基因組學(xué)的教案

基因組學(xué)的教案第1頁/共93頁表觀遺傳學(xué)的例子

1)細(xì)胞的分化是一種典型的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象,如人類眼睛細(xì)胞和肌肉細(xì)胞含有相同的基因組,但基因的表達(dá)差異很大.2)whileamutationintheaxingenecalledaxin-fusedproducesmicewithkinkytails(彎曲尾巴),thedegreeofkinkinessvariesamonggeneticallyidenticallittermates(同一窩老鼠)(Figure).第2頁/共93頁Epigenetics的歷史1)上世紀(jì)40年代,Waddington首創(chuàng)“epigenetics”一詞,用以概括研究基因及其產(chǎn)物如何轉(zhuǎn)變?yōu)楸憩F(xiàn)型的領(lǐng)域.

用現(xiàn)在的話說,就是遺傳信息如何轉(zhuǎn)變?yōu)楸硇偷倪^程.2)就詞義而言,“epi”是“其上”(upon)或“超越”(over)的意思.因此,在epigenetics的定義中,genetics只涉及基因的結(jié)構(gòu)層次,而epigenetics則涉及基因如何發(fā)揮其功能以及基因之間的互作關(guān)系.3)在Waddington的“epigenetics”定義中,epigenetics的位置處于遺傳學(xué),發(fā)育和生態(tài)學(xué)的交叉口.第3頁/共93頁表觀遺傳的通俗解釋我國古代有“橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，其實(shí)味不同”的記載，說明相同基因型的生物在不同的環(huán)境條件下表型有很大的差別。同一種中藥材在不同產(chǎn)地生長，其藥效相差甚遠(yuǎn)，這也是環(huán)境影響基因表達(dá)的突出例子。這種因環(huán)境影響而改變的基因表達(dá)模式并不涉及基因型的變異，但可以重復(fù)出現(xiàn)，穩(wěn)定遺傳，是一種典型的表觀遺傳現(xiàn)象。同卵孿生子的表型趨異也是一種表觀遺傳.最近的研究發(fā)現(xiàn),隨著年齡的增長同卵孿生子的表型差異有擴(kuò)大的趨勢.第4頁/共93頁Epigenetics概念的變遷1)1982年“DictionaryofBiology”的定義:epigenetics系指遺傳因子與發(fā)育過程之間的互作,通過這種互作使基因型轉(zhuǎn)變?yōu)楸硇?2)1992年,Hall在其所著的“EvolutionaryDevelopmentalBiology”一書中,將epigenetics定義為:在發(fā)育過程中遺傳因子和非遺傳因子作用于細(xì)胞,選擇性控制基因的表達(dá),并逐步增加表型復(fù)雜性的過程.3)1996年,在“EpigenticMechanismsofGeneRegulation”一書中將epigenetics定義為:不涉及DNA順序的改變而發(fā)生的基因功能的差異,這種差異能通過有絲分裂和減數(shù)分裂穩(wěn)定傳遞.4)2001年Science雜志對epigenetics的定義為:不涉及DNA順序的變異但能通過有絲分裂和減數(shù)分裂遺傳的基因表達(dá)模式的改變.第5頁/共93頁表觀遺傳學(xué)表觀遺傳學(xué)(epigenetics):研究在不改變DNA順序的情況下基因表達(dá)出現(xiàn)可遺傳變化的分支學(xué)科.這種表達(dá)模式的改變可通過有絲分裂和減數(shù)分裂傳遞給子代細(xì)胞或個(gè)體.表觀遺傳學(xué)是功能基因組學(xué)研究的重要領(lǐng)域.表觀遺傳是基因組程序化的一種表現(xiàn)形式.第6頁/共93頁表觀遺傳學(xué)的內(nèi)容廣義的表觀遺傳(epigenetic)包括以下內(nèi)容:1)DNA的甲基化2)位置效應(yīng)3)核小體和組蛋白的修飾(乙?；图谆?4)RNAi(siRNA和miRNA)導(dǎo)致的基因沉默5)染色質(zhì)重建(如X-染色體的失活)6)免疫組織細(xì)胞DNA的重排7)基因組印記(genomicimprinting)8)等位基因的副突變及同源抑制，顛換效應(yīng)9)朊蛋白(Prion)第7頁/共93頁歐洲已啟動(dòng)epigonome計(jì)劃InOctober2000,theHumanEpigenomeConsortium(theSangerInstitute,EpigenomicsAG,andtheCentreNationaldeGénotypageinEvry,France)startedaEuropeanUnion-fundedpilotprojecttomapthemethylationsiteswithinthemajorhistocompatibilitycomplex(MHC)regioninsevendifferenthumantissues.2000年10月,歐共體啟動(dòng)了一項(xiàng)探索計(jì)劃:繪制人類基因組7種不同組織細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合體(MHC)區(qū)甲基化位點(diǎn)圖.第8頁/共93頁表觀遺傳--位置效應(yīng)1)位置效應(yīng)是指由于基因在染色體上的位置發(fā)生改變而引起的表型改變的現(xiàn)象。2)位置效應(yīng)表明,基因的功能以及基因?qū)ι锉硇偷挠绊懣梢栽诓桓淖冞z傳物質(zhì)本身的順序組成情況下僅僅由于遺傳物質(zhì)在染色體上的位置差別而發(fā)生變化。3)位置效應(yīng)實(shí)際上反映了基因組不同區(qū)域特定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因施加的影響。

第9頁/共93頁兩種位置效應(yīng)美國學(xué)者E.B.劉易斯把位置效應(yīng)分為兩大類型：穩(wěn)定型和花斑型。穩(wěn)定型位置效應(yīng)簡稱S型位置效應(yīng)，表型改變是穩(wěn)定的?；ò咝臀恢眯?yīng)簡稱V型效應(yīng)，其表型改變是不穩(wěn)定的，從而導(dǎo)致顯性和隱性性狀嵌合的花斑現(xiàn)象。

第10頁/共93頁花斑型位置效應(yīng)當(dāng)某一基因由于染色體重排從原來的常染色質(zhì)區(qū)移到異染色質(zhì)區(qū)附近,因異染色質(zhì)的擴(kuò)散效應(yīng),造成基因表達(dá)的改變.這種抑制效應(yīng)的差別使基因表達(dá)受抑程度不同,由此產(chǎn)生嵌合.第11頁/共93頁位置效應(yīng)--座位控制區(qū)1)什么是座位控制區(qū)(locuscontrolregion,LCR).Thelevelofactivityofaeuchromaticregionofachromosomeisregulatedbyacis-actingDNAelementdesignatedalocuscontrolregion.

可調(diào)控常染色質(zhì)區(qū)活性水平的一段順式DNA成分.2)LCR的功能:以順式(cis-)方式調(diào)控與其連鎖的基因表達(dá).3)第一個(gè)LCR首先在人類β-球蛋白基因座位區(qū)發(fā)現(xiàn).見:Blood,100:3077-3086,2002第12頁/共93頁β

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球蛋白質(zhì)基因座位控制區(qū)第13頁/共93頁β-球蛋白質(zhì)基因座位控制區(qū)的結(jié)構(gòu)球蛋白基因簇含有5個(gè)功能基因，分別為ε、γG、γA、δ、β,分布在50kb的DNA區(qū)段。球蛋白基因只在血紅細(xì)胞中表達(dá)，但每個(gè)基因表達(dá)的時(shí)期與組織特異性各不相同。ε-球蛋白基因在胚胎卵囊中表達(dá)，Gγ和Aγ卵黃囊表達(dá)，δ和β僅在成體骨髓中表達(dá)。盡管每個(gè)球蛋白基因都有一套彼此獨(dú)立的調(diào)控系統(tǒng)，但它們都毫無例外地受到位于該區(qū)上游一段長約12kb的LCR控制.5’HSs1-5是LCR區(qū)5個(gè)DNA-I酶高敏感位點(diǎn),是處在開放狀態(tài)的染色質(zhì)區(qū).5’HSs1-4位點(diǎn)是類紅細(xì)胞專一性的調(diào)控區(qū),5’HSs5-7為非類紅細(xì)胞活性.增強(qiáng)子活性位于5’HSs2-3位點(diǎn).humanhispanicdeletion為LCR區(qū)缺失,引起地中海貧血病.卵圓型為氣味受體基因區(qū)(olfactorreceptorgenes).第14頁/共93頁LCR區(qū)ncRNA的調(diào)控作用第15頁/共93頁副突變副突變:(paramuta-tion)最初在玉米中發(fā)現(xiàn)的在雜合子中某一基因影響同一座位上另一等位基因的表型.副突變在轉(zhuǎn)基因表現(xiàn)型中也已發(fā)現(xiàn),稱為同源抑制.第16頁/共93頁副突變的分子機(jī)制控制玉米紫色基因b1副突變的成分位于該基因上游100kb，是一段含有多個(gè)拷貝的重復(fù)順序。雜合子中已發(fā)生副突變的b1基因可將其修飾模式（B‘）“拷貝”到等位基因B-1，使后者轉(zhuǎn)變?yōu)楦蓖蛔儬?B＇）

B-I和B’都有7個(gè)串接重復(fù)順序，重復(fù)順序單位長853bp。重復(fù)順序的多少涉及副突變和b1的轉(zhuǎn)錄水平。B-I和B‘的DNA順序完全相同，不同的只是表達(dá)水平。B-I狀態(tài)重復(fù)順序的甲基化程度高于B’.玉米的B-I和B’的副突變涉及siRNA路線（AllemanM等，2006）。

第17頁/共93頁小RNA與玉米

B-I基因的沉默第18頁/共93頁染色質(zhì)位置阻隔效應(yīng)—絕緣子1）1985年，Udvardy等在果蠅染色體87A7條帶熱激蛋白基因座的兩側(cè)發(fā)現(xiàn)了兩段取名為scs和scs’(specializedchronatinstructures,特化染色質(zhì)區(qū))

的順序。scs和scs’長分別為350bp和200bp，對

DNAaseI有高度抗性。這兩個(gè)序列的兩側(cè)均有DNAaseI超敏位點(diǎn)，各為100bp。2）將scs置于控制眼睛顏色的基因兩側(cè)然后導(dǎo)入果蠅，轉(zhuǎn)化的果蠅品系不管轉(zhuǎn)基因位于何處，均可產(chǎn)生類似表型，說明scs可使轉(zhuǎn)基因免受內(nèi)源染色質(zhì)“位置影響”3)這種可以阻止鄰近位置激活或失活效應(yīng)的順序稱之為絕緣子（insulator）或隔離子。第19頁/共93頁

果蠅絕緣子（insulator）第20頁/共93頁

果蠅多線染色體橫紋區(qū)SCS

專一性結(jié)合蛋白質(zhì)第21頁/共93頁絕緣子可阻止相鄰基因之間增強(qiáng)子的彼此干擾1)真核生物增強(qiáng)子具有雙向作用,超長距離功能,從而帶來位置相鄰基因之間的彼此干擾問題.2)有些基因位于異染色質(zhì)鄰近,會(huì)受到抑制效應(yīng)的干擾.絕緣子可以阻止上述因位置原因產(chǎn)生的對基因表達(dá)的抑制效應(yīng).第22頁/共93頁絕緣子的定向控制第23頁/共93頁

絕緣子效應(yīng)的方向性絕緣子的效應(yīng)具有方向性果蠅的yellow（y）座位有4個(gè)增強(qiáng)子元件，2個(gè)位于啟動(dòng)子上游，另2個(gè)位于外顯子1和2之間，它們分別負(fù)責(zé)不同組織特異性的yellow基因的表達(dá)。將含有絕緣子的果蠅逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子gypsy依次分別插入每個(gè)增強(qiáng)子元件的附近，絕緣子對增強(qiáng)子的阻隔效應(yīng)依位置不同而異:1)如果插入位置在啟動(dòng)子的5’方向，將影響絕緣子上游增強(qiáng)子元件的作用。2)如果插入位置在啟動(dòng)子的3’方向，只影響下游增強(qiáng)子元件的功能。3)

如果插入位置不在增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間，絕緣子對增強(qiáng)子無阻隔效應(yīng)。第24頁/共93頁

絕緣子（2）第25頁/共93頁

絕緣子結(jié)合蛋白（CTCF）（1）第26頁/共93頁

絕緣子DNA結(jié)合蛋白一種DNA-結(jié)合蛋白CTCF(CCCTC-bindingfactor,CCCTC結(jié)合因子)可專一性與該42bp順序結(jié)合。CTCF已在其它實(shí)驗(yàn)中被證明參與基因的轉(zhuǎn)錄激活與沉默，是一個(gè)含有11個(gè)鋅指的分子量為82kD的蛋白質(zhì)。人體T細(xì)胞受體α/δ座位及爪蟾（Xenopus）RO(repeatorganizer,重復(fù)順序組織者)rRNA基因調(diào)控區(qū)絕緣子均有保守的CTCF結(jié)合位點(diǎn)(Bell,2001)。這些在進(jìn)化上處于不同地位的物種中廣泛存在絕緣子的現(xiàn)象表明，以絕緣子界定增強(qiáng)子的作用范圍是真核基因組一種普遍的控制基因活性的機(jī)制第27頁/共93頁絕緣子與果蠅BX-C基因調(diào)控第28頁/共93頁果蠅腹節(jié)模式?jīng)Q定區(qū)中的絕緣子第29頁/共93頁染色質(zhì)修飾與重建第30頁/共93頁

增強(qiáng)子作用的DNA環(huán)化模型與絕緣子的關(guān)系第31頁/共93頁高等生物基因組普遍存在甲基化1)DNA分子的化學(xué)修飾主要是甲基化，脊椎動(dòng)物基因組中約60-80%雙核苷酸CpG的胞嘧啶(C)被甲基化。被子植物基因組中，甲基化位置主要出現(xiàn)在CpG和CpNpG回文對稱順序，大約20-30%的胞嘧啶(C)被甲基化。DNA的甲基化在基因的表達(dá)調(diào)控中起重要作用。2）基因組的甲基化模式可影響表型并能通過體細(xì)胞遺傳，但不該變細(xì)胞的基因型.

基因組的甲基化是表觀遺傳的重要內(nèi)容之一.3)基因組DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式,并與染色體重建(chromatinremodeling)有關(guān).第32頁/共93頁DNA去甲基化與肌肉細(xì)胞分化第33頁/共93頁基因組DNA甲基化的生物學(xué)1）細(xì)胞命運(yùn)的確定與基因組DNA的甲基化狀態(tài)有關(guān)；2）DNA甲基化是決定基因表達(dá)模式的重要因素；3）DNA甲基化模式可以在上下代細(xì)胞之間傳遞；4）DNA甲基化只限于堿基的修飾，并不改變DNA的順序組成。

第34頁/共93頁染色質(zhì)重建1)染色質(zhì)重建(chromatinremodeling)系指染色體結(jié)構(gòu)狀態(tài)的改變.染色質(zhì)重建可以是可逆的,也可以是不可逆的.2)染色質(zhì)重建涉及DNA的甲基化,組蛋白的乙?；腿ヒ阴；?3)染色質(zhì)重建的目的是使染色質(zhì)的物理狀態(tài)處于松弛或收縮,其結(jié)果使轉(zhuǎn)錄活化因子可接觸或不能接觸調(diào)控順序.第35頁/共93頁DNA甲基化與染色質(zhì)重建第36頁/共93頁siRNA可誘導(dǎo)異染色質(zhì)形成見:CurrentOpinioninCellBiology16:230-238,2004第37頁/共93頁siRNA介導(dǎo)的染色質(zhì)沉默第38頁/共93頁

DNA甲基化與轉(zhuǎn)座子活性第39頁/共93頁染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的不可逆變化與基因沉默在個(gè)體發(fā)育與細(xì)胞分化過程中，當(dāng)某些基因已經(jīng)完成預(yù)定的表達(dá)程序后必需永久性關(guān)閉。這一任務(wù)可以通過DNA甲基化促使染色質(zhì)的重建完成。Polycome:多結(jié)蛋白.第40頁/共93頁DNA甲基化抑制轉(zhuǎn)座第41頁/共93頁等位基因成員的非對稱表達(dá)1)二倍體基因組中每個(gè)等位基因均有兩個(gè)等位基因成員.2)二倍體每個(gè)等位基因成員的表達(dá)模式有三種:

母源基因表達(dá),父源基因表達(dá),兩個(gè)成員均表達(dá)3)有三種機(jī)制決定等位基因成員的非對稱表達(dá):1.X-染色體失活;2.基因組印記;3.隨機(jī)選擇.第42頁/共93頁基因組印記1)1991年TM.德切艾拉等報(bào)道,老鼠7號染色體上中有一個(gè)稱為類胰島素生長因子Igf2的基因(insulin-likegrowthfactorII),該基因的突變純合子表現(xiàn)為侏儒癥.在雜合子中,如果突變等位基因來自父親,表型異常.如果來自母親,表型正常,即母源Igf2基因在子代被抑制.2)這種因?yàn)橛H本來源不同而使等位基因表達(dá)模式發(fā)生改變的現(xiàn)象稱為印記(imprinting).它有兩個(gè)特點(diǎn):

1.子代的兩個(gè)等位基因中有一個(gè)發(fā)生沉默,即不表達(dá).2.哪一個(gè)等位基因沉默取決于等位基因的親本來源.

這是在哺乳動(dòng)物中最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳現(xiàn)像.隨后又在老鼠中發(fā)現(xiàn)另外一個(gè)基因,即7號染色體上與Igf2緊密連鎖的H19也有類似的情況,只是表現(xiàn)相反,即父源的H19等位基因在子代中不表達(dá),母源的H19基因在子代中正常表達(dá).

第43頁/共93頁基因組印記的分子機(jī)制第44頁/共93頁綿羊肥臀突變的遺傳符合典型的基因組印記模式In1996,ateamledbyCockettandGeorgesexplainedwhatwasgoingon:Onlylambsthatinheritthecallipygemutationfromtheirfather

butnottheirmotherdevelopthetrait.Allothercombinationsofnormalandcallipygechromosomesresultinnormalsheep.Theresearchersnamedtheeffectpolaroverdominance(極性超顯性效應(yīng)).見:TrendsinGenetics19:248-252,2003.第45頁/共93頁基因組印記的其它例子第46頁/共93頁DNA甲基化與基因組程序化

第47頁/共93頁受精胚與體細(xì)胞胚的發(fā)育差異哺乳動(dòng)物體細(xì)胞胚胎發(fā)與受精卵胚胎發(fā)育存在許多異.這些差異主要表現(xiàn)在體細(xì)胚與受精胚基因組的程序化.受精胚的雄核與雌核在去甲化的程序上存在時(shí)間差.甲化程序的差異會(huì)導(dǎo)致胎發(fā)育異常.第48頁/共93頁雙卵融合克隆小鼠

哺乳動(dòng)物均有基因組印記,因此哺乳動(dòng)物沒有孤雌生殖.只有將野生型H19基因和突變型H19基因的卵細(xì)胞融合才得到成體克隆鼠.見:Nature428:860-864,2004第49頁/共93頁劑量效應(yīng)1)劑量效應(yīng)系指具有兩份基因拷貝的個(gè)體和一份基因拷貝的個(gè)體在表現(xiàn)型上保持一致的機(jī)理.

2)多細(xì)胞生物中性別染色體在雌性和雄性細(xì)胞中的拷貝數(shù)不同,為平衡基因表達(dá)產(chǎn)物的數(shù)量,出現(xiàn)整條染色體被抑止或超激活現(xiàn)象.第50頁/共93頁染色體劑量效應(yīng)染色體劑量效應(yīng)可通過基因的上調(diào)或下調(diào)形式達(dá)到:1)哺乳動(dòng)物雌性一條X-染色體失活,形成Barr小體;2)果蠅雄性X-染色體超表達(dá)以達(dá)到平衡;3)線蟲雌性一條X-染色體低表達(dá).第51頁/共93頁X

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染色體失活機(jī)制雌性老鼠在胚胎早期兩個(gè)XIST等位基因低水平表達(dá),但RNA產(chǎn)物不穩(wěn)定,并與其編碼基因結(jié)合.隨著發(fā)育進(jìn)行,其中一個(gè)XIST基因的表達(dá)逐步穩(wěn)定最終覆蓋了其所在的整個(gè)X-染色體.另一X-染色體上的XIST基因則隨之因啟動(dòng)子甲基化而關(guān)閉.選擇那條X-染色體失活是一個(gè)隨機(jī)的過程.第52頁/共93頁干細(xì)胞與表觀遺傳第53頁/共93頁人類皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成

胚胎多能干細(xì)胞美日兩國研究小組2007年11月20日分別在兩家權(quán)威科學(xué)雜志發(fā)表相關(guān)研究報(bào)告,宣稱成功將人類皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成多能干細(xì)胞,即iPS(inducedpluripotentstem)

。美國威斯康星大學(xué)詹姆斯·湯姆森實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)表在《科學(xué)》雜志，而日本京都大學(xué)教授山中伸彌領(lǐng)導(dǎo)的研究小組把報(bào)告發(fā)表在《細(xì)胞》雜志。兩個(gè)小組的研究方法和原理大同小異。山中伸彌研究小組從一名36歲女性的臉部提取了科學(xué)家稱為纖維原細(xì)胞的皮膚細(xì)胞。詹姆斯·湯姆森實(shí)驗(yàn)室的皮膚細(xì)胞來自一名新生兒的陰莖包皮細(xì)胞。詹姆斯·湯姆森實(shí)驗(yàn)室的旅美華人女科學(xué)家俞君英參與了這次皮膚干細(xì)胞的研究。學(xué)界評價(jià)這一突破可能意味著風(fēng)靡一時(shí)的胚胎干細(xì)胞克隆技術(shù)將退出舞臺。

第54頁/共93頁俞君英在湯姆森實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行

有關(guān)干細(xì)胞的試驗(yàn)

第55頁/共93頁基因組程序化與胚胎干細(xì)胞1)什么是胚胎干細(xì)胞?2)胚胎干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)意義3)如何獲取胚胎干細(xì)胞?4)人類胚胎干細(xì)胞獲取的困難5)從人體體細(xì)胞誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的可能性6)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞重新程序化(reprogramming)第56頁/共93頁人類iPS細(xì)胞的培育過程1)篩選與克隆控制胚胎干細(xì)胞基因組重新程序化的基因.2)把4種基因注入皮膚細(xì)胞，這些特定基因能夠“重組”皮膚細(xì)胞的基因.3)將普通人體皮膚細(xì)胞成功改造成干細(xì)胞.4)培育器官從理論上講，這種干細(xì)胞的功能類似通過胚胎克隆技術(shù)取得的胚胎干細(xì)胞，能夠最終培育成人體組織或器官.

第57頁/共93頁靈長類胚胎干細(xì)胞ThomsonJA對靈長類胚胎干細(xì)胞所給出的定義特征如下:1)來自未植入子宮之前的胚胎;2)可以無限保持未分化及增生狀態(tài);3)即使在培養(yǎng)之后仍然可以穩(wěn)定地發(fā)育成胚胎的三個(gè)胚層,具有多向分化的潛能.見:Science282,1998第58頁/共93頁胚胎的特征及發(fā)育第59頁/共93頁全能性干細(xì)胞所應(yīng)具有的特征1)來源于一個(gè)全能性的細(xì)胞群體;2)具有正常的細(xì)胞核型;3)具永生性,半場在胚胎狀態(tài)下能無限制的分裂;4）培養(yǎng)的細(xì)胞株在體外或在畸胎瘤中能自發(fā)分化成胚胎外組織（extraembryonictissues）和分屬所有3種胚層的體細(xì)胞此前所有已培養(yǎng)成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，除小鼠外，靈長類動(dòng)物ES細(xì)胞只滿足上述4條標(biāo)準(zhǔn)的前3條。

第60頁/共93頁體細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)成為胚胎干細(xì)胞1)就基因組的遺傳信息組成而言,每個(gè)體細(xì)胞都具備潛在的可能.2)因?yàn)轶w細(xì)胞是胚胎發(fā)育與形態(tài)建成的終極產(chǎn)物,自然狀態(tài)下這是一個(gè)屗可逆的過程3)胚胎發(fā)生與細(xì)胞分化是基因組程序化的結(jié)果,體細(xì)胞要逆轉(zhuǎn)為胚胎干細(xì)胞必需重新程序化.4)因體細(xì)胞核移植到卵細(xì)胞中可以獲得類似自然受精發(fā)育的胚胎,在卵細(xì)胞中必定存在使基因組重新程序化的因子.5)將基因組重新程序化的因子導(dǎo)入體細(xì)胞可以使體細(xì)胞命運(yùn)逆轉(zhuǎn),產(chǎn)生具有多能分化的干細(xì)胞.第61頁/共93頁幾個(gè)關(guān)鍵的步驟1)基因組重新程序化基因的篩選2)基因組重新程序化基因的轉(zhuǎn)化3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選與鑒定4)iPS細(xì)胞的功能驗(yàn)證第62頁/共93頁常規(guī)胚胎干細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)第63頁/共93頁誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

胚胎干細(xì)胞1)根據(jù)核移植可以判斷卵細(xì)胞中含有促使體細(xì)胞基因組重新程序化的因子.2)胚胎干細(xì)胞可以持續(xù)維持多能分化的潛力,表明有控制胚胎干細(xì)胞屬性(identity)的遺傳因素.3)分離與鑒定與胚胎干細(xì)胞生成與維持的基因是逆轉(zhuǎn)體細(xì)胞程序化的前提.第64頁/共93頁尋找決定胚胎干細(xì)胞命運(yùn)的基因1)Yamanaka等選擇24個(gè)在胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因作為胚胎干細(xì)胞決定候選基因.2)將上述基因構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體中,它們處于Fbx15基因的調(diào)控順序下游,并將它們轉(zhuǎn)化老鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF).3)Fbx15基因是胚胎干細(xì)胞專一性表達(dá)的.4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)單個(gè)外源基因的導(dǎo)入不能獲得胚胎成纖維細(xì)胞的逆轉(zhuǎn),但組合的轉(zhuǎn)化可產(chǎn)生具有胚胎干細(xì)胞形態(tài)特征的細(xì)胞,這些細(xì)胞被稱為iPS(inducedpluripotentstem)細(xì)胞.見:Cell126:663-676,2006第65頁/共93頁胚胎干細(xì)胞命運(yùn)決定基因篩選策略第66頁/共93頁胚胎干細(xì)胞決定基因的篩選1)上述小組在10個(gè)基因組合產(chǎn)生MEF細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)上,采取排除法確定4個(gè)基因?yàn)镸EF細(xì)胞逆轉(zhuǎn)所必需,分別為:Oct3/4,Klf4,Sox2和c-Myc.2)在這初篩的4個(gè)基因中任意缺失一個(gè)基因,均不能產(chǎn)生類胚胎干細(xì)的特征.因此這4個(gè)基因是最低要求的逆轉(zhuǎn)MEF細(xì)胞的因子.3)Oct3/4,Klf4,Sox2和c-Myc四個(gè)基因轉(zhuǎn)化的MEF細(xì)胞可促使Fbx15和Nanog基因的表達(dá).4)Fbx15和Nanog基因的表達(dá)可作為篩選iPS細(xì)胞的標(biāo)記.第67頁/共93頁iPS細(xì)胞功能的驗(yàn)證1)iPS-MEF細(xì)胞系具有類似天然胚胎干細(xì)胞的形態(tài)特征.2)iPS-MEF細(xì)胞系的Oct3/4和Nanog基因的啟動(dòng)子區(qū)核小體組蛋白的乙?；蚄9的甲基化以及CpG雙堿基甲基化模式與胚胎干細(xì)胞類似.3)iPS-MEF細(xì)胞系的DNA芯片雜交檢測基因表達(dá)譜也與胚胎干細(xì)胞類似.4)將iPS-MEF細(xì)胞系注入到裸鼠皮下細(xì)胞可產(chǎn)生畸胎瘤,表明具有胚胎干細(xì)胞特征.第68頁/共93頁iPS-MEF具多向分化潛能將iPS-MEF轉(zhuǎn)化細(xì)胞注入到裸鼠皮下組織后可產(chǎn)生的畸胎瘤含有不同的組織細(xì)胞,具多向分化潛能.第69頁/共93頁逆轉(zhuǎn)的老鼠胚胎成纖維細(xì)胞具多向分化潛能第70頁/共93頁Nanog更適合iPS細(xì)胞篩選因?yàn)橐訤bx15為標(biāo)記篩選的iPS-MEF與天然老鼠囊胚混合后不能生成嵌合成體,其胚胎干細(xì)胞潛能競爭力差.實(shí)驗(yàn)證明Nanog更適合.第71頁/共93頁Nanog

更適合iPS

細(xì)胞篩選以Nanog為標(biāo)記的篩選可獲得具有細(xì)胞增生的iPS及畸胎瘤分化的胚胎干細(xì)胞.第72頁/共93頁轉(zhuǎn)化人類皮膚細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞Yu等的研究如下:1)選擇14個(gè)涉及胚胎干細(xì)胞形成與維持相關(guān)的基因構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中轉(zhuǎn)化體細(xì)胞.2)根據(jù)不同的基因組合轉(zhuǎn)化體細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞效果,確定4個(gè)基因即Oct4,Sox2,Nanog和Lin28足以轉(zhuǎn)化體細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞.3)由人類皮膚體細(xì)轉(zhuǎn)化為胚胎干細(xì)胞的驗(yàn)證.第73頁/共93頁由人類皮膚體細(xì)轉(zhuǎn)化為

胚胎干細(xì)胞的驗(yàn)證1)iPS細(xì)胞具有人類自然胚胎干細(xì)胞的形態(tài).2)iPS細(xì)胞具有正常的核型.3)具端粒酶活性.4)細(xì)胞表面膜蛋白標(biāo)記與自然胚胎干細(xì)胞相同.5)基因表達(dá)譜相一致.6)Oct4啟動(dòng)子甲基化模式與自然胚胎干細(xì)胞相似.7)具有發(fā)育成三胚層細(xì)胞的潛能,來自iPS細(xì)胞的畸胎瘤可分化為多種組織細(xì)胞.第74頁/共93頁畸胎瘤的分化iPS細(xì)胞系接種到裸鼠肌肉組織產(chǎn)生畸胎瘤并分化出不同的組織細(xì)胞:左,神經(jīng)細(xì)胞,內(nèi)胚層發(fā)育;右,腸道細(xì)胞,內(nèi)胚層發(fā)育.第75頁/共93頁iPS細(xì)胞具有癌癥傾向1)iPS細(xì)胞可與天然小鼠胚胎囊胚期細(xì)胞混合并參于胚胎發(fā)育長成成年個(gè)體.2)含有iPS來源的小鼠個(gè)體有一定的比例產(chǎn)生癌癥.3)產(chǎn)生癌癥的原因:1,LTR載體的影響;2,

c-Myc基因具有癌變的潛能.4)路漫漫兮其修遠(yuǎn),……….第76頁/共93頁產(chǎn)生iPS

細(xì)胞的多種方法NatureBiotechnology,26:1246,2008第77頁/共93頁干細(xì)胞重新程序化方法比較第78頁/共93頁染色質(zhì)重建與基因轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)錄時(shí)要以編碼DNA為模板合成mRNA前體,但DNA分子纏繞在核小體上,因此必需使DNA離開核小體.第79頁/共93頁染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)第80頁/共93頁染色質(zhì)重建依賴于組蛋白的修飾1)核小體的修飾是染色質(zhì)水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的中心環(huán)節(jié).2)核小體修飾的目的是促使核小體核心8聚體與DNA分子的結(jié)合或者松弛或者強(qiáng)化,便于核小體移動(dòng)