血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定

關(guān)于血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定第一頁，共十四頁，編輯于2023年，星期三【目的要求】1.掌握血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的基本原理。2.熟悉血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的具體操作方法。3.了解血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的臨床意義。第二頁，共十四頁，編輯于2023年，星期三【實(shí)驗(yàn)原理】

ALT催化丙氨酸與α-酮戊二酸之間的氨基轉(zhuǎn)移,生成丙酮酸和谷氨酸,在37℃,pH7.4,經(jīng)30min反應(yīng)之后，加入2,4-二硝基苯肼終止反應(yīng),并與反應(yīng)中的二種α-酮酸生成2,4-二硝基苯腙,在堿性條件下顯紅棕色,于波長505nm處讀取A值。

兩種苯腙的吸收光譜曲線在500~520nm處差異最大,丙酮酸苯腙的呈色強(qiáng)度是α-酮戊二酸苯腙的3倍,據(jù)此可以計算出丙酮酸的生成量,后者與血清中的ALT的活性濃度成正比。第三頁，共十四頁，編輯于2023年，星期三【實(shí)驗(yàn)原理】丙氨酸+α-酮戊二酸丙酮酸+谷氨酸ALT2,4-二硝基苯肼α-酮戊二酸-2,4-二硝基苯腙丙酮酸-2,4-二硝基苯腙

0.4mol/LNaOH紅棕色紅棕色（三倍）卡門單位:1ml血清在25℃,340nm,體積為3ml,光徑為1cm每分鐘光密度下降0.001的酶量。第四頁，共十四頁，編輯于2023年，星期三1、主要器具微量移液器

【實(shí)驗(yàn)儀器】可見分光光度計第五頁，共十四頁，編輯于2023年，星期三【實(shí)驗(yàn)試劑】1．0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）

2．基質(zhì)緩沖液

精確稱取D-L-丙氨酸1.79g,α-酮戊二酸29.2mg,先溶于0.1mol/L磷酸鹽緩沖液約50ml中,用1mol/LNaOH調(diào)pH至7.4,再加磷酸鹽緩沖液至100ml,每升底物緩沖液中可加氯仿防腐,4℃保存。3．1.0mmol/L2，4-二硝基苯肼溶液4．0.4mol/LNaOH溶液5．2.0mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液6．待測標(biāo)本:病人血清或質(zhì)控血清。第六頁，共十四頁，編輯于2023年，星期三【操作步驟】（1）待測血清的測定加入物(ml)對照管測定管血清0.10.1基質(zhì)緩沖液0.5

混勻，37℃水浴30min2，4-二硝基苯肼溶液0.50.5基質(zhì)緩沖液0.5混勻，37℃保溫20min0.4mol/LNaOH溶液5.05.0混勻，室溫放置5min，在波長為505nm處比色，蒸餾水調(diào)“0”第七頁，共十四頁，編輯于2023年，星期三【操作步驟】（2）校正曲線的制備加入物(ml)012340.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.12.0mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液00.050.100.150.20基質(zhì)緩沖液0.500.450.400.350.301.0mmol/L2，4-二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.5混勻，37℃保溫20min0.4mol/LNaOH溶液5.05.05.05.05.0卡門單位0285797150混勻，室溫放置5min，在波長為505nm處比色，蒸餾水調(diào)“0”第八頁，共十四頁，編輯于2023年，星期三

取7支試管，按下表操作卡門單位0285797150加入物(ml)對照管測定管01234血清0.10.1基質(zhì)緩沖液0.5混勻，37℃水浴30min0.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.12.0mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液00.050.100.150.20基質(zhì)緩沖液0.500.450.400.350.301.0mmol/L2，4-二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.50.50.5基質(zhì)緩沖液0.5混勻，37℃保溫20min0.4mol/LNaOH溶液5.05.05.05.05.05.05.0混勻，室溫放置5min，在波長為505nm處比色，蒸餾水調(diào)“0”第九頁，共十四頁，編輯于2023年，星期三【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1.校正曲線的制備

以標(biāo)準(zhǔn)管各管的A值-“0”號管的A值,所得差值與對應(yīng)酶卡門氏單位作圖,即成校正曲線。2.測定管

測定管A值-對照管A值,根據(jù)所得差值，從校正曲線查得標(biāo)本中ALT的卡門氏單位。參考值范圍：5-25卡門單位第十頁，共十四頁，編輯于2023年，星期三【注意事項(xiàng)】1.血清和底物應(yīng)于37℃水浴后操作,最好置37℃水浴箱中操作。以一定時間加入，各管即時混勻,以第一管開始計時,準(zhǔn)確反應(yīng)30分鐘,各管加入時間間隔一致,保證每管反應(yīng)時間均為30分鐘。2.加入2,4-二硝基苯肼溶液后,應(yīng)充分混勻,使反應(yīng)完全。3.加入NaOH溶液的方法和速度要一致,如液體混合不完全或加入速度不同均會導(dǎo)致吸光度的差異。4.底物和顯色劑均為呈色物質(zhì),稱量必須很準(zhǔn)確。5.呈色的深淺與NaOH的濃度也有關(guān)系,其濃度越大呈色越深,但其濃度<0.25M時,吸光度下降變陡,因此濃度要準(zhǔn)確。第十一頁，共十四頁，編輯于2023年，星期三【方法學(xué)評價】1.重復(fù)性差1)由于限制了α-酮戊二酸的用量。使生成量與酶活性不能呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。2)2,4-二硝基苯肼在堿性條件下也能顯色,為了降低試劑空白的吸光度而不得不使用低濃度的2,4-二硝基苯肼,此種水平的苯肼僅能與反應(yīng)體系中的兩種酮酸的一半反應(yīng)。3)產(chǎn)物旁路效應(yīng)：丙酮酸在LDH的催化作用下的消耗。第十二頁，