植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生產(chǎn)物制備

關(guān)于植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生產(chǎn)物制備第一頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一節(jié)植物細(xì)胞的培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)從植物組織培養(yǎng)而來，植物組織培養(yǎng)主要用于形成組織和再生成植株細(xì)胞培養(yǎng)主要生成次生代謝產(chǎn)物基本技術(shù)：植物材料的準(zhǔn)備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)方法的選擇第二頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、植物細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)植物培養(yǎng)細(xì)胞四個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期特性延遲期：細(xì)胞數(shù)恒定，高RNA含量，高蛋白質(zhì)合成能力；加速期：細(xì)胞快速生長(zhǎng)期。干重恒定，細(xì)胞數(shù)、DNA和蛋白質(zhì)濃度增加，有絲分裂活性、RNA含量和蛋白質(zhì)合成能力減少；對(duì)數(shù)期：介于最大生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)合成完全停止期之間。增加細(xì)胞鮮重、干重及RNA酶活性，蛋白質(zhì)合成能力完全減退；穩(wěn)定期：細(xì)胞數(shù)穩(wěn)定。細(xì)胞高液泡化，極度脆弱，高度分化及有機(jī)化合物的高濃度。第三頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（1）植物細(xì)胞有獨(dú)特的培養(yǎng)時(shí)間及特征：重量的增加在對(duì)數(shù)期，次生代謝產(chǎn)物在穩(wěn)定期積累（2）植物細(xì)胞很少單一細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期分泌量蛋白和粘多糖，以非均相集合的細(xì)胞團(tuán)懸浮生長(zhǎng)。（3）植物細(xì)胞好氣，培養(yǎng)過程中需供氣及攪拌，但細(xì)胞壁脆弱，抗剪切能力小，傳統(tǒng)的攪拌式反應(yīng)器極易損傷細(xì)胞壁第四頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、植物細(xì)胞培養(yǎng)基植物細(xì)胞生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)：（1）需大量無機(jī)鹽（2）需多種維生素和植物生長(zhǎng)激素（3）無機(jī)氮源，硝酸鹽，銨鹽為主。（4）以蔗糖為碳源第五頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一常用培養(yǎng)基MS、N6、B6、LS、RM-1964、H、T、B5、DBMII、米勒、改良懷特、尼許等。MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最多最普遍的培養(yǎng)基。無機(jī)鹽的濃度較高，能保證組織培養(yǎng)生長(zhǎng)所需的礦物營(yíng)養(yǎng)。并且因?yàn)殡x子濃度高，在配制、貯存、消毒過程中，即使有些成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基中的離子平衡。第六頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一B5含有較低的鹽離子，這個(gè)成分可能對(duì)很多培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。White的無機(jī)鹽含量較低，適于生根培養(yǎng)。KM-8p主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了幾乎所有的單糖和維生素、呼吸代謝中的主要有機(jī)酸。凡是花藥培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基，其成分較簡(jiǎn)單，且KN03和(NH)2N04含高。第七頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（一）無機(jī)鹽大量元素：氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫等微量元素：硼、錳、鋅、鉬、銅、鈷、氯等（二）生長(zhǎng)因素植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑植物生長(zhǎng)激素：生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素，赤霉素，脫落酸，乙烯。

借生長(zhǎng)激素調(diào)控生長(zhǎng)分化，以及細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，獲得最大量的次生代謝產(chǎn)物第八頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一生長(zhǎng)素（用來誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂、愈傷組織形成和根的分化）：組織培養(yǎng)中常用的有：吲哚乙酸(IAA)：第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)和人工合成的的激素二氯本氧乙酸(2,4-D)；萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；萘氧乙酸(NOA)；對(duì)氯苯氧乙酸(P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根，2,4-D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)第九頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一細(xì)胞分裂素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織上或器官上分化不定芽。常用的有：6-芐基嘌呤(BAP)6-芐基腺嘌呤(6-BA)激動(dòng)素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）玉米素(zeatin、zt)異戊烯氨基嘌呤(2-ip)第十頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一植物培養(yǎng)物的生長(zhǎng)取決于生長(zhǎng)素和分裂素的比例：高濃度生長(zhǎng)素和低濃度分裂素——刺激細(xì)胞分裂

低濃度生長(zhǎng)素和高濃度分裂素——刺激細(xì)胞生長(zhǎng)（三）誘導(dǎo)子(elicitor)：刺激植物細(xì)胞合成防御性次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì),可以通過改變次生代謝途徑中催化酶的酶活力,引起代謝通量和反應(yīng)速率的改變,提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

第十一頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一非生物誘導(dǎo)子：水楊酸，茉莉酸等,稀土及重金屬鹽類生物誘導(dǎo)子：微生物類，如真菌孢子，菌絲體

真菌培養(yǎng)物濾液等（四）碳源細(xì)胞培養(yǎng)過程中不進(jìn)行光合作用，需提供糖做碳源。（五）維生素：煙酸，B1，B6（六）有機(jī)物：甘氨酸或水解絡(luò)蛋白，酵母提取液等。第十二頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、植物細(xì)胞的獲得和擴(kuò)大培養(yǎng)（一）植物細(xì)胞的獲得1.外植體直接分離法:機(jī)械切割、組織破碎直接從植物外植體中分離2.愈傷組織分離法：從愈傷組織制備小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸液3.原生質(zhì)體再生法：纖維素和果膠酶混合處理外植體或愈傷組織，分離原生質(zhì)體，再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生獲得植物細(xì)胞第十三頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（二）植物細(xì)胞的培養(yǎng)一、懸浮培養(yǎng)二、單細(xì)胞培養(yǎng)三、植物細(xì)胞的規(guī)模化培養(yǎng)及有用物質(zhì)生產(chǎn)第十四頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、懸浮培養(yǎng)（cellsuspensionculture）懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。

第十五頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一1、愈傷組織誘導(dǎo)

要求：松散性好，增殖快，再生能力強(qiáng)。其外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，松散易碎。

適于懸浮培養(yǎng)適于再生植株第十六頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一如何獲得符合要求的愈傷組織？1、選擇適宜的外植體：胚、胚軸、子葉是最常用的外植體，特別是幼胚。2、選擇適宜的培養(yǎng)基：生長(zhǎng)素濃度很重要配合一定濃度的細(xì)胞分裂素；添加附加物。3、愈傷組織要進(jìn)行繼代選擇：選擇疏松性好、細(xì)胞狀態(tài)好的細(xì)胞不斷繼代培養(yǎng)。第十七頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一懸浮系建立過程：影響懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素：1、起始愈傷組織的質(zhì)量2、接種細(xì)胞密度3、培養(yǎng)條件：方式、溫度、4、繼代周期2、懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)愈傷組織1g愈傷/10ml培養(yǎng)基150、250ml三角瓶（30、70ml培養(yǎng)基）120rpm,25℃黑暗培養(yǎng),換液1次/3d以防粘稠蔗糖梯度離心或過濾法(淘汰過大或生理狀態(tài)不好的細(xì)胞團(tuán))繼代培養(yǎng)80rpm（懸浮細(xì)胞系穩(wěn)定以后）繼代時(shí)間為1周時(shí)（原懸浮液：新培養(yǎng)基=1：4）每次繼代都要進(jìn)行選擇，篩選生活力好的細(xì)胞繼代第十八頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足3個(gè)條件：1、浮懸培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30～50個(gè)細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。2、均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。3、細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般

2～3天甚至更短時(shí)間便可增加1倍。第十九頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3、懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)：基本的懸浮培養(yǎng)體系均是將細(xì)胞分散在一定容積的培養(yǎng)液中進(jìn)行，在一個(gè)培養(yǎng)周期不添加培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)體系基本是處于封閉狀態(tài)。當(dāng)一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，細(xì)胞及停止生長(zhǎng)。在這種懸浮培養(yǎng)體系中，細(xì)胞擴(kuò)增生長(zhǎng)成S形曲線。第二十頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一

培養(yǎng)周期的概念

具有一定起始培養(yǎng)密度的單細(xì)胞，從開始培養(yǎng)到細(xì)胞數(shù)目和總重量增長(zhǎng)停止這一過程，稱為一個(gè)培養(yǎng)周期。

第二十一頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一

接種初期的細(xì)胞密度過低會(huì)使延遲期加長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞的起始密度一般在（0.5~2.5）*105個(gè)范圍內(nèi)調(diào)整。一般繼代培養(yǎng)可降低密度；若在短時(shí)間內(nèi)獲得大量細(xì)胞可提高接種密度。在實(shí)際應(yīng)用中，還需要確定一些參數(shù)：最低起始密度、最大生長(zhǎng)速率、每個(gè)培養(yǎng)周期所經(jīng)歷的天數(shù)等。第二十二頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一4、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的同步化細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中的游離性較差，容易團(tuán)聚進(jìn)入不同程度的分化狀態(tài)，因此要達(dá)到完全同步化相當(dāng)困難。①分選法：通過細(xì)胞體積大小分級(jí)，直接將處于相同周期的細(xì)胞進(jìn)行分選，然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中。②饑餓法：在一個(gè)培養(yǎng)體系中，如果細(xì)胞生長(zhǎng)的基本成分喪失，則導(dǎo)致細(xì)胞因饑餓而分裂受阻，從而停留在某一分裂時(shí)期。第二十三頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一③抑制劑法：通過一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期—G1期的同步化細(xì)胞。④低溫法：冷處理也可提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化程度。第二十四頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一二.單細(xì)胞的培養(yǎng)（1）看護(hù)培養(yǎng)法（nurseculture）：在單細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境里加入愈傷組織同時(shí)培養(yǎng)。愈傷組織提供促細(xì)胞分裂的物質(zhì)等，傳遞生物信息，使持續(xù)分裂增值等。即愈傷組織看護(hù)單細(xì)胞第二十五頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（2）微室培養(yǎng)法：?jiǎn)渭?xì)胞接種到小室里，密封培養(yǎng)，觀測(cè)單細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育情況（3）平板培養(yǎng)法：?jiǎn)渭?xì)胞接種于固體培養(yǎng)基上，獲得單細(xì)胞形成的細(xì)胞系（4）條件培養(yǎng)法：接種于條件培養(yǎng)基上形成的細(xì)胞系。條件培養(yǎng)基指培養(yǎng)過細(xì)胞的培養(yǎng)基上清，有植物生長(zhǎng)激素等殘留，用于制備成固體培養(yǎng)基。第二十六頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一二.單倍體細(xì)胞的培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）：指將植物單倍體細(xì)胞培養(yǎng)成單倍體植株或純和二倍體植株一般采取花藥作為單倍體細(xì)胞的培養(yǎng)對(duì)象用花粉在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)第二十七頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一三.愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織既是組織又是細(xì)胞，為脫分化細(xì)胞，具再分化的能力，可用于次生代謝物的生產(chǎn)，也可再生為植株。第二十八頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一四.毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)一些次生代謝產(chǎn)物只有在根里生長(zhǎng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染雙子夜植物，RI質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根。形態(tài)方面：Ri質(zhì)粒誘導(dǎo)快速生長(zhǎng)的、非定向性、高分支的毛狀根的形成代謝方面：Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根能合成與原植物相同或相似的次生代謝物，并且發(fā)根合成次生代謝物具有遺傳穩(wěn)定性。第二十九頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一毛狀根生長(zhǎng)快速和次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高，特別適用于從木本植物和難于培養(yǎng)的植物中得到較高含量的次級(jí)代謝產(chǎn)物。毛狀根具有如下特點(diǎn)：激素自養(yǎng)，不必加外源激素；次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定；增殖速度快。第三十頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一用發(fā)根農(nóng)桿菌經(jīng)直接注射法，外植體接種感染，原生質(zhì)體共培養(yǎng)法誘導(dǎo)毛狀根發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后，經(jīng)篩選鑒定低鹽濃度下生長(zhǎng)，培養(yǎng)第三十一頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一植物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化存在的問題生長(zhǎng)緩慢,通常完成一次生產(chǎn)周期需4-5周次級(jí)代謝物含量低培養(yǎng)細(xì)胞不穩(wěn)定等多數(shù)產(chǎn)物積累于胞內(nèi)不耐受剪切力一般的說，只有當(dāng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的價(jià)格高于1000美元/kg時(shí)，才考慮采用植物細(xì)胞培養(yǎng)方法。第三十二頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一植物細(xì)胞易聚集化，比較脆弱，代謝途徑和代謝產(chǎn)物累積與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系的復(fù)雜性，選擇合適的培養(yǎng)方法和反應(yīng)器影像產(chǎn)物產(chǎn)量細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)，次生代謝產(chǎn)物含量相對(duì)較低，提取困難，生物反應(yīng)器技術(shù)還有待深入三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的大規(guī)模培養(yǎng)-

生物反應(yīng)器第三十三頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一根據(jù)通氣和攪拌系統(tǒng)的類型可將生物反應(yīng)器分類：搖瓶：氣體和營(yíng)養(yǎng)成分的均勻分布可將通過機(jī)械的簡(jiǎn)單振搖而實(shí)現(xiàn)攪拌目的。攪拌型生物反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)：主要體現(xiàn)在不同攪拌器的靈活應(yīng)用，有利于培養(yǎng)物的高度混合。缺點(diǎn)：高耗能以及由于細(xì)胞對(duì)剪切力的高度敏感所致的種種缺陷環(huán)流生物反應(yīng)器＆鼓泡生物反應(yīng)器外部循環(huán)水或壓縮空氣作為能量輸入第三十四頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一大規(guī)模培養(yǎng)要綜合考慮以下因素：供氧能力及氣泡分散程度剪切力大小及對(duì)細(xì)胞的影響高密度培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)液的混和程度溫度，pH及營(yíng)養(yǎng)物濃度的控制能力細(xì)胞團(tuán)大小的控制能力易于放大第三十五頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

植物細(xì)胞培養(yǎng)用的反應(yīng)器主要有機(jī)械式攪拌生物反應(yīng)器、鼓泡塔與氣升式生物反應(yīng)器、填充床式生物反應(yīng)器、流化床生物反應(yīng)器和膜式生物反應(yīng)器等。1、機(jī)械式攪拌生物反應(yīng)器2、鼓泡塔與氣升式生物反應(yīng)器3、填充床生物反應(yīng)器考慮到機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以避免，同時(shí)攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升式生物反應(yīng)器，但其缺點(diǎn)是攪拌不均勻。第三十六頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一在填充床生物反應(yīng)器中，細(xì)胞可以位于支撐物表面，也可以包埋于支撐物之中，培養(yǎng)液可以流經(jīng)支撐物顆粒，不斷被細(xì)胞所利用。填充床生物反應(yīng)器已被用于植物細(xì)胞的培養(yǎng)。（a）（b）出口出口進(jìn)口進(jìn)口填充床生物反應(yīng)器流化床生物反應(yīng)器

填充床生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)在于單位體積固定細(xì)胞量大，但是填充床反應(yīng)器還存在許多缺點(diǎn)，它的混合效果低，對(duì)必要的氧傳遞、PH、溫度控制和氣體產(chǎn)物的排除造成了困難，影響了細(xì)胞的培養(yǎng)，同時(shí)大顆粒的低效率傳質(zhì)、填充體成分供應(yīng)和排除的困難，限制了填充床反應(yīng)器應(yīng)用于不要求細(xì)胞活性的生物轉(zhuǎn)化。第三十七頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2、流化床生物反應(yīng)器

典型的流化床生物反應(yīng)器是利用流體的能量來懸浮顆粒的。由于使顆粒呈流化狀態(tài)所需的能量與顆粒大小成正比，因此，通常采用小固定化顆粒，這些小顆粒良好的傳質(zhì)特性是流化床反應(yīng)器的主要優(yōu)點(diǎn)。流化床生物反應(yīng)器的最大缺點(diǎn)是剪切和顆粒碰撞會(huì)損壞固定化細(xì)胞。（a）（b）出口出口進(jìn)口進(jìn)口填充床生物反應(yīng)器流化床生物反應(yīng)器第三十八頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3、膜生物反應(yīng)器

在植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，主要采用的是中空纖維和螺線式卷繞反應(yīng)器。如下圖所示。膜反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)是可以重復(fù)使用，因此，盡管投資較大，仍較經(jīng)濟(jì)。另外，由于植物細(xì)胞代謝不像微生物那樣旺盛，因而可以采用更厚的細(xì)胞層。細(xì)胞細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物入口營(yíng)養(yǎng)物入口營(yíng)養(yǎng)物出口營(yíng)養(yǎng)物出口營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)圖12-5固定化細(xì)胞膜反應(yīng)器a-中空纖維反應(yīng)器b-螺線式卷繞反應(yīng)器第三十九頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第四十頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一各種生物反應(yīng)器性能比較不同類型的生物反應(yīng)器各有其優(yōu)缺點(diǎn)，而改進(jìn)的攪拌式生物反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器可能更適合植物細(xì)胞的培養(yǎng)。一般來說，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞在干重不大于20g/L時(shí)，以氣升式反應(yīng)器為宜，而當(dāng)干重超過20g/L時(shí)，則改進(jìn)的攪拌式生物反應(yīng)器優(yōu)于其它類型的反應(yīng)器第四十一頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一我國(guó)發(fā)明的“氣升內(nèi)錯(cuò)流”式植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器，能夠適應(yīng)植物細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)液隨培養(yǎng)進(jìn)程而蒸發(fā)減少的生物反應(yīng)過程；可抑制氣泡的聚合，減弱氣泡在液面破裂時(shí)產(chǎn)生的沖擊力對(duì)細(xì)胞的損傷；可提高降液區(qū)氣含率，消除降液區(qū)缺氧現(xiàn)象，并強(qiáng)化混合與氧傳遞，大大降低反應(yīng)器高度。使用這種反應(yīng)器培養(yǎng)新疆紫草細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞量達(dá)到12gdw／L，紫草寧含量達(dá)到了細(xì)胞干重的10％，是天然植株含量的2～8倍第四十二頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第二節(jié)影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物累積的因素

因素主要有：1、生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等；2、物理?xiàng)l件：溫度、光（光照時(shí)間、光強(qiáng)、光質(zhì)）、通氣（氧氣）、酸度和滲透壓；3、化學(xué)條件：無機(jī)鹽、碳源、物質(zhì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)和前體等；4、工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌和培養(yǎng)方式。第四十三頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、外植體的選擇在生長(zhǎng)曲線的不同時(shí)期，累積不同的產(chǎn)物。第四十四頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、培養(yǎng)條件的影響

營(yíng)養(yǎng)成分、生物及非生物元素、酸度、通氣以混合程度、與接種有關(guān)的因素以及剪切力、攪拌頻率、溫度和光。

第四十五頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一1、內(nèi)在因素（1）、接種和誘導(dǎo)

外植體的大小直接影響所誘導(dǎo)的組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且也關(guān)系到其次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。外植體的前處理也可嚴(yán)重影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積方式。（2）、培養(yǎng)基的組成，基本培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

第四十六頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一磷，低磷會(huì)導(dǎo)致次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積，缺乏磷會(huì)導(dǎo)致生物量的大幅度降低。氮，硝酸鹽和銨鹽；還有某些需要特殊的有機(jī)氮源。如天冬氨酸、尿素、酪蛋白水解物或蛋白胨。銅，作為鄰及對(duì)-二酚可抗壞血酸氧化酶活性基團(tuán)的作用，是次級(jí)代謝產(chǎn)物累計(jì)的必要元素，還可作為非生物誘導(dǎo)子。碳源，自養(yǎng)培養(yǎng)的二氧化碳和異養(yǎng)培養(yǎng)的糖類，性質(zhì)和數(shù)量往往對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生物量有很大的影響。第四十七頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一糖類對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響主要取決于所使用的糖類的種類和濃度及細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成過程，還可增強(qiáng)生物堿起始合成酶的活性和增加相關(guān)mRNA的濃度。糖的作用有：延長(zhǎng)穩(wěn)定期；通過蔗糖分解后的產(chǎn)物（葡萄糖）所產(chǎn)生的對(duì)內(nèi)源性生長(zhǎng)素合成的抑制作用；增強(qiáng)戊糖磷酸化途徑有關(guān)酶的活性。

第四十八頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（3）、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

非常重要的作用，這種作用有時(shí)可能是關(guān)鍵性的。不同的植物激素及其不同的組成形式均可顯著影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。由于材料生理狀態(tài)的差異，其作用也有很大的不同。

第四十九頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（4）、氧氣和酸度

氧氣，懸浮細(xì)胞和固定化細(xì)胞供氧方式有所不同，前者可采用通氣和攪拌，轉(zhuǎn)速過快會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂，后者只能采用通氣方式。酸度，有利于細(xì)胞培養(yǎng)的酸度在5-6之間，培養(yǎng)基在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中會(huì)變酸或變堿。第五十頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（5）、滲出物

在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的后期，培養(yǎng)液中含有多種細(xì)胞代謝的初級(jí)和次級(jí)產(chǎn)物。第五十一頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2、兩步培養(yǎng)法

第一步使用適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)豐富；第二步使用適于次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基，較低含量的硝酸鹽和磷酸鹽，并含有較低的糖分或少量的碳源。第五十二頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3、誘導(dǎo)子

植物抗毒素是在植物防御系統(tǒng)內(nèi)能對(duì)抗微生物進(jìn)攻的某些次級(jí)代謝產(chǎn)物，有些時(shí)候連續(xù)合成，有些時(shí)候在被次級(jí)下才會(huì)產(chǎn)生抗毒素，或僅在被誘導(dǎo)下其產(chǎn)量才能增加。觸發(fā)形成植物抗毒素信號(hào)的物質(zhì)稱為誘導(dǎo)子，能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞中的一個(gè)反應(yīng)，并能形成特征性自身防御反應(yīng)的分子。兩種分類，一種是根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外形成而將其分為內(nèi)源性誘導(dǎo)子和外源性誘導(dǎo)子；另一種是根據(jù)其來源分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。生物誘導(dǎo)子是指植物體在防御過程中為對(duì)抗微生物感染而產(chǎn)生的物質(zhì)，包括分生孢子、降解細(xì)胞壁的酶類、細(xì)胞壁碎片、有機(jī)體產(chǎn)生的代謝物。非生物誘導(dǎo)子所有不是植物細(xì)胞中天然成分但又能觸發(fā)植物細(xì)胞形成抗毒素信號(hào)的物質(zhì)。第五十三頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一4、培養(yǎng)環(huán)境的外部因素（1）、溫度，次級(jí)代謝產(chǎn)物的最佳產(chǎn)生溫度是20-28度，低溫時(shí)細(xì)胞不再生長(zhǎng)，產(chǎn)物不合成。溫度的變化可引起產(chǎn)物類型在質(zhì)和量上的改變。（2）、攪拌頻率，具體表現(xiàn)在發(fā)酵液中的溶氧濃度和機(jī)械攪拌對(duì)細(xì)胞所產(chǎn)生的剪切力上。（3）、培養(yǎng)容器的影響，因?yàn)槿萜鞯拇笮『蛿嚢柩b置的不同會(huì)產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

第五十四頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（4）、光的影響，光照時(shí)間的長(zhǎng)短、光質(zhì)、光強(qiáng)對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積有一定的作用。光對(duì)植物培養(yǎng)細(xì)胞的影響主要表現(xiàn)在：特殊波長(zhǎng)的短波脈沖僅僅啟動(dòng)細(xì)胞的形態(tài)分化和生化過程，而連續(xù)光照則可以保持光的反應(yīng)潛能或反應(yīng)狀態(tài)。植物光照和激素具有協(xié)同作用或?qū)棺饔谩５谖迨屙?yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三節(jié)培養(yǎng)方法的進(jìn)展與展望20世紀(jì)90年代以來，對(duì)于植物細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)入了新的發(fā)展時(shí)期，并出現(xiàn)了很多新技術(shù)和新方法，比如誘導(dǎo)子、前體飼養(yǎng)、兩相培養(yǎng)法、質(zhì)體轉(zhuǎn)化、毛狀根和冠癭瘤組織培養(yǎng)等，顯示了植物細(xì)胞培養(yǎng)工程制藥的廣闊發(fā)展前景。

第五十六頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、誘導(dǎo)子

在植物細(xì)胞培養(yǎng)中加入誘導(dǎo)子可以提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，并可促進(jìn)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)子的作用隨誘導(dǎo)子的種類的不同而異，研究顯示，誘導(dǎo)子的最佳加入時(shí)間為細(xì)胞對(duì)數(shù)的生長(zhǎng)期。第五十七頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、前體飼喂

是增加次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)率的重要方法，次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成依賴于3中主要原材料的供應(yīng)，莽草酸是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前體；氨基酸，形成生物堿及肽類抗生素；乙酸，是聚乙炔類、前列腺素類、大環(huán)抗生素，多酚類，類異戊二烯等的前體。

第五十八頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、兩相培養(yǎng)法

出發(fā)點(diǎn)是在細(xì)胞外創(chuàng)造一個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的儲(chǔ)存單元?？杉尤牍滔嗷蚴杷合?，形成兩相培養(yǎng)體系，從而達(dá)到收集分泌產(chǎn)物的目的?？蓽p輕產(chǎn)物本身對(duì)細(xì)胞代謝的抑制作用，并可保護(hù)產(chǎn)物免受培養(yǎng)基中催化酶或酸對(duì)產(chǎn)物的影響。可簡(jiǎn)化下游處理過程，降低生產(chǎn)成本。第五十九頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一兩相培養(yǎng)系統(tǒng)需滿足下列條件：添加的固相或液相對(duì)細(xì)胞無毒害作用，不影響細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成；產(chǎn)物易被固相吸附或被有機(jī)相溶解；兩相易分離；如為固相不吸附培養(yǎng)基中的添加成分，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或有機(jī)成分。第六十頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一四、毛狀根和冠癭瘤培養(yǎng)第六十一頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一雙子葉植物病原菌根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的原生質(zhì)體中分別含有Ti和Ri質(zhì)粒，大小約200kb.植物遭感染后，農(nóng)桿菌能將質(zhì)粒中的一段轉(zhuǎn)移DNA（T－DNA）片段整合到植物基因組上，表型上出現(xiàn)冠瘤或毛狀根。將冠癭瘤或毛狀根作為培養(yǎng)系統(tǒng)，可進(jìn)行有用化合物的生產(chǎn)。第六十二頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一1、毛狀根培養(yǎng)

利用發(fā)根農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，極具發(fā)展前途，其生長(zhǎng)快速和次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高，特別適用于從木本植物和難于培養(yǎng)的植物中得到較高含量的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

毛狀根具有如下特點(diǎn)：激素自養(yǎng)，不必加外源激素；次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定；增殖速度快。第六十三頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2、冠癭組織培養(yǎng)

有些藥用植物的活性成分僅在葉片和莖軸中合成，利用冠癭組織培養(yǎng)易于得到這些物質(zhì)，冠癭組織的獲得，是由根瘤農(nóng)桿菌感染植物組織，Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后獲得冠癭瘤，經(jīng)過除菌后，從冠癭瘤培養(yǎng)獲得的。該組織也具有激素自養(yǎng)、增殖速度快等特點(diǎn)，也可以進(jìn)行液體培養(yǎng)。第六十四頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3、轉(zhuǎn)基因植物和活性成分生產(chǎn)由于分子生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展，如今已有可能人工設(shè)計(jì)新的植物性狀用于改良作物的品質(zhì)＆抗性。該技術(shù)的關(guān)鍵在于用什么方法將外源基因?qū)胫参锏幕蚪M并高效表達(dá)。

用農(nóng)桿菌做載體將外源基因?qū)胫参锘蚪M的方法比較成熟。

第六十五頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第五節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)在制藥工業(yè)上的應(yīng)用一、生產(chǎn)天然藥物(1)人參細(xì)胞培養(yǎng)MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)初期低糖，生長(zhǎng)后期補(bǔ)糖控制磷酸鹽濃度和PH添加生長(zhǎng)素和激動(dòng)素離心葉輪式反應(yīng)器進(jìn)行高密度培養(yǎng)細(xì)胞干重最多達(dá)30g/L

人參皂苷達(dá)2g/L第六十六頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一(2)紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)紫杉醇(Paclitaxel):二萜類化合物,抗癌藥，是有絲分裂抑制劑，可阻止微管正常生理聚集，抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和紡錘體的形成，從而使癌細(xì)胞的復(fù)制受到阻斷而凋亡。1967年美國(guó)化學(xué)家Wall和Wani首先從太平洋紫杉（短葉紅豆杉）樹皮中提取出來。該藥1992年底獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。

第六十七頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一紫杉醇存在于紅豆杉屬植物的樹皮、葉及莖中，其中樹皮中的含量最高。12000株成年紫杉樹中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生長(zhǎng)周期很長(zhǎng)，在世界分布很少。紫杉醇的國(guó)際市場(chǎng)價(jià)格為450美元/g第六十八頁(yè)，共七十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一B5培養(yǎng)基，補(bǔ)糖，暗培養(yǎng)低濃度的生長(zhǎng)激素誘導(dǎo)子培養(yǎng)基中加甲基戊酸，苯丙氨酸等前體加甲瓦龍酸等中間產(chǎn)物加單萜合成抑制劑篩選細(xì)胞株最高產(chǎn)量達(dá)