臨床免疫學(xué)凝集反應(yīng)

第五章凝集反響本章考點(diǎn)概述直接凝集反響間接凝集反響第一節(jié)概述細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆?？乖蚩扇苄钥乖不蚩贵w〕與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，它們與相應(yīng)抗體〔或抗原〕在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，稱(chēng)凝集反響。凝集反響分為兩個(gè)階段：①抗原抗體的特異性結(jié)合；②消滅可見(jiàn)的顆粒分散。凝集反響的特點(diǎn)：凝集試驗(yàn)是一個(gè)定性的檢測(cè)方法，即依據(jù)凝集現(xiàn)象的消滅與否判定結(jié)果陰性或陽(yáng)性；也可以進(jìn)展半定量檢測(cè)，馬上抗體作一系列稀釋?zhuān)c抗原結(jié)合產(chǎn)生凝集的最高稀釋倍數(shù)作為其效價(jià)或滴度。由于凝集反響靈敏度高、方法簡(jiǎn)便，因而在臨床檢驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。其次節(jié)直接凝集反響直接凝集反響：其原理是細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合消滅凝集，稱(chēng)直接凝集反響。參與凝集反響的抗原稱(chēng)凝集原，抗體則稱(chēng)為凝集素。從方法上來(lái)講，有玻片法和試管法兩類(lèi)。人類(lèi)AB0。試管凝集反響是用定量抗原懸液與一系列遞度倍比稀釋的待檢血清混合，保溫靜置后，依據(jù)每管內(nèi)顆粒凝集的程度，以推斷待檢血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其效價(jià)，可以用來(lái)幫助臨床診斷或流行病原調(diào)查爭(zhēng)論。WidalWell-Felix。第三節(jié)間接凝集反響間接凝集反響是將可溶性抗原〔或抗體〕先吸附于適當(dāng)大小的顆粒載體外表，然后與相應(yīng)抗體〔或抗原〕作用，在適宜電解質(zhì)存在的條件下，消滅特異性凝集現(xiàn)象，稱(chēng)間接凝集反響。依據(jù)致敏載體用的是抗原或抗體以及凝集反響的方式，間接凝集反響分為4類(lèi)：①正向間接凝集反響；②反向間接凝集反響；③間接凝集抑制反響；④協(xié)同凝集反響。14〔正向〕間接凝集反響〔查抗體〕15〔反向〕間接凝集反響〔查抗原〕16間接凝集抑制試驗(yàn)〔查抗原〕〔上圖為標(biāo)本中含有待測(cè)抗原，以以下圖為標(biāo)本中無(wú)待測(cè)抗原，留意凝集說(shuō)明標(biāo)本中沒(méi)有待測(cè)抗原〕間接凝集反響適用于各種抗體和可溶性抗原的檢測(cè)。以載體來(lái)分，常用的為紅細(xì)胞、膠乳顆粒及明膠顆粒等。常用的試驗(yàn)有：間接血凝試驗(yàn)：其原理是將抗原〔或〕抗體包被于紅細(xì)胞外表，成為致敏載體，然后與相應(yīng)的抗體〔或抗原〕結(jié)合，從而使紅細(xì)胞被動(dòng)地分散在一起，消滅可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。間接血凝試驗(yàn)可分為三類(lèi)：①紅細(xì)胞包被抗原，用以檢測(cè)抗體的血凝〔PHA〕；②紅細(xì)胞包被抗體，用以檢測(cè)抗原的血凝反響，稱(chēng)為反向間接血凝反響〔RPHA〕；③先將可溶性抗原〔或抗體〕與相應(yīng)的抗體〔或抗原〕混合然后再參與抗原〔或抗體〕致敏的紅細(xì)胞，則能抑制原先的血凝現(xiàn)象，稱(chēng)為正向〔或反向〕間接血凝抑制試驗(yàn)。間接血凝抑制試驗(yàn)可用于檢測(cè)抗體、自身抗體、變態(tài)反響性抗體，也可測(cè)定抗原。間接血凝試驗(yàn)—：紅細(xì)胞沉積于管底；1+：紅細(xì)胞沉積于管底，四周有散在少量凝集；2+：紅細(xì)胞形成片層凝集，面積較小，邊緣較松散；3+：紅細(xì)胞形成片層凝集，面積多于2+；4+：紅細(xì)胞形成片層凝集，均勻布滿孔底，或邊緣皺縮如花邊狀。膠乳凝集試驗(yàn)：膠乳凝集試驗(yàn)也是一種間接凝集試驗(yàn)，所用載體為聚苯乙烯膠乳，是一種直徑約為0.8μm大小的圓形顆粒，帶有負(fù)電荷，可物理性吸附蛋白分子，但這種結(jié)合結(jié)實(shí)性差。膠乳凝集試驗(yàn)分試管法和玻片法兩種。膠乳凝集試驗(yàn)用于檢測(cè)抗溶血素O、RF明膠凝集試驗(yàn)：將全病毒抗原及重組抗原吸附在粉紅色明膠顆粒上，來(lái)檢測(cè)相應(yīng)抗體。間接凝集反響具有快速、敏感、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需特別的試驗(yàn)設(shè)備等特點(diǎn)，而且能用于抗原或抗體的測(cè)定，因此在臨床檢驗(yàn)中廣為應(yīng)用。抗原的檢測(cè)：反向間接凝集試驗(yàn)用于檢測(cè)病原體可溶性抗原，也可用于檢測(cè)各種蛋白質(zhì)成分?？贵w的檢測(cè)：可用于檢測(cè)細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等感染后產(chǎn)生的抗體，例如間接凝集試驗(yàn)或明膠顆〔HIV〕O等。第四節(jié)自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)其根本原理是抗人O型紅細(xì)胞的單克隆抗體能與任何種血型的紅細(xì)胞結(jié)合，但不引起凝集反響，這種抗體與另一特異性抗體連接成的雙功能抗體，可用于檢測(cè)標(biāo)本中的抗原；如與特異性抗原連接，則可用于檢測(cè)標(biāo)本中的抗體。這一試驗(yàn)與上述血凝試驗(yàn)的區(qū)分在于反響中的紅細(xì)胞是未經(jīng)致敏的受檢者穎紅細(xì)胞，因HIVHBsAg相仿。第五節(jié)抗人球蛋白參與的血凝試驗(yàn)抗人球蛋白參與的血凝試驗(yàn)，稱(chēng)Coombs試驗(yàn)，是檢測(cè)抗紅細(xì)胞不完全抗體的一種很有用的方法。包括Coombs試驗(yàn)和間接CoombsCoombs試驗(yàn)除廣泛應(yīng)用于血液病的檢測(cè)，如自身免疫性溶血性貧血、藥物誘導(dǎo)的溶血、生兒溶血癥等。還可承受專(zhuān)一特異性的抗球蛋白的血清如抗IgG血清、抗IgA或抗IgM于紅細(xì)胞上的不完全抗體的免疫球蛋白亞類(lèi)。18Coombs〔上圖為直接試驗(yàn)，以以下圖為間接試驗(yàn)〕29ABOA.正向間接凝集反響B(tài).反向間接凝集反響C.玻片凝集法D.試管凝集法E.間接凝集抑制反響500734050101]『正確答案』C〔屬于直接凝集反響〕30外裴試驗(yàn)最常承受的方法是A.正向間接凝集反響B(tài).反向間接凝集反響C.玻片凝集反響D.試管凝集法E.間接凝集抑制反響500734050102]『正確答案』D31SPAA.IgMB.IgGC.IgAD.IgEE.IgD500734050103]『正確答案』B『答案解析』SPAA〔SPA〕SPA具有與IgGFc因此當(dāng)這種葡萄球菌與IgG抗體連接時(shí)，就成為抗體致敏的顆粒載體。如與相應(yīng)抗原接觸，即消滅反向間接凝集反響。32以下有關(guān)協(xié)同凝集試驗(yàn)中的表達(dá)中，錯(cuò)誤的選項(xiàng)是屬于間接凝集反響以金黃色葡萄球菌作為顆粒性載體菌體的細(xì)胞壁中含有SPA，可與IgG特異性結(jié)合D.IgGFabE.主要應(yīng)用于可溶性抗原的檢出500734050104]『正確答案』D33-1不能促使凝集現(xiàn)象消滅的措施是A.增加溶液離子強(qiáng)度B.增加溶液的粘度C.增加蛋白質(zhì)或電解質(zhì)D.通過(guò)離心使復(fù)合物沉沉E.降低溶液離子強(qiáng)度500734050105]『正確答案』A『答案解析』除了A之外，其他措施均可促使凝集現(xiàn)象的消滅。此題超出教材內(nèi)容。33-2凝集試驗(yàn)中，為促成凝集現(xiàn)象消滅，可承受多種方法，但不包括A.增加溶液離子強(qiáng)度B.增加蛋白質(zhì)或電解質(zhì)C.增加溶液粘度D.用胰酶或神經(jīng)胺酸酶處理E.離心使復(fù)合物沉淀500734050106]『正確答案』A34IgGIgGA.抗體親和力不夠B.分子量太小C.不能同時(shí)連接兩個(gè)紅細(xì)胞D.抗體分子數(shù)量太少E.特異性不強(qiáng)500734050107]『正確答案』B『答案解析』參與直接凝集反響的抗體主要是IgM抗體，它是五價(jià)的，分子量大；而IgG是二價(jià)的，分子量小。第六章沉淀反響本章考點(diǎn)概念液相內(nèi)沉淀反響凝膠內(nèi)沉淀反響免疫濁度法概念：沉淀反響是可溶性抗原與相應(yīng)抗體在特定條件下特異性結(jié)合所消滅的沉淀現(xiàn)象。第一節(jié)沉淀反響的特點(diǎn)沉淀反響中的抗原多為蛋白質(zhì)、多糖、血清、毒素等可溶性物質(zhì)。沉淀反響分兩個(gè)階段，第一階段為抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，幾秒到幾十秒即可完成，消滅可溶性小復(fù)合物，肉眼不行見(jiàn)；其次階段為形成可見(jiàn)的免疫復(fù)合物，約需幾格外鐘到數(shù)小時(shí)才能完成。如沉淀線、沉淀環(huán)。19兩種抗血清形成的沉淀帶其次節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)一、絮狀沉淀試驗(yàn)抗原抗體溶液在電解質(zhì)的存在下結(jié)合，形成絮狀沉淀物，這種絮狀沉淀受抗原和抗體比例的直接影響，因此產(chǎn)生最適比例的測(cè)定方法，常見(jiàn)有：抗原稀釋法：抗原進(jìn)展一系列稀釋與恒定濃度抗血清反響?？贵w稀釋法：抗體進(jìn)展一系列稀釋與恒定濃度抗原反響。為了保證抗原抗體在最適比例條件下進(jìn)展反響，到達(dá)最大沉淀反響的效果，就必需對(duì)抗原和抗體最正確工作濃度做出選擇。將上述我們講過(guò)的抗原稀釋法和抗體稀釋法結(jié)合起來(lái)就是方陣滴定法，又稱(chēng)為棋盤(pán)格法。從上表中可以看出，Ab1：40Ag1：320Ag1：160稀釋?zhuān)瑒tAb1：20又如在進(jìn)展ELISA試驗(yàn)時(shí)，反響試劑多，其工作濃度不同對(duì)結(jié)果影響較大，因此必需對(duì)包被抗原〔抗體〕和酶標(biāo)抗體〔抗原〕進(jìn)展最正確工作濃度的滴定和選擇，以到達(dá)最正確的測(cè)定條件，同樣需要承受方陣滴定法進(jìn)展試驗(yàn)找出抗原和抗體最正確稀釋度。二、免疫濁度法免疫濁度法本質(zhì)上屬于液體內(nèi)沉淀反響，其特點(diǎn)是將現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器、自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)和免疫沉淀反響相結(jié)合，可進(jìn)展液體中微量抗原、抗體及小分子半抗原定量檢測(cè)?！惨弧趁庖邼岫确ㄔ懋?dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體在兩者比例適宜時(shí)，抗原抗體在特別緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反響液消滅濁度，如形成的復(fù)合物增加，反響液的濁度隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品比照，即可計(jì)算出受檢物的含量。依據(jù)儀器設(shè)計(jì)的不同分為透射比濁儀測(cè)定法和散射比濁儀測(cè)定法。測(cè)定方法又可分為速率法和終點(diǎn)法。免疫透射比濁法：依據(jù)郎伯-比爾〔Lambert-Beer〕定律，當(dāng)光線通過(guò)抗原抗體反響系統(tǒng)時(shí)，由于溶液中存在抗原抗體復(fù)合物，光線被吸取。吸取的量和復(fù)合物的量成正比。利用透射比濁儀測(cè)量出由于反射、吸取或散射引起的入射光衰減，其濁度以吸光度AAC：溶液濃度K：常數(shù)或cdc：分子吸光系數(shù)d：光路長(zhǎng)通常依據(jù)免疫比濁原理取多點(diǎn)〔3～9〕，按Y=a+bx+cx2+dx33量-反響曲線。免疫透射比濁法快速，測(cè)量可進(jìn)展自動(dòng)化，常用于臨床體液蛋白的檢測(cè)。免疫速率散射比濁法：20-2散射免疫濁度法及透射免疫濁度法示意圖其原理是指確定波長(zhǎng)的光通過(guò)溶液遇到抗原抗體復(fù)合物時(shí)，光線被折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)。偏轉(zhuǎn)角度可以從0-90°，這種偏轉(zhuǎn)的角度可因光線的波長(zhǎng)和復(fù)合物大小不同而有所區(qū)分。散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比，即待測(cè)抗原越多，形成的復(fù)合物也越多，散射光也越強(qiáng)。同時(shí)也和散射夾角成正比，和波長(zhǎng)呈反比。測(cè)定方法有終點(diǎn)法和速率法兩種。30-60min，復(fù)合物濁度不再受時(shí)間的影響，但又必需在聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前進(jìn)展?jié)岫葴y(cè)定。速率法是測(cè)最大反響的速度，即反響到達(dá)頂峰時(shí)的峰值。抗原抗體結(jié)合反響在幾十秒內(nèi)得出結(jié)果，峰值的凹凸與抗原的量成正比，峰值消滅的時(shí)間和抗體濃度、抗原抗體的親和力直接相關(guān)。速率法的靈敏度和特異性都比終點(diǎn)法好。但是，必需指出的是對(duì)免疫濁度法存在難以抑制的鉤狀效應(yīng)。即在定量抗體中參與抗原量到達(dá)最正確比例時(shí)，形成的IC量最大，反響速度最快。如連續(xù)參與抗原，形成IC的量不但不再增加，反而削減；反之，在定量抗原中參與抗體，在抗體過(guò)量時(shí)也會(huì)產(chǎn)生同樣的現(xiàn)象。這種后帶〔抗原過(guò)量〕和前帶〔抗體過(guò)量〕，統(tǒng)稱(chēng)為鉤狀效應(yīng)〔hookeffect〕。鉤狀效應(yīng)可以產(chǎn)生假象的弱陽(yáng)性或假陰性結(jié)果?！捕撑c免疫濁度法測(cè)定親熱相關(guān)的因素有：抗原與抗體的比例：抱負(fù)狀態(tài)是抗原與抗體比例適宜全部結(jié)合，事實(shí)上有困難，依據(jù)Heidelberger曲線理論，反響液中保持抗體過(guò)量時(shí)，復(fù)合物隨抗原量的增加遞增至抗原與抗體兩者比例最適宜時(shí)達(dá)頂峰，因此免疫濁度法中保持抗體過(guò)量；抗體的質(zhì)量：應(yīng)是特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力強(qiáng)、并使用R型抗血清；抗原抗體反響的溶液：關(guān)鍵是pH及離子種類(lèi)，通常用磷酸鹽緩沖液作反響液；增濁劑的應(yīng)用：通常用非離子型親水劑，如聚乙二醇〔PEG〕、吐溫-20等。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)是利用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠內(nèi)集中，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢?jiàn)的沉淀線或沉淀環(huán)。凝膠支持物的種類(lèi)：凝膠支持物的種類(lèi)有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠等。不同分子量的物質(zhì)在凝膠中集中速度不同，藉此可用以識(shí)別不同待測(cè)物分子量的差異。單向集中試驗(yàn)：瓊脂內(nèi)混入抗體，待測(cè)抗原從局部向瓊脂內(nèi)自由集中，如抗原和相應(yīng)抗體結(jié)合，則形成沉淀環(huán)。試管法：將確定量的抗體混入0.7%瓊脂糖溶液中，注入小試管內(nèi)，上層加抗原溶液使待測(cè)抗原在凝膠中自由集中，在抗原抗體比例恰當(dāng)位置形成沉淀環(huán)。平板法：是將抗體或抗血清混入0.9%瓊脂糖內(nèi)，未凝固前傾注成平板，然后在上打孔，將抗原參與37℃讓其自由集中，24～48h后可見(jiàn)孔四周消滅沉淀環(huán)，測(cè)定環(huán)的直徑或面積計(jì)算標(biāo)本中待測(cè)抗原的濃度。有兩種計(jì)算方法：1〕Mancini曲線：適用大分子抗原的和長(zhǎng)時(shí)間集中〔>48h〕的結(jié)果，沉淀環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系c／d2=k。〔cdk〕52〔消滅明顯集中環(huán)〕2〕Fahey曲線：適用于小分子抗原和較短時(shí)間集中的結(jié)果處理，用半對(duì)數(shù)紙劃線，濃度對(duì)數(shù)與集中環(huán)直徑呈線性關(guān)系logc／d=k。〔其中cdk〕單向集中試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)的留意點(diǎn)：抗血清必需特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力強(qiáng)，在良好條件下保存。每次測(cè)定都必需作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次測(cè)定時(shí)必需用質(zhì)控血清作質(zhì)控。留意雙環(huán)現(xiàn)象〔消滅了兩種抗原性一樣成分〕。應(yīng)用單克隆抗體測(cè)量多態(tài)性抗原時(shí)，測(cè)定值偏低；用多克隆抗體測(cè)量單克隆病時(shí)，測(cè)定值偏高。雙向集中試驗(yàn)：在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ郊?，在最恰?dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線，依據(jù)沉淀線的位置、外形以及比照關(guān)系，可對(duì)抗原或抗體作出定性分析。雙向集中試驗(yàn)也分為試管法和平板法。試管法：在含有抗原的溶液和含有抗體瓊脂中間，加一層一般瓊脂，讓下層抗體和上層抗原向中間自由集中，在抗原、抗體濃度最適時(shí)形成沉淀線。平板法：是在瓊脂板上相距3～5mm打一對(duì)孔，或者梅花孔、雙排孔、三角孔等。在相應(yīng)孔中參與抗原或抗體，待其自由集中后，抗原、抗體形成可見(jiàn)的沉淀線。依據(jù)沉淀線的位置可作如下分析：①抗原、抗體是否存在及其相對(duì)含量。一般沉淀線靠近抗原孔，提示抗體量大，沉淀線靠近抗體孔，提示抗原量大。②抗原、抗體相對(duì)分子量的分析；抗原或抗體在瓊脂內(nèi)自由集中，其速度受分子量影響。分子量小者，集中快，反之較慢。由于慢者集中圈小，局部濃度較大，形成沉淀線彎向分子量大的一方。如假設(shè)兩者分子量相等，則形成直線。