氨基酸自養(yǎng)型生物。72023/3/28常見(jiàn)氮源來(lái)源：

銨鹽、硝酸鹽、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、魚(yú)粉、血粉等以及豆餅粉、花生餅粉等。氮源利用效果：

（N、C、H、O）或（N、C、H、O、X）類(lèi)。優(yōu)于（N、O）類(lèi)。最不易利用是（N）類(lèi)。注意：氮源一般只提供合成細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞其它結(jié)構(gòu)的原料，不作為能源，只有少數(shù)細(xì)菌例外。82023/3/28能源譜(3)能源定義：能為微生物生命活動(dòng)提供最初能源來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物或輻射能。化學(xué)物質(zhì)有機(jī)物：化能異養(yǎng)微生物的能源（同碳源）無(wú)機(jī)物：化能自養(yǎng)微生物的能源（不同于碳源）輻射能：光能自養(yǎng)和光能異養(yǎng)微生物的能源92023/3/28一種營(yíng)養(yǎng)物通常有一種以上營(yíng)養(yǎng)要素功能的例子。還原態(tài)無(wú)機(jī)養(yǎng)料常具有雙功能（如NH4+，既是硝酸細(xì)菌的能源，又是其碳源）甚至還有三功能的（能源、碳源、氮源）營(yíng)養(yǎng)物。有機(jī)物常有雙功能或三功能，如：“N·C·H·O”類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物常是異養(yǎng)微生物的能源、碳源兼氮源。102023/3/28(4)生長(zhǎng)因子定義：是一類(lèi)對(duì)微生物正常代謝必不可少且不能用簡(jiǎn)單的碳源或氮源自己合成的有機(jī)物。生長(zhǎng)因子廣義的生長(zhǎng)因子：除維生素外，還包括堿基、卟啉及其衍生物，C４—C６分枝或直鏈脂肪酸，以及需要量較大的氨基酸。狹義的生長(zhǎng)因子：一般僅指維生素。112023/3/28

生長(zhǎng)因子自養(yǎng)型微生物生長(zhǎng)因子異養(yǎng)型微生物生長(zhǎng)因子過(guò)量合成的微生物微生物與生長(zhǎng)因子的關(guān)系122023/3/28生長(zhǎng)因子自養(yǎng)型微生物

多數(shù)真菌、放線菌和不少細(xì)菌，如大腸桿菌等都是不需要外界提供生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)因子自養(yǎng)型微生物。真菌放線菌大腸桿菌132023/3/28

②生長(zhǎng)因子異養(yǎng)型微生物

它們需要多種生長(zhǎng)因子，如乳酸細(xì)菌、各種動(dòng)物致病菌、原生動(dòng)物和支原體等。

乳酸菌

多種維生素需要營(yíng)養(yǎng)缺陷型（突變株）不同的嘌呤、嘧啶堿基需要支原體甾醇需要炭疽芽孢桿菌硫胺素(B1)需要142023/3/28③生長(zhǎng)因子過(guò)量合成微生物

有些微生物在其代謝活動(dòng)中，會(huì)合成出大量的維生素及其他的生長(zhǎng)因子，因此，它們可以作為維生素等的生產(chǎn)菌。阿舒假囊酵母維生素B2生產(chǎn)謝氏丙酸桿菌維生素B12生產(chǎn)152023/3/28無(wú)機(jī)鹽定義：是微生物生長(zhǎng)必不可少一類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物。它們?yōu)闄C(jī)體提供必需的金屬元素。這些金屬元素在機(jī)體中的生理作用：

參與酶的組成，調(diào)節(jié)酶的活性，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)與維持細(xì)胞的滲透壓平衡，控制細(xì)胞的氧化還原電位和作為某些微生物生長(zhǎng)的能源物質(zhì)等。162023/3/28無(wú)機(jī)鹽生理功能：172023/3/28

一般微生物生長(zhǎng)所需要的無(wú)機(jī)鹽濃度在10-3～10-4mol?L-1范圍內(nèi),稱為常量元素，如P、S、k、Mg、Ca、Na和Fe等；凡所需濃度在10-6～10-8mol?L-1范圍內(nèi),稱為微量元素，如Cu、Zn、Mn、Co等。無(wú)機(jī)鹽濃度：182023/3/28除了少數(shù)微生物如藍(lán)細(xì)菌能利用水中的氫作為還原二氧化碳時(shí)的還原劑外，其它微生物都不能利用水作為營(yíng)養(yǎng)物，但它在微生物的代謝中起著重要作用。生理功能：是微生物細(xì)胞重要組成部分；參與機(jī)體內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)；參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收與代謝產(chǎn)物分泌；可有效吸收代謝過(guò)程中放出的熱，并迅速地散發(fā)出去，避免細(xì)胞內(nèi)溫度突然升高。水192023/3/285.1.2微生物營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型以能源分：光能營(yíng)養(yǎng)型和化能營(yíng)養(yǎng)型；以供氫體分：無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)型和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型；以碳源分：自養(yǎng)型和異養(yǎng)型；根據(jù)以上分類(lèi)，我們通常把微生物分成以下四類(lèi)：202023/3/28光能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)型（光能自養(yǎng)型）光能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型（光能異養(yǎng)型）化能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)型（化能自養(yǎng)型）化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型（化能異養(yǎng)型）除此之外，還有其它劃分類(lèi)型。212023/3/28(1)光能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)型（光能自養(yǎng)型）能以CO2作為主要碳源或唯一碳源能源光氫供體無(wú)機(jī)物藍(lán)細(xì)菌、紫硫細(xì)菌、綠硫細(xì)菌、藻類(lèi)222023/3/28(2)光能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型（光能異養(yǎng)型）能以CO2及簡(jiǎn)單有機(jī)物作為主要碳源或唯一碳源能源光氫供體有機(jī)物紅螺菌科的細(xì)菌（即紫色無(wú)硫細(xì)菌）232023/3/28(3)化能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)型（化能自養(yǎng)型）無(wú)機(jī)物氧化過(guò)程中放出的化學(xué)能作為生長(zhǎng)所需要的主要能量來(lái)源。碳源CO2氫供體無(wú)機(jī)物硝化細(xì)菌、硫化細(xì)菌、鐵細(xì)菌、氫細(xì)菌、硫黃細(xì)菌等242023/3/28(4)化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型（化能異養(yǎng)型）有機(jī)物氧化過(guò)程中放出的化學(xué)能作為生長(zhǎng)所需要的主要能量來(lái)源。碳源有機(jī)物氫供體有機(jī)物絕大多數(shù)細(xì)菌和全部真核微生物252023/3/28以合成氨基酸能力分：氨基酸自養(yǎng)型和氨基酸異養(yǎng)型；以生長(zhǎng)因子分：原養(yǎng)型和營(yíng)養(yǎng)缺陷型；以攝食方式分：滲透營(yíng)養(yǎng)型和吞噬營(yíng)養(yǎng)型；以攝取死或活有機(jī)物分：腐生和寄生262023/3/28營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能否進(jìn)入細(xì)胞取決于三個(gè)方面的因素：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)本身的性質(zhì)（相對(duì)分子量、溶解性、電負(fù)性等）微生物所處的環(huán)境（溫度、pH等）微生物細(xì)胞的透過(guò)屏障（原生質(zhì)膜、細(xì)胞壁、莢膜等）5.1.3營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞方式272023/3/28細(xì)胞膜上無(wú)載體蛋白：?jiǎn)渭償U(kuò)散細(xì)胞膜上有載體蛋白不消耗能量：促進(jìn)擴(kuò)散耗能量運(yùn)送前后溶質(zhì)分子不變：主動(dòng)運(yùn)送運(yùn)送前后溶質(zhì)分子改變：基團(tuán)移位根據(jù)物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程的特點(diǎn)，可將物質(zhì)的運(yùn)輸方式分為:282023/3/281．單純擴(kuò)散

又稱被動(dòng)運(yùn)送，它是由高濃度的胞外環(huán)境向低濃度胞內(nèi)環(huán)境擴(kuò)散，這種擴(kuò)散是非特異性的。它不是微生物細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要方式。特點(diǎn)物質(zhì)在擴(kuò)散過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生任何反應(yīng)；不消耗能量，不能逆濃度運(yùn)送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；運(yùn)輸速率與膜內(nèi)外物質(zhì)的濃度差成正比292023/3/28水可以自由通過(guò)原生質(zhì)膜。脂肪酸、乙醇、甘油、一些氣體（O2、CO2）及某些氨基酸在一定程度上也可以自由通過(guò)原生質(zhì)膜。302023/3/282．促進(jìn)擴(kuò)散特點(diǎn)不消耗能量參與運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)本身的分子結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化不能進(jìn)行逆濃度運(yùn)輸運(yùn)輸速率與膜內(nèi)外物質(zhì)的濃度差成正比需要載體參與

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在運(yùn)輸過(guò)程中不需要代謝能量，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)送時(shí)，需要借助膜上一種載體蛋白參與，每種載體蛋白只運(yùn)送相應(yīng)物質(zhì)。促進(jìn)擴(kuò)散只對(duì)生長(zhǎng)在高營(yíng)養(yǎng)濃度下微生物發(fā)揮作用。312023/3/28

通過(guò)促進(jìn)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要有氨基酸、單糖、維生素及無(wú)機(jī)鹽等。322023/3/283．主動(dòng)運(yùn)送

它的一個(gè)重要特點(diǎn)是物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中需要消耗能量和載體，而且可以進(jìn)行逆濃度運(yùn)輸。

是微生物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要方式。它不僅需要特異性載體蛋白參與運(yùn)送過(guò)程，而且需要提供能量（ATP）。載體蛋白與被運(yùn)送物質(zhì)之間親和力大小的改變是由于載體蛋白構(gòu)型變化而引起。它不依賴于細(xì)胞膜內(nèi)外被運(yùn)送物質(zhì)的濃度差，可進(jìn)行逆濃度梯度運(yùn)送。332023/3/28

主動(dòng)運(yùn)送的例子很多，主要有無(wú)機(jī)離子、有機(jī)離子和一些糖類(lèi)（乳糖、葡萄糖、麥芽糖或蜜二糖）342023/3/284．基團(tuán)移位

是一種特殊類(lèi)型主動(dòng)運(yùn)送，其特點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在運(yùn)送過(guò)程中需要載體蛋白和能量(ATP等)，并且物質(zhì)分子還發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)變化。例如，運(yùn)送葡萄糖分子是依靠磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，即磷酸烯醇式一己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)。352023/3/28(1)熱穩(wěn)定載體蛋白的激活。酶1PEP+HPr→P-HPr+丙酮酸

←(2)糖被磷酸化后運(yùn)入膜內(nèi)。酶2P-HPr+糖→糖-P+HPr

細(xì)胞外細(xì)胞內(nèi)

基團(tuán)轉(zhuǎn)位又稱為磷酸烯醇式丙酮酸--磷酸糖轉(zhuǎn)移酶運(yùn)輸系統(tǒng)（PTS），PTS通常由五種蛋白質(zhì)組成，包括酶I、酶II（包括a、b、c三種亞基）和一種低相對(duì)分子量的熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)（HPr）。362023/3/28

主要用于糖的運(yùn)輸，脂肪酸、核苷、堿基等也可以通過(guò)這種方式運(yùn)輸。372023/3/28比較項(xiàng)目單純擴(kuò)散 促進(jìn)擴(kuò)散主動(dòng)運(yùn)輸基團(tuán)移位特異載體蛋白無(wú)

有

有

有

運(yùn)送速度 慢 快 快 快 溶質(zhì)運(yùn)送方向由濃至稀

由濃至稀

由稀至濃

由稀至濃平衡時(shí)內(nèi)外濃度內(nèi)外相等

內(nèi)外相等

內(nèi)部高

內(nèi)部高

運(yùn)送分子 無(wú)特異性 特異性 特異性 特異性 能量消耗 不需要

不需要

需要

需要

運(yùn)送前后溶質(zhì)分子不變 不變 不變 改變 載體飽和效應(yīng) 無(wú)

有

有

有 與溶質(zhì)類(lèi)似物無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性 有競(jìng)爭(zhēng)性 有競(jìng)爭(zhēng)性 有競(jìng)爭(zhēng)性

運(yùn)送抑制劑 無(wú)

有

有

有 運(yùn)送對(duì)象舉例水、O2

糖、SO42-氨基酸、乳糖葡萄糖\嘌呤四種運(yùn)送營(yíng)養(yǎng)方式的比較382023/3/28392023/3/285.1.4培養(yǎng)基培養(yǎng)基（medium）是人工配制的，適合于不同微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的混合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基幾乎是一切對(duì)微生物進(jìn)行研究和利用工作的基礎(chǔ)。

402023/3/28

任何培養(yǎng)基都應(yīng)該具備微生物生長(zhǎng)所需要六大營(yíng)養(yǎng)素：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、能源、生長(zhǎng)因子、水

培養(yǎng)基配制好后，必須立即進(jìn)行滅菌處理,否則很快引起雜菌生長(zhǎng)。412023/3/28①根據(jù)微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配制；②營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)；③最適的物理化學(xué)條件（pH，滲透壓）④經(jīng)濟(jì)原則。(1)培養(yǎng)基配制原則和方法422023/3/28根據(jù)不同的微生物的營(yíng)養(yǎng)要求配制針對(duì)性強(qiáng)的培養(yǎng)基，例如：①根據(jù)微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配制培養(yǎng)化能自養(yǎng)型的氧化硫桿菌的培養(yǎng)基組成為：S10gMgSO4.7H2O0.5g(NH4)2SO40.4gFeSO40.01gH3PO44gCaCl20.25gH2O1000ml培養(yǎng)化能異養(yǎng)的大腸桿菌一種培養(yǎng)基是由下列化學(xué)成分組成：葡萄糖5gNH4H2PO41gNaCl5gMgSO4.7H2O0.2gK2HPO41gH2O1000ml432023/3/28常見(jiàn)的培養(yǎng)四大類(lèi)微生物的培養(yǎng)基細(xì)菌（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5gH2O1000mlpH7.4放線菌（高氏1號(hào)）淀粉20gK2HPO40.5gNaCl0.5gMgSO4.7H2O0.5gKNO31gFeSO40.01gH2O1000ml酵母菌(麥芽汁培養(yǎng)基)

麥芽粉加四倍水，在60℃--65℃保溫糖化7-8小時(shí)，用碘液試驗(yàn)檢查至糖化完全為止，調(diào)整糖度為10Be,煮沸后，沙布過(guò)濾，調(diào)pH為5.0。霉菌（察氏合成培養(yǎng)基）NaNO33gK2HPO41gKCl0.5gMgSO4.7H2O0.5gFeSO40.01g蔗糖30gH2O1000ml442023/3/28②營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度合適時(shí)微生物才能生長(zhǎng)良好。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度過(guò)低時(shí)不能滿足微生物正常生長(zhǎng)所需，濃度過(guò)高時(shí)則可能對(duì)微生物生長(zhǎng)起抑制作用。

培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度配比也直接影響微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物的形成和積累，其中碳氮比（C/N）的影響較大。碳氮比指培養(yǎng)基中碳元素與氮元素的物質(zhì)的量比值，有時(shí)也指培養(yǎng)基中還原糖與粗蛋白之比。452023/3/28pH培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類(lèi)型微生物的生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。通常培養(yǎng)條件：細(xì)菌：pH7.0-8.0

放線菌：pH7.5-8.5酵母菌：pH3.8-6.0霉菌：pH4.0-5.8為了維持培養(yǎng)基pH的相對(duì)恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，或在工業(yè)發(fā)酵時(shí)補(bǔ)加酸、堿等。③理化條件適宜462023/3/28微生物在等滲的溶液中生長(zhǎng)最好；滲透壓在高滲的溶液中微生物細(xì)胞會(huì)發(fā)生質(zhì)壁分離。在低滲的溶液中微生物細(xì)胞會(huì)吸水膨脹破裂；

此外，水分活度、溶液中氧化還原電位對(duì)微生物的生長(zhǎng)都有影響。472023/3/28

在一定的溫度和壓力條件下,溶液的蒸汽壓力與同條件下純水蒸汽壓力之比表示，即：

αw=Pw/Pow式中Pw代表溶液蒸汽壓力,POw代表純水蒸汽壓力。純水αw為1.00,溶液中溶質(zhì)越多,αw越小。微生物一般在αw為0.60～0.99的條件下生長(zhǎng),αw過(guò)低時(shí),微生物生長(zhǎng)的遲緩期延長(zhǎng),比生長(zhǎng)速率和總生長(zhǎng)量減少。微生物不同，其生長(zhǎng)的最適αw不同。

水分活度482023/3/28氧化還原電位又稱氧化還原電勢(shì)（redoxpotential），是度量某氧化還原系統(tǒng)中的還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢(shì)的一種指標(biāo)，其單位是V（伏）或mV（毫伏）。好氧性微生物：+0.1伏以上時(shí)可正常生長(zhǎng),以+0.3～+0.4伏為宜；厭氧性微生物：低于+0.1伏條件下生長(zhǎng)；兼性厭氧微生物：+0.1伏以上時(shí)進(jìn)行好氧呼吸,+0.1伏以下時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。氧化還原電位492023/3/28以粗代精以野代家以廢代好以國(guó)代進(jìn)以簡(jiǎn)代繁以氮代朊以烴代糧以纖代糖④經(jīng)濟(jì)節(jié)約502023/3/28(2)培養(yǎng)基的類(lèi)型

培養(yǎng)基種類(lèi)繁多，根據(jù)其成分、外觀的物理狀態(tài)和用途可將培養(yǎng)分成多種類(lèi)型。按成分不同劃分天然培養(yǎng)基組合培養(yǎng)基半組合培養(yǎng)基①按成分不同劃分:512023/3/28指利用動(dòng)、植物或微生物或其提取物制成培養(yǎng)基，不明確其中的營(yíng)養(yǎng)成分。

天然培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)：取材方便、營(yíng)養(yǎng)豐富、種類(lèi)繁多、配制方便缺點(diǎn)：確定成分不明確，也不穩(wěn)定，做精確科學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，因此，只適合配制實(shí)驗(yàn)室的各種基本培養(yǎng)基及大生產(chǎn)中的種子培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基522023/3/28

組合培養(yǎng)基是一類(lèi)用幾種化學(xué)試劑配制成的、各成分的量都確切知道的培養(yǎng)基。優(yōu)點(diǎn)：成分精確，重復(fù)性好；缺點(diǎn)：價(jià)格較貴，配制麻煩，一般用于營(yíng)養(yǎng)、代謝、生理、生化、遺傳、育種、菌種鑒定和生物測(cè)定等定量要求較高的研究工作中。高氏1號(hào)培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基532023/3/28

半組合培養(yǎng)基即一部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是天然成分，一部分是化學(xué)試劑的培養(yǎng)基。嚴(yán)格地講，凡是含有未經(jīng)特殊處理的瓊脂的任何組合培養(yǎng)基，實(shí)質(zhì)上都只能看做是一種半組合培養(yǎng)基。馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基542023/3/28按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基

凝固培養(yǎng)基非可逆性凝固培養(yǎng)基天然固體培養(yǎng)基濾膜②按外觀的物理狀態(tài)劃分:552023/3/28

固體培養(yǎng)基

在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。瓊脂含量一般為1.5%-2.0%

固體培養(yǎng)基常用來(lái)進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏。562023/3/28

半固體培養(yǎng)基

瓊脂含量一般為0.2%-0.7%

觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類(lèi)鑒定及噬菌體效價(jià)測(cè)定、各種厭氧菌的培養(yǎng)以及菌種保藏等。572023/3/28

液體培養(yǎng)基

不加任何凝固劑培養(yǎng)基呈液體狀態(tài)，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究。582023/3/28粘液型菌落菌膜菌沉淀均勻渾濁對(duì)照固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基592023/3/28③按用途不同劃分按用途不同劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別性培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基加富培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括血液、血清、酵母浸膏、動(dòng)植物組織液等602023/3/28選擇性培養(yǎng)基根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或?qū)δ郴瘜W(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，其目的是使混合菌樣中劣勢(shì)菌大量生長(zhǎng)成優(yōu)勢(shì)菌，從而提高該菌篩選效率。612023/3/28選擇培養(yǎng)基（selectivemedium)622023/3/28鑒別性培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加有能與某種菌的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，通過(guò)肉眼可觀察出該菌菌落與外形相似的其他菌落相區(qū)分的培養(yǎng)基。用于鑒別不同類(lèi)型微生物的培養(yǎng)基。以上關(guān)于選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基區(qū)分是人為的、理論上的。在實(shí)際應(yīng)用中，這兩種功能常結(jié)合在一種培養(yǎng)基中。632023/3/28鑒別培養(yǎng)基（differentialmedium）642023/3/285.2微生物的生長(zhǎng)

5.2.1

微生物的生長(zhǎng)、繁殖微生物的生長(zhǎng)現(xiàn)象：微生物在適宜條件下，不斷地吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并按自身代謝方式進(jìn)行新陳代謝，如同化作用大于異化作用，其結(jié)果是原生質(zhì)總量（包括重量、體積、大小)不斷地增加。微生物繁殖：?jiǎn)渭?xì)胞微生物如細(xì)菌的生長(zhǎng)，往往伴隨著細(xì)胞數(shù)目的增加。當(dāng)細(xì)胞增長(zhǎng)到一定程度時(shí)，就以二分裂方式，形成兩個(gè)相似的子細(xì)胞，子細(xì)胞又重復(fù)上述過(guò)程，使細(xì)胞數(shù)目增加。在多細(xì)胞微生物中，細(xì)胞數(shù)目的增加如不伴隨著個(gè)體數(shù)目的增加，只能叫生長(zhǎng)，不能叫繁殖。652023/3/28

個(gè)體生長(zhǎng)→個(gè)體繁殖→群體生長(zhǎng)

群體生長(zhǎng)=個(gè)體生長(zhǎng)+個(gè)體繁殖662023/3/28代表微生物的個(gè)體繁殖方式細(xì)菌酵母菌霉菌噬菌體兩分裂Binaryfision芽殖有性或無(wú)性孢子復(fù)制672023/3/285.2.2微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定方法測(cè)生長(zhǎng)量⑴直接法：a測(cè)體積；b測(cè)干重。⑵間接法：a生理指標(biāo)（測(cè)定細(xì)胞總含氮量來(lái)確定細(xì)菌濃度；測(cè)定含碳量；測(cè)定DNA、RNA、ATP和N-乙酰胞壁酸等的含量，以及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn)二氧化碳、耗氧、黏度和產(chǎn)熱等指標(biāo))。⑶比濁法682023/3/28干重法將一定量的菌液中的菌體通過(guò)離心或過(guò)濾分離出來(lái),然后烘干(干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃)、稱重。一般干重為濕重的10%—20%，而一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞一般重約10-12—10-13g。該法適合菌濃較高的樣品。舉例：大腸桿菌一個(gè)細(xì)胞一般重約10–12~10–13g，液體培養(yǎng)物中細(xì)胞濃度達(dá)到2×109個(gè)/ml時(shí)，100ml培養(yǎng)物可得10~90mg干重的細(xì)胞。692023/3/28比濁法原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。特點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便；但易受干擾。702023/3/28計(jì)數(shù)法：⑴直接法：a比例計(jì)數(shù)法b血球計(jì)數(shù)板法⑵間接法：a平板菌落計(jì)數(shù)法b液體稀釋法快速測(cè)定法712023/3/28血球計(jì)數(shù)板法722023/3/28各種型號(hào)的全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀血球計(jì)數(shù)板732023/3/28742023/3/28１個(gè)計(jì)數(shù)室＝１×１mm包含５×５個(gè)中方格１個(gè)中方格＝４×４個(gè)小方格752023/3/28平板菌落計(jì)數(shù)法762023/3/28平板菌落計(jì)數(shù)的一般步驟772023/3/28平板菌落計(jì)數(shù)法技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴(yán)格無(wú)菌操作；注意事項(xiàng)：每一支吸管只能用于一個(gè)稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度；適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)的微生物，誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來(lái)源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作782023/3/28稀釋倒平板法

（傾注法（混菌法）、涂布法）這是最常用的純種分離法，先將待分離的材料作一系列的稀釋(如1：10、1：100、1：1000、1：10，000……)，然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基相混合，搖勻后，傾入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，平皿上就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。792023/3/28802023/3/28劃線法將已熔化的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，冷卻凝固后，用接種環(huán)沾取少許待分離的材料，在培養(yǎng)基表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物將隨著劃線次數(shù)的增加而分散，經(jīng)保溫培養(yǎng)形成菌落。劃線開(kāi)始的部分細(xì)菌分散度小，形成的菌落往往連在一起。由于連續(xù)劃線，微生物逐漸減少，劃到最后，常可形成單個(gè)孤立的菌落。這種單個(gè)菌落可能由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)，故可獲得純培養(yǎng)。用其他工具如彎形玻璃代替接種環(huán)，在培養(yǎng)基表面涂布，亦可得到同樣結(jié)果。此法較為簡(jiǎn)便。812023/3/28822023/3/28832023/3/28單細(xì)胞挑取法這種方法是從待分離的材料中挑取一個(gè)細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)，從而獲得純培養(yǎng)。具體方法是將顯微鏡挑取器裝置在顯微鏡上，把一滴菌懸液置于載玻片上，用安裝在顯微鏡挑取器上的極細(xì)的毛細(xì)吸管，在顯微鏡下對(duì)準(zhǔn)某一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞挑取，再接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)。此法需要非常熟練的操作人員，多限于高度專(zhuān)業(yè)化的科學(xué)研究中采用。842023/3/28利用選擇培養(yǎng)基分離法不同微生物需要不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。有些微生物生長(zhǎng)適于酸性環(huán)境，有些則適于堿性環(huán)境。各種微生物對(duì)不同的化學(xué)試劑如消毒劑(酚)、染料(結(jié)晶紫等)、抗生素及其他物質(zhì)等具有不同的抵抗能力。利用這些特性，便可配制成適合于某種微生物生長(zhǎng)而限制其他微生物生長(zhǎng)的各種選擇性培養(yǎng)基，以達(dá)到純種分離的目的。另外，也可以將待分離的樣品先進(jìn)行適當(dāng)處理，以消除不希望分離到的微生物。對(duì)一些生理類(lèi)型比較特殊的微生物，為了提高分離機(jī)率，往往在涂布分離前先進(jìn)行富集培養(yǎng)，其目的是提供一個(gè)特別設(shè)計(jì)的培養(yǎng)環(huán)境，以幫助所需的特殊生理類(lèi)型的微生物的生長(zhǎng)，而不利于其他類(lèi)型微生物的生長(zhǎng)。852023/3/28選擇培養(yǎng)基分離法1.dilutesample1ml9ml10

1001000104105

106107牛肉膏培養(yǎng)基土豆培養(yǎng)基高氏培養(yǎng)基862023/3/28液體稀釋法872023/3/2810n10n-210n-1882023/3/28微生物純培養(yǎng)分離方法的比較

稀釋平板法既可定性，又可定量，用途廣泛

平板劃線法方法簡(jiǎn)便，多用于分離細(xì)菌

單細(xì)胞挑取法局限于高度專(zhuān)業(yè)化的科學(xué)研究

利用選擇培養(yǎng)基法適用于分離某些生理類(lèi)型較特殊的微生物892023/3/28比例計(jì)數(shù)法應(yīng)用：可同時(shí)計(jì)數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適

于土壤、牛奶中細(xì)菌計(jì)數(shù)。方法：用鏡臺(tái)測(cè)微尺計(jì)算出視野面積；取

0.1ml菌液涂于1cm2面積上，計(jì)數(shù)后代

入公式：

每ml原菌液含菌數(shù)

=視野中平均菌數(shù)×涂布面積/視野面積×100×稀釋倍數(shù)902023/3/28

鏡臺(tái)測(cè)微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將lmm等分為100格，每格長(zhǎng)0.01mm(即10um)，用于校正目鏡測(cè)微尺每格的相對(duì)長(zhǎng)度。

目鏡測(cè)微尺是一塊中央有精確的等分刻度的圓形小玻片，置于接目鏡中的隔板上。目鏡測(cè)微尺每小格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度不一樣，測(cè)量前，必須先用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行校正。912023/3/28目鏡測(cè)微尺鏡臺(tái)測(cè)微尺利用鏡臺(tái)測(cè)微尺測(cè)定目鏡測(cè)微尺的每格絕對(duì)值目鏡測(cè)微尺測(cè)定微生物大小922023/3/28濾膜計(jì)數(shù)法932023/3/28標(biāo)簽螺紋預(yù)濕棉簽裂解液溶解液蟲(chóng)熒光素酶熒光素粉末棉簽擦拭檢測(cè)物棉簽插入kit并擰緊放入儀器讀數(shù)30秒鐘得到結(jié)果Kit操作過(guò)程便攜式細(xì)菌總數(shù)快速測(cè)定設(shè)備942023/3/285.2.3微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律多數(shù)細(xì)菌的繁殖速度很快。大腸桿菌在適宜的條件下繁殖48h，其子代總重可達(dá)2.2×1031g，這是一個(gè)巨大的數(shù)字。然而，實(shí)際情況是不可能的。那么，細(xì)菌的群體生長(zhǎng)規(guī)律到底怎樣呢?952023/3/28將少量單細(xì)胞純培養(yǎng)物接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞含量，可以看到以下現(xiàn)象：開(kāi)始有一短暫時(shí)間，細(xì)胞數(shù)量并不增加，隨之細(xì)胞數(shù)目增加很快，繼而細(xì)胞數(shù)又趨穩(wěn)定，最后逐漸下降。如果以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)或生長(zhǎng)速度為縱坐標(biāo)作圖，可以得到一條曲線，稱為生長(zhǎng)曲線。962023/3/28在不補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或移去培養(yǎng)物，保持整個(gè)培養(yǎng)液體積不變條件下，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌數(shù)為縱坐標(biāo)，根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)細(xì)菌數(shù)量的變化，可以作出一條反映細(xì)菌在整個(gè)培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。生長(zhǎng)曲線972023/3/28微生物的典型生長(zhǎng)曲線(growthcurve)總菌數(shù)活菌數(shù)培養(yǎng)時(shí)間/h

Ⅱ.指數(shù)期Ⅲ.穩(wěn)定期Ⅳ.衰亡期Ⅰ.延滯期細(xì)菌數(shù)目（個(gè)/ml）對(duì)數(shù)ⅡⅢⅣⅠ

根據(jù)微生物的生長(zhǎng)速率常數(shù)的不同，可將生長(zhǎng)曲線大致分為四個(gè)時(shí)期：

982023/3/28

992023/3/28●繪制曲線條件1）分批培養(yǎng)2）細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)1002023/3/28①延滯期：(Lagphase)

定義：指把少量微生物接種到新培養(yǎng)液開(kāi)始的一段時(shí)間，其細(xì)胞數(shù)目不增加甚至也可能減少。延滯期(1)

典型的生長(zhǎng)曲線1012023/3/28特點(diǎn)：

①生長(zhǎng)速率常數(shù)為零；

②細(xì)胞體積增大，DNA含量增多，為分裂做準(zhǔn)備；③合成代謝旺盛，核糖體、酶類(lèi)和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶；④對(duì)不良環(huán)境如pH、NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等化學(xué)物質(zhì)敏感。延滯期特點(diǎn)：1022023/3/28具體方法：以對(duì)數(shù)期的菌體作種子菌，縮短延滯期；適當(dāng)增大接種量；種子培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分盡量接近發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵工業(yè)常采取措施縮短延滯期1032023/3/285.2.3微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律對(duì)數(shù)期(Logarithmicphase)定義:指在生長(zhǎng)曲線中，緊接著延滯期后的一段時(shí)期。此時(shí)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)的速率常數(shù)R最大，分裂快，細(xì)胞代時(shí)短，細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)。菌體內(nèi)酶系活躍，代謝旺盛，菌體數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增加，群體形態(tài)與生理特征最一致，抗不良環(huán)境能力強(qiáng)。1042023/3/28②對(duì)數(shù)期(Logarithmicphase)對(duì)數(shù)期1052023/3/28生長(zhǎng)速率常數(shù)R：指細(xì)胞每小時(shí)的分裂次數(shù)。代時(shí)G：細(xì)胞每分裂一次所需的時(shí)間。R=1/G1062023/3/28G=(t2-t1)/n=(t2-t1)/3.322(lgX2-lgX1)R=1/G=3.322(lgX2-lgX1)/(t2-t1)

X2=X1·2n兩邊取對(duì)數(shù)：lgX2=lgX1+nlg2（lg2=0.301）n=3.322(lgX2-lgX1)

x2x1t1t21072023/3/28例如：一培養(yǎng)液中微生物數(shù)目由開(kāi)始的12，000（B），經(jīng)4h（t）后增加到49，000，000（b），這樣，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于n和t，還可以計(jì)算出不同培養(yǎng)條件下的代時(shí)G，

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴該種微生物的代時(shí)為20分鐘。在4小時(shí)內(nèi)共繁殖了12代。1082023/3/28特點(diǎn)①生長(zhǎng)速率常數(shù)R最大，代時(shí)G最短；

②整個(gè)群體的生理特性較一致；③細(xì)胞各成分平衡增長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率恒定④酶系活躍，代謝旺盛1092023/3/28影響因素：①菌種。不同微生物代時(shí)差別大，即使是同一菌種，由于培養(yǎng)基成分和物理?xiàng)l件不同，其對(duì)數(shù)期的代時(shí)也不同.②營(yíng)養(yǎng)成分。同種細(xì)菌，營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，其代時(shí)短。③培養(yǎng)溫度。溫度是影響微生物生長(zhǎng)速率的重要物理因素。1102023/3/28影響代時(shí)長(zhǎng)短的因素（1）菌種（2）營(yíng)養(yǎng)成分（3）營(yíng)養(yǎng)物濃度（4）培養(yǎng)溫度細(xì)胞數(shù)或菌體量時(shí)間8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml營(yíng)養(yǎng)物濃度對(duì)生長(zhǎng)速度和菌體產(chǎn)量的影響1112023/3/28③穩(wěn)定期（stationaryphase）

又叫最高生長(zhǎng)期或恒定期，其特點(diǎn)是新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡細(xì)胞數(shù)幾乎相等，即正生長(zhǎng)與負(fù)生長(zhǎng)達(dá)動(dòng)態(tài)平衡，生長(zhǎng)速度逐漸趨向于零。穩(wěn)定期1122023/3/28

①生長(zhǎng)速率常數(shù)R=0，即新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等；②菌體產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)，且產(chǎn)量與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗出現(xiàn)有規(guī)律的比例關(guān)系，用生長(zhǎng)產(chǎn)量常數(shù)Y表示；Y=(X-X0)/C0-C=(X-X0)/C0

X：穩(wěn)定期的細(xì)胞干重(g/ml培養(yǎng)液）X0：剛接種時(shí)的細(xì)胞干重C0

：限制性營(yíng)養(yǎng)物的最初濃度(g/ml)C：穩(wěn)定時(shí)期限制性營(yíng)養(yǎng)物的濃度1132023/3/28營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)特別是生長(zhǎng)限制因子耗盡；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比例失調(diào)（C：N）；酸、醇、毒素或過(guò)氧化氫等有害產(chǎn)物累積；pH，氧化還原電勢(shì)等環(huán)境條件越來(lái)越不適宜等。穩(wěn)定期出現(xiàn)原因1142023/3/28③通過(guò)對(duì)穩(wěn)定期到來(lái)原因的研究，促進(jìn)了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝、技術(shù)的創(chuàng)建；①對(duì)以生產(chǎn)菌體或與菌體生長(zhǎng)相平行的代謝產(chǎn)物(SCP、乳酸)等為目的的一些發(fā)酵生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定期是產(chǎn)物的最佳收獲期：②是對(duì)維生素、堿基和氨基酸等生長(zhǎng)因子進(jìn)行生物測(cè)定的最佳測(cè)定時(shí)期；穩(wěn)定期的實(shí)踐意義1152023/3/28穩(wěn)定期是以生產(chǎn)菌體或與菌體生長(zhǎng)相平行的代謝產(chǎn)物。穩(wěn)定期的微生物，在數(shù)量上達(dá)到最高水平，產(chǎn)物積累也達(dá)到高峰，菌體的總產(chǎn)量與所消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)間存在著一定關(guān)系。此外，由于對(duì)穩(wěn)定期到來(lái)的原因進(jìn)行研究，促進(jìn)了連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)生和研究。生產(chǎn)上常通過(guò)補(bǔ)料、調(diào)節(jié)溫度和pH等措施，延長(zhǎng)穩(wěn)定期，以積累更多代謝產(chǎn)物。穩(wěn)定期在發(fā)酵工業(yè)上的應(yīng)用1162023/3/28④衰亡期(declinephase)穩(wěn)定期后，微生物死亡率逐漸增加，以致死亡數(shù)大大超過(guò)新生數(shù)，群體中活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)了“負(fù)生長(zhǎng)”。衰亡期1172023/3/28細(xì)胞形態(tài)多樣，例如產(chǎn)生很多膨大、不規(guī)則退化形態(tài)、有的細(xì)胞多液泡；革蘭氏染色反應(yīng)為陽(yáng)性的變成陰性；有的微生物因蛋白水解酶活力增強(qiáng)發(fā)生自溶；有的微生物此時(shí)產(chǎn)生抗生素等次生代謝產(chǎn)物；對(duì)于芽孢桿菌，芽孢釋放往往也發(fā)生在這一時(shí)期。衰亡期特點(diǎn)1182023/3/28穩(wěn)定期到來(lái)的主要原因營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡；有害代謝產(chǎn)物的累計(jì)；理化條件的不適宜等；1192023/3/28(2)微生物的連續(xù)培養(yǎng)

：其原理是根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物生長(zhǎng)密度，用光電控制系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)液的濁度（即菌液濃度），并控制培養(yǎng)液流速，從而獲得菌體密度高、生長(zhǎng)速度恒定的微生物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)液。恒濁法1202023/3/28在恒濁器中的微生物，始終能以最高生長(zhǎng)速率進(jìn)行生長(zhǎng)，并可在允許范圍內(nèi)控制不同菌體密度.主要用于獲得大量菌體或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物。生產(chǎn)實(shí)踐上，為了獲得大量菌體或與菌體生長(zhǎng)相平行的某些代謝產(chǎn)物如乳酸、乙醇時(shí)，可采用此法.1212023/3/28恒濁連續(xù)培養(yǎng)通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)裝置中的光電系統(tǒng)控制培養(yǎng)液中菌體濃度恒定、使細(xì)菌生長(zhǎng)連續(xù)進(jìn)行的一種培養(yǎng)方式。用于菌體以及與菌體生長(zhǎng)平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)1222023/3/28原理是使培養(yǎng)液流速保持不變，即控制在恒定的流速，使微生物始終在低于最高生長(zhǎng)速率條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的一種連續(xù)培養(yǎng)方法。此法是與生長(zhǎng)速率相關(guān)的各種理論研究。主要獲得不同生長(zhǎng)速率的菌體；恒化法1232023/3/28常通過(guò)控制某一種營(yíng)養(yǎng)物的濃度，使其成為限制性的因子，細(xì)菌的生長(zhǎng)速率將取決于限制性因子的濃度。隨著細(xì)菌生長(zhǎng)，菌體密度會(huì)隨時(shí)間增長(zhǎng)而增高，而限制性生長(zhǎng)因子濃度又會(huì)隨時(shí)間增長(zhǎng)而降低，兩者互相作用的結(jié)果，出現(xiàn)微生物的生長(zhǎng)速率正好與恒速加入的新鮮培養(yǎng)基流速相平衡，即可獲得一定生長(zhǎng)速率的均一菌體，又可獲得雖低于最高菌體產(chǎn)量，但能保持穩(wěn)定菌體密度的菌體。1242023/3/28恒化法1252023/3/281262023/3/28

．

．

．

微生物的連續(xù)培養(yǎng)1272023/3/28

恒濁與恒化培養(yǎng)控制裝置1282023/3/28裝置恒濁器恒化器控制對(duì)象菌體密度(內(nèi)控制)培養(yǎng)基流速(外控制)培養(yǎng)基無(wú)限制生長(zhǎng)因子有限制生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基流速不恒定恒定生長(zhǎng)速率最高速率低于最高速率產(chǎn)物大量菌體或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物不同生長(zhǎng)速率的菌體應(yīng)用范圍生產(chǎn)為主實(shí)驗(yàn)室為主

Turbidostat&chemostat的比較1292023/3/28工作原理：培養(yǎng)液濁度與菌濃度成正比

限制性營(yíng)養(yǎng)物與菌生長(zhǎng)速度正比。

控制方法：改變流速，使培養(yǎng)液濁度恒定

流速恒定

流入培養(yǎng)基成分：各種營(yíng)養(yǎng)成分都很充分

限制性營(yíng)養(yǎng)物濃度低，其他成分充分。

容器內(nèi)菌的生長(zhǎng)速率：最大生長(zhǎng)速率低于最大生長(zhǎng)速率

恒濁器

恒化器1302023/3/28分批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)的比較1312023/3/281322023/3/28

優(yōu)點(diǎn)：自控性，利用各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制；高效，它使裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等工藝簡(jiǎn)化了，縮短了生產(chǎn)時(shí)間和提高了設(shè)備的利用效率；產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；節(jié)約大量動(dòng)力、人力、水和蒸汽，水、電、氣負(fù)荷減少。缺點(diǎn)：菌種易于退化容易污染，在連續(xù)發(fā)酵中，要保持各種設(shè)備無(wú)滲透，通氣系統(tǒng)不出任何故障，是極其困難的。因此，“連續(xù)”培養(yǎng)有時(shí)間限制，一般可達(dá)到數(shù)月至一年、兩年。連續(xù)培養(yǎng)中，營(yíng)養(yǎng)物的利用率低于分批培養(yǎng)。應(yīng)用：?jiǎn)渭?xì)胞蛋白的生產(chǎn)，乙醇、乳酸、丙酮和石油脫蠟，污水處理。微生物的連續(xù)培養(yǎng)與連續(xù)發(fā)酵的特點(diǎn)1332023/3/28同步生長(zhǎng)同步生長(zhǎng)通過(guò)同步培養(yǎng)的手段而使細(xì)胞群體中各個(gè)體處于分裂步調(diào)一致的生長(zhǎng)狀態(tài)；獲得同步生長(zhǎng)的方法環(huán)境條件誘導(dǎo)法機(jī)械篩選法1342023/3/28方法：⑴調(diào)整生理?xiàng)l件誘導(dǎo)同步性，主要是通過(guò)控制環(huán)境條件如溫度、光線和處于穩(wěn)定期的培養(yǎng)物添加新鮮培養(yǎng)基等來(lái)誘導(dǎo)同步。⑵機(jī)械法，它是利用物理方法從不同步的細(xì)菌群體中選擇出同步的群體，一般地，誘導(dǎo)法不如選擇法。注意：同步生長(zhǎng)的細(xì)菌，在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)很快喪失其同步性。1352023/3/28同步培養(yǎng)方法機(jī)械方法環(huán)境條件控制技術(shù)離心方法過(guò)濾分離法硝酸纖維素濾膜法溫度培養(yǎng)基成份控制光照和黑暗交替培養(yǎng)1362023/3/281372023/3/28硝酸纖維素濾膜法離心法1382023/3/28Helmstetter-Cummings法原理：一些細(xì)菌細(xì)胞會(huì)緊緊粘附于硝酸纖維微孔濾膜上。步驟：菌懸液通過(guò)微孔濾膜，細(xì)胞吸附其上；反置濾膜，以新鮮培養(yǎng)液通過(guò)濾膜，洗掉浮游細(xì)胞；除去起始洗脫液后就可以得到剛剛分裂下來(lái)的新生細(xì)胞，即為同步培養(yǎng)。1392023/3/281402023/3/281412023/3/285.2.3影響微生物生長(zhǎng)的因素(1)溫度影響微生物生長(zhǎng)繁殖的最重要因素之一。就總體而言，微生物生長(zhǎng)的溫度范圍較廣，已知的微生物在-10～95℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)。而對(duì)某一具體微生物而言，只能在一定的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，且此溫度范圍有寬、有窄。生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)：任何微生物的生長(zhǎng)溫度總有最低生長(zhǎng)溫度、最適生長(zhǎng)溫度、最高生長(zhǎng)溫度。1422023/3/28（一般為-5~-10℃，極端為-30℃）指微生物能進(jìn)行繁殖的最低溫度界限。此時(shí)，微生物生長(zhǎng)速度很低，如果低于此溫度則生長(zhǎng)完全停止。不同微生物最低生長(zhǎng)溫度不一樣，這與它們的原生質(zhì)物理狀態(tài)化學(xué)組成有關(guān)，也可隨環(huán)境條件而變。①最低生長(zhǎng)溫度1432023/3/28

指某菌分裂代時(shí)最短或生長(zhǎng)速率最高時(shí)培養(yǎng)溫度（嗜冷菌<20℃嗜中溫菌20~45℃嗜熱均>45℃），但是，同一微生物，不同生理生化過(guò)程有著不同最適溫度，即最適生長(zhǎng)溫度并不等于生長(zhǎng)量最高時(shí)培養(yǎng)溫度，也不等于發(fā)酵速度最高時(shí)培養(yǎng)溫度或累積代謝產(chǎn)物量最高時(shí)培養(yǎng)溫度，更不等于積累某一代謝產(chǎn)物量最高時(shí)培養(yǎng)溫度。因此，生產(chǎn)上要根據(jù)微生物不同生理代謝過(guò)程溫度特點(diǎn)，采用分段式變溫培養(yǎng)或發(fā)酵。②最適生長(zhǎng)溫度1442023/3/28

指微生物生長(zhǎng)繁殖最高溫度界限（一般為80~95℃，極端105~300℃），此溫度下，微生物細(xì)胞易于衰老和死亡。微生物所能適應(yīng)最高生長(zhǎng)溫度與其細(xì)胞內(nèi)酶的性質(zhì)有關(guān)。③最高生長(zhǎng)溫度1452023/3/28

最高生長(zhǎng)溫度如進(jìn)一步升高，便可以殺死微生物，這種致死微生物的最低溫度界限即為致死溫度。它與處理時(shí)間有關(guān)，處理時(shí)間越長(zhǎng)，死亡率越高，嚴(yán)格地，一般應(yīng)以10分鐘為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間，細(xì)菌在10分鐘被完全殺死的最低溫度稱為致死溫度。④致死溫度1462023/3/28

可在較低溫度下生長(zhǎng)，其適溫10~15℃，常分布在地球兩極地區(qū)水域和土壤中，即使在其微小的液態(tài)水間歇中也有微生物存在。（右圖為南極Vostok湖冰芯樣品中的微生物）⑤低溫型微生物1472023/3/28嗜冷機(jī)制：①酶系在低溫下仍能起催化作用②細(xì)胞膜含較多的不飽和脂肪酸，在低溫下仍具有通透性。1482023/3/28

絕大多數(shù)微生物屬于此類(lèi)，最適生長(zhǎng)溫度在20~40℃間，最低生長(zhǎng)溫度10~20℃，最高生長(zhǎng)溫度40~45℃，又可分為嗜室溫和嗜體溫微生物。⑥中溫型微生物1492023/3/28

適于在45℃以上溫度中生長(zhǎng)，在自然界中分布僅局限于某些地區(qū)，如溫泉、日照充足的土壤表層、堆肥、發(fā)酵飼料等腐爛有機(jī)物中。⑦高溫型微生物1502023/3/28

嗜熱菌

它們適于在45～50℃以上的溫度中生長(zhǎng)，在自然界中的分布僅局限制于某些地區(qū)，如溫泉、日照充足的土壤表面、堆肥堆、發(fā)酵飼料等腐爛有機(jī)物中，比如堆肥在發(fā)酵過(guò)程中溫度常高達(dá)60～70℃。

嗜熱機(jī)制：

①細(xì)胞內(nèi)的酶具強(qiáng)抗熱性。

②產(chǎn)生的多胺，熱亞胺和高溫精胺物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì),等組織結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。

③核酸也具有熱穩(wěn)定性的保護(hù)結(jié)構(gòu)。

④細(xì)胞膜含有較多的飽和脂肪酸和直鏈脂肪酸，使膜具有穩(wěn)定性。1512023/3/28溫度與典型微生物生長(zhǎng)速率的關(guān)系1522023/3/28(2)干燥會(huì)造成微生物失水代謝停止以至死亡，不同微生物對(duì)干燥抵抗力是不一樣的；抵抗干燥的能力，依次為細(xì)菌芽孢，霉菌和酵母菌孢子，革蘭氏陽(yáng)性球菌，酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，霉菌菌絲；影響微生物對(duì)干燥的抵抗力的因素：干燥時(shí)溫度升高，微生物容易死亡，溫度降低，抵抗力強(qiáng)。緩慢干燥，微生物容易死亡?？焖俑稍铮⑸锏挚沽?qiáng)。1532023/3/28(3)滲透壓大多微生物適于在等滲的環(huán)境生長(zhǎng)，若置于高滲溶液(20%NaCl)中，易造成細(xì)胞脫水而引起質(zhì)壁分離，使細(xì)胞不能生長(zhǎng)甚至死亡，若置于低滲溶液中，外環(huán)境中水從溶液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞膨脹，甚至破裂致死。1542023/3/28

一般微生物不耐高滲。食品工業(yè)可采取多種有效抑制微生物生長(zhǎng)，保存食品的方法。有些微生物耐高滲能力較強(qiáng)，可在15—30%鹽溶液生長(zhǎng)。1552023/3/28(4)pH微生物生長(zhǎng)pH范圍較廣，一般在2－8之間，絕大多數(shù)生長(zhǎng)在pH5－9。不同的微生都有其最適生長(zhǎng)pH和一定pH范圍，即最高、最適與最低三個(gè)數(shù)值。最適pH范圍內(nèi)微生物生長(zhǎng)繁殖速度快。最低、最高pH環(huán)境中，微生物雖能生存和生長(zhǎng)，但緩慢且易死亡。1562023/3/28微生物根據(jù)最適pH的不同，可以分為三類(lèi)

①嗜中性微生物(Neutrophiles)最適pH5-8.

②嗜酸微生物(Acidophiles)

最適pH<5

③嗜堿微生物(Alkaliphiles)最適pH>81572023/3/28一般地，霉菌適應(yīng)環(huán)境范圍最大，酵母菌較小，細(xì)菌最小。微生物最低pH最適pH最高pH細(xì)菌3~56.5~7.58~10酵母菌2~34.5~5.57~8霉菌1~34.5~5.57~81582023/3/28同一微生物在其不同的生長(zhǎng)階段和不同生理、生化過(guò)程中。也要求不同最適pH，這對(duì)發(fā)酵工業(yè)中pH控制，積累代謝產(chǎn)物特別重要。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿都具有殺菌力。1592023/3/28微生物生命活動(dòng)能改變外界環(huán)境pH，如

糖類(lèi)－－－－－pH↓

有機(jī)物脂肪－－－－－pH↓培養(yǎng)基內(nèi)蛋白質(zhì)－－－－pH↑中性成分

(NH4)2SO4－－－－pH↓

無(wú)機(jī)鹽

NaNO3－－－－-pH↑發(fā)酵、氧化水解脫羧NH4＋選擇吸收NO3-選擇吸收1602023/3/28

過(guò)酸時(shí)：加NaOH、Na2CO3等堿液中和

治標(biāo)

過(guò)堿時(shí)：加H2SO4、HCl等酸液中和pH

調(diào)節(jié)

加適當(dāng)?shù)矗杭幽蛩亍aNO3、

過(guò)酸時(shí)

NH4OH或蛋白質(zhì)等

治本

提高通氣量

加適當(dāng)碳源：加糖、乳酸、醋酸、檸檬酸或油脂

過(guò)堿時(shí)

降低通氣量1612023/3/28發(fā)酵工業(yè)中，及時(shí)地調(diào)整發(fā)酵液pH，有利于積累代謝產(chǎn)物，是生長(zhǎng)中一項(xiàng)重要措施。pH治標(biāo)治本過(guò)酸：加堿液中和過(guò)堿：加酸液中和過(guò)酸：過(guò)堿：加適量氮源加適量碳源1622023/3/28

專(zhuān)性好氧菌：要求必須在有分子氧條件下才能生長(zhǎng)，有完整呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體，細(xì)胞有超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶，絕大多數(shù)真菌和許多細(xì)菌都屬此類(lèi)。兼性厭氧菌：在有氧和無(wú)氧條件下都能生長(zhǎng)，有氧情況生長(zhǎng)良好，有氧時(shí)進(jìn)行呼吸產(chǎn)能，無(wú)氧時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，細(xì)胞含SOD和過(guò)氧化氫酶，許多酵母菌，細(xì)菌屬此類(lèi)。(4)

氧氣1632023/3/28

微好氧菌：只能在較低氧分壓下才能正常生長(zhǎng)的微生物，也通過(guò)呼吸鏈以氧為最終氫受體而產(chǎn)能。

耐氧菌：一類(lèi)可在分子氧存在時(shí)進(jìn)行厭氧呼吸的厭氧菌，即它們生長(zhǎng)不需要氧，但分子氧存在對(duì)它也無(wú)毒害。它們不具有呼吸鏈，僅依靠專(zhuān)性發(fā)酵獲得能量，細(xì)胞內(nèi)存在SOD和過(guò)氧化物酶，但無(wú)過(guò)氧化氫酶，一般多數(shù)乳酸菌是耐氧菌。1642023/3/28厭氧菌：可分為一般厭氧菌和嚴(yán)格厭氧菌,分子氧存在對(duì)它們有毒，甚至死亡，它們?cè)诠腆w或半固體培養(yǎng)基表面上不能生長(zhǎng)，只能在深層無(wú)氧或低氧化還原電勢(shì)環(huán)境下生長(zhǎng)，其生命活動(dòng)所需能量是通過(guò)發(fā)酵、無(wú)氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵等提供，細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD和細(xì)胞色素氧化酶。1652023/3/28大多數(shù)還缺乏過(guò)氧化氫酶，常見(jiàn)厭氧菌有肉毒梭狀芽孢桿菌、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、光合細(xì)菌、產(chǎn)甲烷菌等。1662023/3/28氧與細(xì)菌生長(zhǎng)的關(guān)系

1672023/3/28不同微生物在半固體瓊脂柱中的生長(zhǎng)狀態(tài)a好氧菌b厭氧菌c兼性厭氧菌d微好氧菌e耐氧菌1682023/3/28二、氧氣(oxygen)

好氧菌(Aerobes)1.專(zhuān)性好氧菌(obligateaerobes)

必須有氧存在2.兼性好氧菌(facultativeaerobes)

有氧無(wú)氧均可，但有氧更好3.微好氧菌(microaerophilicaerobes)

只在較低的氧分壓下生長(zhǎng)

厭氧菌(anaerobes)4.耐氧菌(aerotolerantanaerobes)

不需氧，但有氧也能生存，氧無(wú)毒害5.專(zhuān)性厭氧菌(obligate/strictanaerobes)

氧有毒害，甚至致死1692023/3/28厭氧菌的氧毒害機(jī)制

厭氧菌體內(nèi)無(wú)SOD(超氧化物歧化酶)，因此受生物體內(nèi)普遍存在的超氧陰離子自由基的毒害作用。1702023/3/28去除·O2-等有害活性氧分子的機(jī)制H2O+1/2O22H2O2·O2-+2H+H2O2+O2SOD一切好氧生物及耐氧菌過(guò)氧化氫酶一切好氧生物NADH2NAD過(guò)氧化物酶耐氧菌1712023/3/285.2.4有害微生物控制