分子生物學常用檢測技術

第一頁，共29頁。DNA—四種核苷酸（A-T-C-G)組成的多聚骨架所有組成DNA的核苷酸dATP,dTTP,dCTP,dGTP都由三種成分組成：1）一個2’-脫氧核糖（戊糖）2）一個含氮堿基嘌呤：A\G嘧啶：T/C3）三個磷酸基團各單個核苷酸由5’和3’-碳形成的磷酸二酯鍵連接在一起第二頁，共29頁。變性、復性、退火和淬火第三頁，共29頁?；虻谒捻?，共29頁。分子生物學常用技術

PCR（聚合酶鏈式反應）核酸分子雜交基因芯片技術(biochip)DNA測序（DNAsequencing）DNA重組技術(DNArecombination)第五頁，共29頁。

一、聚合酶鏈反應

（PolymeraseChainReaction，PCR）體外基因擴增技術

特異性強靈敏度高操作簡單、省時對待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率的基因擴增技術第六頁，共29頁。（一）PCR原理原理雙鏈DNA變性

退火鏈延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復第七頁，共29頁。PCR反應體系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq

DNA聚合酶模板引物

和或和（二）PCR反應的設計及影響因素第八頁，共29頁。PCR的種類熒光定量PCR通用引物PCR多重PCR巢式PCRRT-PCR原位PCR免疫PCR……第九頁，共29頁。TaqMan探針reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'熒光定量PCR第十頁，共29頁。定量PCR的數(shù)學原理PCR理論方程N=N0x(1+E)nN：擴增數(shù)量N0：起始模板數(shù)量E：擴增效率N：循環(huán)數(shù)

Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長期Linear平臺期Plateauy=

N0(1+e)n指數(shù)增長期Geometric第十一頁，共29頁。定量PCR的數(shù)學原理Rn(熒光強度)循環(huán)數(shù)CycleNumber指數(shù)增長期平臺期CT=-klogN0+bCt

（Cyclethreshold）值：是指每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定域值（threshold）時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。第十二頁，共29頁。PCR的臨床應用對病原微生物核酸進行快速檢測彌補免疫檢測的缺陷縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）用于藥物療效監(jiān)測和評估用于腫瘤基因表達方面的研究用于遺傳病的診斷第十三頁，共29頁。樣本采集要求第十四頁，共29頁。第十五頁，共29頁。二、核酸分子雜交根據(jù)核酸變性和復性的原理，不同來源的變性單鏈核酸分子在合適的條件下，通過堿基互補形成雙鏈雜交體的過程稱為核酸分子雜交（molecularhybridization）。第十六頁，共29頁。1、遺傳病的診斷2、病原體的鑒定3、癌基因突變的檢測4、組織配型5、親子鑒定核酸分子雜交的臨床應用第十七頁，共29頁。三、基因芯片技術基質(zhì)材料分，有尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等。第十八頁，共29頁。

用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列原位合成法在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列第十九頁，共29頁?；蛐酒夹g的應用1、藥物篩選和新藥開發(fā)2、疾病診斷3、環(huán)境保護4、司法5、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)第二十頁，共29頁。四、測序技術CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT（一）一代測序技術第二十一頁，共29頁。（二）二代測序技術Illumina公司的Solexa和Hiseq應該說是目前全球使用量最大的第二代測序機器，這兩個系列的技術核心原理是相同的。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎上，通過技術創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。第二十二頁，共29頁。第二十三頁，共29頁。技術特點比較第一代測序技術的主要特點是測序讀長可達1000bp，準確性高達99.999%，但其測序成本高，通量低等方面的缺點，嚴重影響了其真正大規(guī)模的應用。第二代測序技術大大降低了測序成本的同時，還大幅提高了測序速度，并且保持了高準確性，但在序列讀長方面比起第一代測序技術則要短很多。第二十四頁，共29頁。五、基因重組技術基因重組是指一個基因的DNA序列是由兩個或兩個以上的親本DNA組合起來的。基因重組是遺傳的基本現(xiàn)象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重組現(xiàn)象。第二十五頁，共29頁。轉(zhuǎn)基因植物

（抗蟲、抗凍、抗病、高產(chǎn)）轉(zhuǎn)基因動物基因工程藥物和疫苗基因治療基因重組技術的應用第二十六頁，共29頁。小結(jié)疾病的診斷感染性疾病診斷腫瘤性疾病診斷遺傳性疾病診斷組織配型