離心技術與離心機(高端培訓教程)

離心技術與離心機離心現(xiàn)象是指物體在離心力場中表現(xiàn)的沉降運動現(xiàn)象。應用離心沉降進行物質的分析和分離的技術稱為離心技術（centrifugaltechnique）。實現(xiàn)離心技術的儀器是離心機（centrifuge）。離心技術主要用于各種生物樣品的分離、純化和制備，在細胞生物學和分子生物學的每一進程中，總可見到離心技術的運用。離心機是生命科學研究的基本設備，在生命科學，特別是生物化學和分子生物學研究領域，隨著分子生物學研究對分離設備日益增多的需要而有了很大的發(fā)展。在引入了微處理器控制系統(tǒng)后，各種轉速級別的離心機已經(jīng)可以分離純化目前已知的各種生物體組份（細胞、亞細胞器、病毒、激素、生物大分子等等）。而對離心方法的深入研究又可以利用這些離心設備更快、更純、更多地分離純化樣品。諸如分離出化學反應后的沉淀物、天然的生物大分子、無機物、有機物，在生物化學以及其它的生物學領域常用來收集細胞、細胞器及生物大分子物質。一、離心機工作原理離心是利用旋轉運動的離心力以及物質的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進行分離、濃縮和提純生物樣品的一種方法。懸浮液在高速旋轉下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而使溶液得以分離、濃縮和提純，顆粒的沉降速度取決于離心機的轉速、顆粒的質量、大小和密度。血漿試管離心沉降物血液第一節(jié)離心技術的基礎理論當懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用可使得其中懸浮的顆粒逐漸下沉，下沉的速度與微粒的大小、形態(tài)、密度、重力場的強度及液體的黏度有關。如紅細胞顆粒，直徑為數(shù)微米，可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過程。此外，物質在介質中沉降時還伴隨有擴散現(xiàn)象。重力時間擴散是由于微粒的熱運動而產(chǎn)生的質量遷移現(xiàn)象,主要是由于密度差引起的。對小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質等，它們在溶液中成膠體或半膠體狀態(tài)，僅僅利用重力是不可能觀察到沉降過程的，因為顆粒越小沉降越慢，而擴散現(xiàn)象則越嚴重。擴散現(xiàn)象擴散現(xiàn)象是不利于樣品分離的，如果加大重力，就可能克服擴散現(xiàn)象的不利影響,實現(xiàn)生物大分子的分離。離心機就是利用離心機轉子高速旋轉產(chǎn)生的強大的離心力，迫使液體中微?？朔U散加快沉降速度，把樣品中具有不同沉降系數(shù)和浮力密度的物質分離開。1.離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）當物體所受外力小于運動所需要的向心力時，物體將向遠離圓心的方向運動。物體遠離圓心運動的現(xiàn)象稱為離心現(xiàn)象。也叫離心運動。離心運動是由于向心力消失或不足而造成的。

二、離心力與相對離心力旋轉離心力離心作用是根據(jù)在一定角速度下作圓周運動的任何物體都受到一個向外的離心力進行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω2r與顆粒質量m的乘積，即：

式中ω是旋轉角速度，Ｎ是每分鐘轉頭旋轉次數(shù)，r為離心半徑，m是質量。2.相對離心力(relativecentrifugalforce，RCF)相對離心力是指在離心力場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”。由于各種離心機轉子的半徑或離心管至旋轉軸中心的距離不同，離心力也不同,因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力,例如25000×g,表示相對離心力為25000。只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結果。一般情況下,低速離心時相對離心力常以轉速“rpm”來表示，高速離心時則以“g”表示。若想把生物樣品中的微粒從液體中分離出來，最簡單的方法是將液體靜置一段時間，液體中的微粒受重力的作用，較重的微粒下沉與液體分開，這個現(xiàn)象稱為重力沉降。微粒在液體介質中的沉降將受到介質的浮力、介質阻力及擴散現(xiàn)象的影響。

三、液體中的微粒在重力場中的分離混合液靜置一段時間后

沉降速度(sedimentationvelocity)指在強大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質運動的距離。即：式中，為介質的密度，ρ為微粒的密度，g為重力加速度，f為阻力系數(shù)。由上式可知，微粒的沉降速度與成正比，與阻力系數(shù)f成反比。沉降時間(sedimentationtime，Ts)在實際工作中，常常遇到要求在已有的離心機上把某一種溶質從溶液中全部沉降分離出來需用多大轉速與多長時間可達到目的的問題。如果轉速已知，則需確定分離某粒子所需的時間即沉降時間。K系數(shù)(kfactor)描述在一個轉子中，將粒子沉降下來的效率，也就是溶液恢復成澄清程度的一個指數(shù)，所以也稱之為“cleaningfactor”。原則上，K系數(shù)愈小，愈容易也愈快地將粒子沉降。K系數(shù)與離心轉速及粒子沉降的路徑有關，所以K系數(shù)是一個變數(shù)。沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient）顆粒在單位離心力場作用下的沉降速度，其單位為秒。沉降系數(shù)與樣品顆粒的分子量、分子密度、組成、形狀等都有關，樣品顆粒的質量或密度越大，它表現(xiàn)出的沉降系數(shù)也越大。各種生物樣品的沉降系數(shù)差別很大，因此可以應用離心技術來進行其定性和定量的分析及分離制備。四、液體中的微粒在離心力場中的沉降在離心機中，離心管（centrifugetube）放于離心轉頭里，當離心機開動時，離心管繞離心轉頭的軸旋轉，作圓周運動，在離心管內(nèi)的樣品顆粒將同樣運動。假如顆粒處于真空中，顆粒會沿切線方向飛去,也就是當離心管由圖中的0位轉到1位時，顆粒到達離心管底部A位。對于離心管而言，樣品顆粒由頂位移到了A位，也就是由離心管頂部移到了底部，這與重力場中的由高處落到低處相似。這種顆粒在圓周運動時的切線運動稱為離心沉降.實際上顆粒是在介質中運動的，顆粒作切線運動時將由于介質的摩擦阻力，使其在離心管中依圖中虛線所示的曲線運動，當離心管由0位轉到2位時，顆粒由頂位移到B位。介質的阻力越大，顆粒的沉降速度越小、沉降的距離也越短。旋轉速度越大，顆粒的沉降越快。離心沉降示意圖離心管依斜角插于離心機的轉頭孔中，與轉頭旋轉軸成角，離心管中放置被離心的樣品溶液，離心管頂部到旋轉中心的距離和離心管底部到旋轉中心的距離不一樣，因此其頂部和底部所承受的離心力場也不一樣。350沉降中的顆粒350通常稱離心管頂部到旋轉中心的距離為最小離心半徑rmin，該處承受的離心力場為最小離心力場；稱離心管底部到旋轉中心的距離為最大離心半徑rmax，該處承受的離心力場稱為最大離心力場。最小離心半徑最大離心半徑在離心力場中加速度達到數(shù)萬甚至數(shù)十萬倍重力加速度時，顆粒的沉降也加快了同樣的倍數(shù)。這就使得許多在重力場中不能沉降的細小顆粒及密度較低的物體組份能用離心技術進行分離純化。5ml血液離心5分鐘血漿血細胞一、差速離心法差速離心法(differentialvelocitycentrifugationmethod)是利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分步沉淀的離心方法。主要用于一般及特殊樣品的分離，例如分離細胞器和病毒。第二節(jié)常用的離心方法操作過程一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉速離心，分離出第二部分沉淀，如此反復加高轉速，逐級分離出所需要的物質（如左圖所示）。差速離心法原理示意圖差速離心法

優(yōu)點缺點1.操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開;2.可使用容量較大的角式轉子；分離時間短、重復性高；3.樣品處理量大。1.分辨率有限、分離效果差，不能一次得到純顆粒；2.壁效應嚴重，容易使顆粒變形、聚集而失活。對分離純度要求較高的樣品應用此法，容易造成被分離物的大量丟失，變性以及造成污染，尤其對于一些沉降系數(shù)相差不太大的組份要獲得完全的分離提純比較困難，所以該離心方法常用于要求不嚴格樣本的初步分離和大批量標本的處理，例如分離已破碎的細胞各組份等。密度梯度離心法(isodensitycentrifugationmethod)又稱為區(qū)帶離心法。樣品在一定惰性梯度介質中進行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力作用下把顆粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。二、密度梯度離心法分離前分離后密度梯度離心法

優(yōu)點缺點1.分辨率高，分離效果好，可一次獲得較純顆粒；2.適用范圍廣，既能分離沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；3.顆粒不會積壓變形，能保持其活性，并可防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。1.離心時間較長；需要制備成梯度液；2.操作嚴格，不宜掌握。離心時先將樣品溶液置于一個由梯度材料形成的密度梯度液中，離心后被分離組份以區(qū)帶層分布于梯度液中。密度梯度離心機密度梯度離心法不同的離心分離的原理

1.速率區(qū)帶離心法2.等密度區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法是根據(jù)被分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，離心后分別處于不同的密度梯度層內(nèi)形成幾條分開的樣品區(qū)帶，達到彼此分離的目的。梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時起著支持介質和穩(wěn)定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合，常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。（一）速率區(qū)帶離心法此離心法須嚴格控制離心時間，使得既能使各種粒子在介質梯度中形成區(qū)帶，又要把時間控制在任一粒子達到沉淀前。若離心時間過長，所有的樣品全部都到達離心管底部；若離心時間不足，則樣品還沒有分離。此法是一種不完全的沉降，沉降受物質本身大小的影響較大，因此一般是在物質大小相異而密度相同的情況下應用。臨床實驗室常用Percoll作分離溶液，用于靜脈血中單個核細胞的分離。先把梯度液加入離心管中，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加（正梯度）。將所需分離的樣品小心的加至密度梯度溶液的頂部，樣品在梯度溶液表面形成一負梯度（如右圖所示）。速率區(qū)帶離心示意圖當不同顆粒存在浮力密度差時，在離心力場中，顆粒一直沿梯度移動到它們密度恰好相等的位置上（即等密度點）形成區(qū)帶，故稱為等密度區(qū)帶離心法。顆粒的有效分離取決于其浮力密度差,與顆粒的大小和形狀無關，但后兩者決定著達到平衡的速率、時間和區(qū)帶的寬度。顆粒的浮力密度與其原來的密度、水化程度及梯度溶質的通透性或溶質與顆粒的結合等因素有關。因此，要求介質梯度應有一定的陡度，要有足夠的離心時間形成梯度顆粒的再分配，進一步離心也不會有影響。（二）等密度區(qū)帶離心法第二節(jié)常用的離心方法操作中，一般是將被分離樣品均勻分布于梯度液中，離心后，粒子會移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶，收集好所需區(qū)帶即為純化的組份。由于其梯度形成需要梯度液的沉降與擴散相平衡，需經(jīng)長時間離心后方可形成穩(wěn)定的梯度，所以等密度離心法主要用于科研及實驗室特殊方面的樣品組份的分離和純化。等密度區(qū)帶離心示意圖時間方法相同點不同點等密度區(qū)帶離心法預先制備分離液使梯度液的最大密度不超過樣品在該梯度中的浮力密度，利用這類生物組份在尺寸上的差異形成的沉降速率的不同，選擇某一特定離心時間，當它們中的各個純樣品區(qū)帶之間的距離拉得最遠時停止離心即可以達到分離目的。

速率區(qū)帶離心法是一種平衡離心法，利用被分離物的密度的差別而進行分離純化，從梯度介質形成到樣品顆粒形成等密度區(qū)帶，與分離物的大小及形狀無關。方法特點差速離心法根據(jù)樣品組份的沉降系數(shù)不同進行分離速率區(qū)帶離心法根據(jù)樣品組份的沉降系數(shù)不同進行分離等密度區(qū)帶離心法根據(jù)樣品組份的密度不同進行分離三、分析型超速離心法分析性超速離心法主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結構，而不是專門收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉子和檢測手段，以便連續(xù)監(jiān)測物質在一個離心場中的沉降過程。這相應的離心機稱為分析型超速離心機，分析型超速離心機（一）分析性超速離心法的工作原理分析型超速離心機主要由一個橢圓形的轉子、一套真空系統(tǒng)和一套光學系統(tǒng)所組成。該轉子通過一個柔性的軸聯(lián)接成一個高速的驅動裝置，此軸可使轉子在旋轉時形成自己的軸。光學系統(tǒng)真空系統(tǒng)轉子在一個冷凍的真空腔中旋轉，其容納了兩個小室：分析室和配衡室。配衡室是一個經(jīng)過精密加工的金屬塊，作為分析室的平衡用。離心機配衡室自動配衡模塊分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉子中，其工作原理與一個普遍水平轉子相同。分析室有上下兩個平面的石英窗，離心機中裝有的光學系統(tǒng)可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質，可以通過對紫外光的吸收（如對蛋白質和DNA）或折射率的不同對沉降物進行監(jiān)測。紫外線吸收透鏡電子感應光譜光學系統(tǒng)當光線通過一個具有不同密度區(qū)的透明液時，在這些區(qū)帶的界面上產(chǎn)生光的折射。分析室中物質沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就像一個折射的透鏡，在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一個“峰”。由于沉降不斷進行，界面向前推進，“峰”也在移動，從峰移動的速度可以得到物質沉降速度的指標。分析型超速離心系統(tǒng)的示意圖（二）分析性超速離心法的應用范圍1.測定生物大分子的相對分子重量測定相對分子重量中應用最廣的是沉降速度法。超速離心的高速使得任意分布的粒子通過溶劑從旋轉的中心輻射地向外移動，在清除了粒子的溶劑和尚含有沉降物的溶劑之間形成一個明顯的界面，該界面隨時間的推移而移動，這就是粒子沉降速度的一個指標。用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數(shù)。2.生物大分子的純度估計分析型超速離心機已廣泛地應用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質的純度。用沉降速度的技術來分析沉降界面是測定制劑均質性的最常用方法之一，出現(xiàn)單一清晰的界面一般認為是均質的，如有雜質則在主峰的一側或兩側出現(xiàn)小峰。

3.分析生物大分子中的構象變化分析型超速離心機已成功地用于檢測大分子構象的變化，例如DNA可能以單股或雙股出現(xiàn)，其中每一股在本質上可能是線性的，也可能是環(huán)狀的。如果遇到某種因素（溫度或有機溶劑），DNA分子可能發(fā)生一些構象上的變化，這些變化也許可逆、也許不可逆，這些構象上的變化可以通過檢查樣品在沉降速度上的差異來證實。第三節(jié)離心機的分類與結構一、離心機的分類按用途分按轉速分按結構分可分為制備型、分析型和制備分析兩用型可分為低速、高速、超速等離心機可分為臺式、多管微量式、細胞涂片式、血液洗滌式、高速冷凍式、大容量低速冷凍式、臺式低速自動平衡離心機等（一）低速離心機是臨床實驗室常規(guī)使用的一類離心機。其最大轉速在10000r/min以內(nèi)，相對離心力在15000×g以內(nèi)，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離。主要用作血漿、血清的分離及腦脊液、胸腹水、尿液等有形成份的分離。轉子普通離心機（二）高速離心機最大轉速為20000rpm～25000rpm（r/min）,最大相對離心力為89000×g，最大容量可達3升,分離形式是固液沉降分離。主要用于臨床實驗室分子生物學中的DNA、RNA的分離和基礎實驗室對各種生物細胞、無機物溶液、懸浮液及膠體溶液的分離、濃縮、提純樣品等。高速離心機可進行微生物菌體、細胞碎片、大細胞器、硫酸銨沉淀和免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細胞器(如核蛋白體)或單個分子。為了防止高速離心過程中溫度升高而使酶等生物分子變性失活,還裝設了冷凍裝置,因此又稱高速冷凍離心機。離心機的冷凍裝置（三）超速離心機轉速可達50000rpm～80000rpm，相對離心力最大可達510000×g，離心容量由幾十毫升至2升。分離形式是差速沉降分離和密度梯度區(qū)帶分離，離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。為了防止樣品液濺出，附有離心管帽；為了防止溫度升高，裝有冷凍裝置。超速離心機超速離心機的出現(xiàn)，使生物科學的研究領域有了新的擴展，它能使過去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細胞器得到分級分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質和多糖等。按用途可分為制備型分析型分析制備兩用型超速離心機制備型超速離心機主要用于生物大分子、細胞器和病毒等的分離純化，能使亞細胞器分級分離，并可用于測定蛋白質及核酸的分子量。制備型超速離心機分析型超速離心機裝有光學系統(tǒng)，可拍照、測量、數(shù)字輸出、打印自動顯示系統(tǒng)等，可以通過光學系統(tǒng)對測試樣品的沉降過程及純度進行觀察。分析型超速離心機分析型超速離心機的主要特點：1.能在短時間內(nèi)，用少量樣品得到一些重要信息2.能確定生物大分子是否存在及大致的含量3.計算生物大分子的沉降系數(shù)4.結合界面擴散，估計分子的大小5.檢測分子的不均一性及混合物中各組份的比例6.測定生物大分子的分子量7.可以檢測生物大分子的構象變化等隨著科學技術的不斷發(fā)展，離心機技術日益創(chuàng)新。離心技術與臨床實驗室相接軌，由以往廣泛型逐漸走向專業(yè)性很強的單一型專用離心機，對所分離的不同物質規(guī)定了一定的轉速，相對離心力及時間，使離心操作向規(guī)范化、標準化、科學化及專業(yè)化方向發(fā)展。相應產(chǎn)生的離心機有免疫血液離心機、微量毛細管離心機、尿沉渣分離離心機、細胞涂片離心機等。（四）專用離心機1.免疫血液離心機

是為臨床輸血所設計的一種帶有標準化操作程序的專用離心機?？捎糜诎准毎乖瓩z測的淋巴細胞分離、洗滌及細胞染色體制作的細胞分離；用于血小板的分離、凝血酶的處理離心；用于抗人球蛋白試驗；用于洗滌紅細胞及血漿的分離等。免疫血液離心機2.微量毛細管離心機

是一種實驗室專用離心機，操作程序為自動化控制。最大容量一次可放24根毛細管，最高轉速可達12000r/min，相對離心力最大可達14800g。在臨床實驗室用于血溶比試驗，微量血細胞比積值的測定及同位素微量標記物的測定等。微量毛細管離心機3.尿沉渣分離離心機與尿液工作站相配套,在低速離心機的基礎上，設定了特定專用水平轉子。最高轉速4000r／min，相對離心力可達2810×g,實際工作中取尿樣10ml于專用離心管中，離心轉速設置在1500r／min，相對離心力為400×g，離心時間為5分鐘，一次可處理尿液標本為32×10ml,廣泛應用在臨床實驗室及基礎教學實驗室。尿沉渣分離離心機

4.細胞涂片離心機采用水平杯式轉子，當樣品經(jīng)梯度離心分離出雜質，使用離心力將細胞從液體懸浮物中分離出來，甩到載玻片上。染液由自動噴霧器的轉盤噴到每一張涂片上，用離心的方法除去過剩的染液。細胞、細菌分布均勻，無重疊，染色效果好。主要用于臨床和基礎實驗室中分泌物、腦脊液、胸腹水等標本的脫落細胞及細菌的檢查。細胞涂片離心機（一）低速離心機其結構較為簡單。由電動機、離心轉盤、調速器、定時器、離心套管、與底座等主要部件構成.二、離心機的結構機蓋離心室電機主軸電動機轉盤離心套管底座低速離心機的結構（二）高速(冷凍)離心機通常有轉動裝置、速度控制系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、離心室、離心轉頭及安全保護裝置等。由于轉速高，帶有低溫控制裝置，離心室的溫度可以調節(jié)和維持在0℃～40℃。轉速、溫度和時間也都可以嚴格準確控制，并有指針或數(shù)字顯示。

高速冷凍離心機

(三)超速(冷凍)離心機

超速冷凍離心機超速冷凍離心機（組成）驅動和速度控制溫度控制真空系統(tǒng)轉

頭轉頭（rotor）是離心機分離樣品的核心部件，它的轉速與轉頭的材料及強度有關。低速離心機一般采用強度好，重量輕的超硬鋁合金；超速離心機采用鈦合金。一般來說，對同一類型離心機重量輕、容量小的轉頭轉速要高；反之轉速要低。三、離心機轉頭的分類應用及功能1.固定角轉頭(fixed-anglerotor）：主要用于分離沉降速度有明顯差異的顆粒樣品。但具有“壁效應”，在離心管內(nèi)將會引起強烈的對流，影響分離純度。固定角轉頭

2.甩平式轉頭(swingoutrotor,swingbackedrotor):用于樣品作低密度梯度離心，有敞開式和封閉式兩種。

敞開式轉頭用于制備容量大、轉速小于10000rpm、離心力場在16000xg以內(nèi)時，主要用于樣品的初分離。敞開式轉頭封閉式轉頭封閉式轉頭制備容量較敞開式小，轉速大。主要用于線粒體、細胞核等的分離和密度梯度離心。

3.連續(xù)流動轉頭(consecutiveflowrotor）主要用于懸浮介質中高速分離較小的顆粒物質，這種轉頭是利用離心淘析技術在無菌和低溫條件下，被分離的組份，能保持活性，回收率高等優(yōu)點。被廣泛應用于科研和實驗室工作。連續(xù)流動轉頭當轉子在運行速度旋轉時，樣品不斷地通過密封組件中心管道泵入轉子內(nèi)，沿著軸心流底部，井在離心力的作用下使樣品顆粒和其它溶液移動到密度梯度表面層。該技術對大規(guī)模分離提取和富集組織培養(yǎng)液、植物病毒、動物病毒和蟲病毒是非常有用的技術，另外也可以用來收獲細菌，純化組織勻漿中的亞細胞結構和水污染研究中分離粘土顆粒

4.區(qū)帶轉頭(zonalrotor)

主要用于大容量的密度梯度離心，轉頭由四塊葉片的轉頭體和密封系統(tǒng)構成四個扇形小室，葉片上有徑向導管，梯度液通過密封管道泵入轉子內(nèi)，然后通過密封組件中心輸液管加入樣品。由于試樣及溶劑直接接觸轉頭，所以對轉頭的耐腐蝕性要求高，區(qū)帶轉頭避免了用離心管所引起的壁效應和干擾，提高了分辨率。

區(qū)帶轉頭扇形小室葉片徑向導管5.垂直轉頭（verticalrotor）

使用垂直轉頭對離心管密封要求嚴格，需要加離心管帽或用可熱封的塑料離心管。垂直轉頭是一種固定角轉頭，離心管垂直放置。垂直轉頭分離的粒子位移距離等于離心管直徑，主要用于樣品在短時間作密度梯度離心。

垂直轉頭四、離心機的主要技術參數(shù)及性能指標(一)、離心機的主要技術參數(shù)

1.最大轉速:離心轉頭可達到的最大轉速，單位是rpm2.最大離心力:離心機可產(chǎn)生的最大相對離心力場RCF，單位是g3.最大容量:離心機一次可分離樣品的最大體積，通常表示為mXn。m為一次可容納的最多離心管數(shù)，n為一個離心管可容納分離樣品的最大體積，單位是ml；

4.調速范圍（轉速設置范圍）:離心機轉頭轉速可調整的范圍

5.溫度控制范圍:離心機工作時可控制的樣品溫度范圍

6.工作電壓:一般指離心機電極工作所需的電壓

7.電源功率:通常指離心機電機的額定功率標記符號名稱轉頭參數(shù)意義

FA固定角轉頭

Rmax表示從轉軸中心至試管最外緣或試管底的距離

V垂直轉頭

Rmin表示從轉軸中心至試管最內(nèi)緣或試管頂?shù)木嚯x

SW甩平式轉頭

RPMmax表示轉頭的最高安全轉速

CF連續(xù)流動轉頭

RCFmax表示轉頭以RPMmax運轉時，在Rmax處的相對離心力

Z區(qū)帶轉頭

RCFmin表示轉頭以RPMmax運轉時，在Rmin處的相對離心力Ｋ是衡量轉頭相對效率的量，Ｋ值愈小,效率愈高，所需離心時間就愈短。（二）離心機轉頭常用標記及參數(shù)

Ti鈦或鈦合金制成的轉頭通常，對顆粒的質量和密度與溶液相差較大的分離樣品，只要選擇合適的離心轉速和離心時間，就能達到較好的分離效果。對存在兩種以上質量和密度不同的樣品顆粒，則可采用差速離心法。差速離心方法常針對不同的離心速度和離心時間要求，使沉降速度不同的樣品顆粒按批次分離。

一、離心方法的選擇對于有密度梯度差異的樣品介質，可采用密度梯度離心法，使沉降系數(shù)比較接近的物質得以分離。當不同樣品顆粒的密度范圍在離心介質的密度梯度范圍內(nèi)時，可采用等密度梯度離心。分離的效果除了與離心機種類、離心方法、離心介質及密度梯度等因素有關以外，離心機轉速和離心時間的確定、離心介質的pH值和溫度等條件也至關重要。二、離心機的轉速、離心時間、溫度和pH值的確定

離心機轉速

即離心機旋轉軸在單位時間內(nèi)旋轉的周數(shù)（轉／分鐘），單位一般為rpm（roundsperminute）。相對離心力與離心機轉速平方成正比。方法離心時間差速離心是指某種顆粒完全沉降到離心管底的時間等密度梯度離心是指顆粒完全到達等密度點的平衡時間密度梯度離心是指形成界限分明的區(qū)帶所需的時間

溫度和pH值

離心溫度一般控制在4℃左右，對于某些熱穩(wěn)定性較好的酶等，也可以在室溫下進行。但在超速或高速離心時，轉子高速旋轉會引起溫度升高，必須采用冷凍系統(tǒng)，使溫度保持在一定范圍內(nèi)。離心介質溶液的pH值應處于酶穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，必要時可采用緩沖液。另外，過酸或過堿還可能引起轉子和離心機的其它部件的腐蝕，應盡量避免。三、離心機的應用和維護離心機因其轉速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴重事故，因此使用時必須嚴格遵守操作規(guī)程。

1.

必須事先平衡離心管和其內(nèi)容物，要對稱放置，轉頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，以便使負載均勻地分布在轉頭的周圍。2.

開口離心機不能裝載過多溶液，以防離心時甩出，造成轉頭不平衡、生銹或被腐蝕。制備型超速離心機的離心管，則要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。嚴禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。

3.離心過程中應隨時觀察離心機上的儀表是否正常工作，如有異常應立即停機檢查，及時排除故障。未找出原因前不得繼續(xù)運轉。

4.每次使用前要嚴格檢查轉頭孔內(nèi)是否有異物和污垢，以保持平衡。每次使用后，都必須仔細檢查，并用50℃~60℃的溫水及中性洗滌劑浸泡清洗或定期用消毒液消毒（每周消毒一次），最后用蒸餾水沖洗，軟布擦干后用電吹風吹干、上蠟、干燥保存。每一轉頭都應有使用檔案，若超過了該轉頭的最高使用時限，則須按規(guī)定降速使用。

5.控制塑料離心管的使用次數(shù)并注意規(guī)格配套。離心過程中不得開啟離心室蓋，不得用手或異物碰撞正在旋轉中的轉頭及離心管。

6.低溫離心樣品時，應先將空的轉頭在2x10rpm預冷一定時間，預冷時溫度控制在0℃左右，也可將轉頭放在冰箱中，預冷數(shù)小時備用，離心杯可直接存放在冰箱中預冷。37.

每隔三個月應對離心機主機校正一次水平度，每使用5億轉處理真空泵油一次，每使用1500小時左右，應清洗驅動部位軸承并加上高速潤滑油脂，轉軸與轉頭接合部應經(jīng)常涂酯防銹，長期不用時應涂防銹油加油紙包扎。離心機平時不用時，應每月低速開機1次~2次，每次0.5小時。五、離心技術的應用實例

（一）密度梯度離心法分離外周血單個核細胞

（二）快速氯化銫密度梯度離心法提取分離大質粒DNA

（一）密度梯度離心法分離外周血單個核細胞

原理：紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。方法：在中號試管內(nèi)加入適量淋巴細胞分離液；取肝素抗凝靜脈血與等量Hank‘s液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。

2000rpm水平離心20分鐘；離心后管內(nèi)分為三層：上層為血漿和Hank’s液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液。第四節(jié)離心機的應用和維護在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶。用毛細管插到云霧層，吸取單個核細胞，置入另一中號試管內(nèi)，加入５倍以上體積的Hank’s液，1500rpm離心10分鐘，洗滌細胞兩次；末次離心后,棄上清液，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2％臺盼藍染液混合，于血球計數(shù)板上，計數(shù)四個大方格內(nèi)的細胞總數(shù)。第四節(jié)離心機的應用和維護單個核細胞濃度:

細胞活力檢測：死的細胞可被染成藍色，活細胞