培訓(xùn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA操作注意事項(xiàng)

培訓(xùn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA操作注意事項(xiàng)第1頁/共36頁酶免疫測定類型

這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），簡稱ELISA。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測定第2頁/共36頁ELISA原理（以一步法雙抗體夾心法測抗原為例）ELISA其原理為抗原抗體特異性結(jié)合和抗原抗體的酶標(biāo)記，以酶催化底物顯色來判斷結(jié)果。第3頁/共36頁影響酶聯(lián)免疫測定的因素較多,諸如標(biāo)本的采集保存、試劑的準(zhǔn)備、加樣的技術(shù)、孵育溫度的控制、洗滌反應(yīng)板的方式、顯色反應(yīng)時(shí)間的控制等一系列問題均有可能對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的影響,只有避免了這些因素,才能保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。第4頁/共36頁一、移液槍的使用第5頁/共36頁1.

樣品準(zhǔn)備（1）吸樣之前要保證移液槍、槍頭和液體處于相同溫度。置于冰箱保存的樣品應(yīng)提前取出，室溫放置，使溫度平衡后再吸樣。液體溫度>吸頭溫度的移取的液體體積會偏大液體溫度<吸頭溫度的移取的液體體積會偏?。?）

若溶劑瓶中液體太少，可倒入EP管中，方便吸取。第6頁/共36頁2.體積設(shè)定大體積小體積逆時(shí)針精度最佳小體積大體積順時(shí)針調(diào)至超過設(shè)定刻度，再回調(diào)

可保證最佳的精確度嚴(yán)格的精確調(diào)節(jié)方法第7頁/共36頁3.

裝槍頭

將移液槍端垂直插入吸頭，左右微微轉(zhuǎn)動(dòng)，上緊即可上下敲擊會引起內(nèi)部的零部件因瞬間強(qiáng)烈撞擊而松散，甚至?xí)?dǎo)致調(diào)節(jié)刻度的旋鈕卡住第8頁/共36頁4.

吸液（1）

垂直吸液，槍頭吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以下。（2）

槍頭吸嘴預(yù)潤濕（2-3次），使吸嘴內(nèi)壁液體吸附達(dá)到飽和，再吸入樣液，最后打出液體的體積會很精確。一般液體，正向吸液（一檔二檔）。粘稠液體和易揮發(fā)液體，可反相吸液（二檔一檔）。正向吸液反向吸液第9頁/共36頁（3）

緩慢吸取，控制好彈簧的伸縮速度。吸液速度太快會產(chǎn)生反沖和氣泡，導(dǎo)致移液體積不準(zhǔn)確和腐蝕槍體。（4）

吸取后將移液槍提離液面，停約一秒鐘，觀察是否有液滴緩慢地流出。若有流出，說明有漏氣現(xiàn)象（原因有：槍頭未上緊；槍頭不匹配；移液槍內(nèi)部氣密性不好）。（5）吸嘴外壁殘留液滴可沿壁靠去或用濾紙蘸擦。第10頁/共36頁5.

放液（1）

將吸嘴口貼到容器內(nèi)壁并保持10-40°傾斜。（2）

平穩(wěn)地把按鈕壓到一檔，停約一秒鐘二檔，排出剩余液體。排放致密或粘稠液體時(shí)，壓到一檔后，再多等一兩秒鐘二檔。（3）

壓住按鈕，同時(shí)提起移液器，使吸嘴貼容器壁擦過。（4）

松開按鈕。（5）

按彈射器除去移液嘴。（6）使用完畢。第11頁/共36頁移液槍的養(yǎng)護(hù)及注意事項(xiàng)吸取液體時(shí)一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，絕不允許突然松開，以防溶液吸入過快而沖入槍體內(nèi)腐蝕柱塞造成漏氣。移液槍應(yīng)輕拿輕放，不能將已吸有液體的移液槍平放或倒置，以免液體倒流腐蝕活塞彈簧。不得用移液槍移取有腐蝕性的溶液，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。如有液體進(jìn)入槍體，應(yīng)及時(shí)擦干。千萬不要將按鈕旋出量程，否則會卡住內(nèi)部機(jī)械裝置而損壞移液槍。移液槍長時(shí)間不用時(shí)建議將刻度調(diào)至最大量程，讓彈簧恢復(fù)原形，保持松弛狀態(tài)，延長移液槍的使用壽命。應(yīng)定期對移液槍進(jìn)行校準(zhǔn)。第12頁/共36頁二、ELISA具體操作1標(biāo)本的收集和保存2試劑的準(zhǔn)備3加樣本及反應(yīng)試劑4溫育5洗板6顯色7比色8結(jié)果判斷第13頁/共36頁1

標(biāo)本的收集和保存樣品必須置冰箱中冷凍保存。待檢測時(shí)取出解凍待測。第14頁/共36頁1

標(biāo)本的收集和保存（1）細(xì)菌生長所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶可對以相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。樣品在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。（2）冰凍保存的樣品須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。第15頁/共36頁2

試劑的準(zhǔn)備

試劑盒成分：常用的固相載體（ELISA板孔）材質(zhì)：聚苯乙烯、聚氯乙烯，具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值底，各板之間、同一板各孔之間性能相近。包被抗原或抗體與聚苯乙烯固相載體通過疏水基團(tuán)作用物理吸附結(jié)合常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。洗液：非離子型洗滌劑酶反應(yīng)的底物：

H2O2，為受氫體；顯色劑：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS，為供氫體。終止液為硫酸。第16頁/共36頁2

試劑的準(zhǔn)備（1）在實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒先從冰箱中取出，在室溫下放置30分鐘以上，再進(jìn)行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了縮短升溫時(shí)間，使反應(yīng)孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度，以滿足測定要求。（2）試劑盒中的洗滌液如需在使用時(shí)對所提供的濃縮液稀釋配制，稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。第17頁/共36頁3

加樣本及反應(yīng)試劑在ELISA實(shí)驗(yàn)中一般有3次加樣步驟，即加樣品、加酶結(jié)合物、加底物和顯色劑。加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：（1）加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)如有氣泡，抗原抗體不能有效地結(jié)合會導(dǎo)致弱陽性甚至假陰性。（2）每次加樣品應(yīng)更換吸頭，以免發(fā)生交叉污染。第18頁/共36頁（3）加酶結(jié)合物、加底物，應(yīng)使加液量準(zhǔn)確均一、加液過程迅速完成。也可使用試劑盒提供的滴瓶直接滴加。滴加時(shí)，除了要注意滴加的角度垂直、一致外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象。第19頁/共36頁4

溫育溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA屬于固相免疫測定，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異性抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。一般溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，所需時(shí)間相對較短。最為常用的溫度有37℃和室溫(20－25℃)，其次是43℃和2－8℃，目前國內(nèi)ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間通常為37℃30－60分鐘關(guān)于溫育，在實(shí)際測定操作中一定要注意以下幾點(diǎn)：第20頁/共36頁（1）要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間。一般來說，加完樣本或反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時(shí)間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能還比較長，而在臨床實(shí)驗(yàn)中，很少有人注意這個(gè)問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計(jì)時(shí)，這樣就很容易造成在實(shí)際測定中溫育時(shí)間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。為保證37℃下足夠的溫育時(shí)間，實(shí)驗(yàn)室水浴狀態(tài)應(yīng)保證微孔板底貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)貼片或封蓋。第21頁/共36頁（2）溫育溫度的選擇。在有的ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1小時(shí)，另一種則為43℃下45分鐘。從免疫測定抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)來看，在較低的溫度下反應(yīng)較長的時(shí)間最為完全，產(chǎn)物最穩(wěn)定。如2－8℃下反應(yīng)24小時(shí)。較高的反應(yīng)溫度，由于分子運(yùn)動(dòng)的加快，反應(yīng)時(shí)間縮短，這一點(diǎn)對分子含量較多的強(qiáng)陽性樣本測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此，如須選擇反應(yīng)條件，建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫度較長反應(yīng)時(shí)間的條件。第22頁/共36頁（3）“邊緣效應(yīng)”的排除。以前在使用96孔板的ELISA測定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測定中，將板從室溫置于37℃溫箱(非水浴)，板孔升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。而將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，可使溫度迅速平衡。讓反應(yīng)板飄浮在水面上。就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測定的重復(fù)性。第23頁/共36頁5

洗板洗滌在ELISA雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELISA就是靠洗滌清除殘留在板孔中沒能與固相抗體（抗原）結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性的吸附于固相載體的干擾物質(zhì)，以保證ELISA測定的特異性。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。第24頁/共36頁在實(shí)驗(yàn)室中，ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機(jī)洗板。為保證微孔板的均一性使結(jié)果準(zhǔn)確可靠，最好選用洗板機(jī)洗板。若手工洗板，要注意浸泡時(shí)間和孔間洗液最好不要互相流動(dòng)。流水沖洗法讓水流沖擊板孔表面，簡便、快速，洗滌效果較好。第25頁/共36頁6

顯色在以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中，一般顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15－30分鐘。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。TMB（四甲基聯(lián)苯胺）經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，酸性終止液（硫酸）會使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。第26頁/共36頁7

比色ELISA的比色測定由酶標(biāo)儀進(jìn)行。此處強(qiáng)調(diào)以下幾點(diǎn)：（1）酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下，室溫宜在15－30℃，使用前先預(yù)熱儀器15－30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。各種酶標(biāo)儀性能不同，使用前應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書。（2）比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入比色架中，以免銹蝕酶標(biāo)儀比色架。第27頁/共36頁（3）比色測定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。（4）單波長或雙波長比色選擇的問題。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進(jìn)行比色測定；第28頁/共36頁而雙波長比色則在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非敏感波長下的吸光度值的差值。因此，雙波長比色測定具有能排除由微孔板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異性吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色干擾的優(yōu)點(diǎn)。第29頁/共36頁8

結(jié)果判斷ELISA測定按其表示測定結(jié)果的方式分為定性和定量測定兩大類。定性測定只是對樣品中是否含有待測抗原或抗體作出“有”或“無”的結(jié)論，分別用“陽性”和“陰性”來表示；定量測定，每批測試均須用一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。第30頁/共36頁產(chǎn)生非特異性顯色的原因試劑盒因素：固相載體原料的不同和制作工藝的差別、包被物的提純度、固相載體表面未被包被的空隙封閉不良等；人為因素：加樣、洗板、溫育、判斷結(jié)果中的操作不當(dāng)或責(zé)任心