生化技術自我整理

一、生命大分子制備1、生物大分子的特性：（1）由結構比較簡樸的小分子所組成（2）具有非常復雜的結構2、生物大分子制備難度：（1）生物材料的組成極其復雜（2）許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的環(huán)節(jié)繁多，流程又長（3）許多生物大分子極易失活，所以分離純化時一定要選用最適宜的環(huán)境和條件（4）溶液的溫度、PH值、離子強度等各種參數(shù)綜合影響溶液中生物大分子的制備，很難準確估計和判斷，個人的實驗技術水平和經驗對實驗結果會有較大的影響。3、生物大分子制備的通常環(huán)節(jié)：（1）擬定要制備的生物大分子的目的和規(guī)定（2）建立相應的可靠的分析測定方法（3）通過文獻調研和預備性實驗，掌握生物大分子的物理化學性質（4）生物材料的破碎和預解決（5）分離純化方案的選擇和探索（6）生物大分子制備物的純度的鑒定。規(guī)定達成一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或HPLC和毛細管電泳都是一個峰（7）產物的濃縮，干燥和保存4、蛋白質的分離純化：（1）材料獲得：天然獲得；基因工程手段獲得（2）粗分離：除去大量雜質和雜蛋白，初步濃縮目的蛋白（3）細分離：常壓柱層析：分子篩層析、離子互換層析、疏水層析、親和層析（4）鑒定：純度、濃度、活性5、蛋白質的結構研究：（1）一級結構：氨基酸組成分析、末端分析、肽譜分析（2）二級結構：紫外光譜法、熒光光譜法、園二色性法、紅外光譜法、激光拉曼光譜法（3）高級結構：X-射線衍射法、核磁共振法（4）結構與功能的關系：突變、晶體分析、蛋白與蛋白的互相作用6、酶活力：酶催化一定化學反映的能力。7、酶活力單位：每分鐘催化生成一微摩爾產生所需要的酶量為一個酶活力單位。8、制備生物大分子的方法：（1）以分子大小和形態(tài)的差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等（2）以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析。萃取、分派層析、選擇性沉淀和結晶等（3）以電荷差異為依據(jù)的方法：電泳、電滲析、等電點沉淀、吸附層析和離子互換層析等（4）以生物學功能專一性為依據(jù)的方法：親和層析等9、酶的比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位婁，是酶制劑純度的一個指標10、回收率：純化過程中酶活性的收率11、純化位數(shù)：指提純后與提純前酶比活力的比值增大純化位數(shù)和緩慢減少回收率的方法屬于有應用價值的方法。12、蛋白質的鑒定：（1）濃度：紫外法、Lowry法、Bradford法、凱氏定氮法、雙縮脲法（2）純度：電泳法、化學法、儀器法（3）分子量測定：SDS、凝膠過濾、氨基酸組成分析、毛細管電泳（4）等電點：等電聚焦電泳（5）活性：激酶、磷酸化酶、運用靶酶活性、氧化還原酶、ELISA。二、沉淀法1、沉淀法：純化大分子物質的一種經典方法。操作簡樸，成本低廉。不僅用于實驗室中，也用于某些生產目的的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質和酶時最常用的方法。沉淀是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程，可以有選擇性的沉淀雜質或有效成分。原理：不同物質在溶劑中的溶解度不同而達成分離的目的(又稱溶解度法)改變溶液的某些性質（如pH、極性、離子強度、金屬離子等），使抽提液中各種物質的溶解度發(fā)生變化。選擇適當?shù)娜芤壕湍苁褂蛛x的有效成分呈現(xiàn)最大溶解度，而使雜質呈現(xiàn)最小溶解度，或者相反，有效成分呈現(xiàn)最小溶解度，而雜質呈現(xiàn)最大溶解度。然后通過適當解決，即可達成從抽提液中分離有效成分的目的。2、沉淀可以分為可逆性沉淀和不可逆性沉淀可逆性沉淀：在沉淀過程中，有效成分結構和性質都沒發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液?？赡娉恋硎欠蛛x和純化有效成分的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法、有機溶劑沉淀法、選擇性沉淀法。不可逆沉淀：在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，并且也破壞了蛋白質的結構和性質，產生的蛋白質沉淀物不也許再重新溶解于水溶液。加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀、生物堿沉淀。（沉淀物一般是雜質）3、常用的沉淀方法和沉淀劑：（1）鹽析法：選用中性鹽為沉淀劑，多用于各種蛋白質和酶的分離純化。（2）有機溶劑沉淀法：多用于生物小分子，多糖及核酸類產品的分離純化，有時也用于蛋白質沉淀。（3）等電點沉淀法：用于氨基酸，蛋白質及其他兩性物質的沉淀，但單獨應用較少，多與其他方法結合使用。4、制備蛋白質：（1）鹽析法：在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。1-1．優(yōu)點：①成本低，不需要特別昂貴的設備。②操作簡樸、安全。③對許多生物活性物質具有穩(wěn)定作用。在純水中加入少量中性鹽，蛋白質的溶解度比在純水時大大增長，稱為“鹽溶”現(xiàn)象。但中性鹽的濃度增長至一定期，蛋白質的溶解度又逐漸下降，直至沉淀析出，稱為“鹽析”現(xiàn)象。由于中性鹽的親水性大于蛋白質和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質分子即形成沉淀。1-2．二步法1.選擇一定濃度范圍的鹽溶液（如0～35%飽和度硫酸銨），使部分雜質呈“鹽析”（沉淀）狀態(tài)，有效成分呈“鹽溶”（溶解）狀態(tài)。pH應偏離有效成分的pI值，靠近雜質的pI值。經離心分離后得到上清液.2.再選擇一定濃度范圍的鹽溶液（如35%～55%飽和度的鹽溶液），使有效成分等物質呈鹽析狀態(tài)，而另一部分雜質呈鹽溶狀態(tài)，pH應調至接近有效成分的pI值。用離心法收集的沉淀物即為初步純化的有效成分物質。1-3.常用的中性鹽：硫酸銨。優(yōu)點：①溶解度大，對溫度不敏感②分離效果好③不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質結構的作用④價格便宜，廢液不污染環(huán)境缺陷：樣品欲繼續(xù)純化，需花一定期間脫鹽。1-4.影響因素：1.鹽析常數(shù)（Ks）；（lgS（溶解度）=β-Ks·M（鹽的濃度），Ks為鹽析常數(shù),其數(shù)值大,表達分級范圍窄,鹽析效果好）2.鹽的分級范圍的差異性；（鹽析范圍（鹽離子強度）差異明顯，分離效果好）3.pH值和鹽濃度；（pH值常選在該蛋白質的等電點附近）4.蛋白質的濃度和純度；（蛋白質濃度過高，則易產生各種蛋白質的共沉淀作用，一般控制樣品液蛋白濃度在0.2%～2%為宜。）5.溫度和時間的影響（對于多數(shù)無機鹽和小分子有機物，溫度升高溶解度加大，但對于蛋白質、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小）1-5.脫鹽：凝膠過濾、透析。（2）有機溶劑沉淀法：1-1.基本原理1：有機溶劑能減少水溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱溶劑分子與蛋白質分子間的互相作用力，增長了蛋白質分子間的互相作用，導致蛋白質溶解度減少而沉淀。基本原理2：有機溶劑與水互溶,從蛋白質分子周邊的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。1-2.優(yōu)點：①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質或其他溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉淀。②沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應用。缺陷:對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。1-3．有機溶劑的選擇:要能與水互溶。沉淀蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀劑是乙醇。有機溶劑濃度的計算：

V=V0(S2－S1)／(100－S2)V=需加入100％濃度有機溶劑的體積V0=原溶液體積S1=原溶液中有機溶劑的濃度S2=所規(guī)定達成的有機溶劑的濃度100是指加入的有機溶劑濃度為100％，如所加入的有機溶劑的濃度為95％，上式的(100－S2)項應改為(95－S2)。（3）蛋白質沉淀劑：所用的試劑僅對一類或一種蛋白質沉淀起作用。堿性蛋白質、凝集素（優(yōu)點：反映條件較溫和，專一性強）、重金屬（要控制在較溫和的條件下進行）。（4）聚乙二醇沉淀作用：聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發(fā)生沉淀作用．在生物大分子制備中，沉淀作用較滿意的聚合物是分子量在400～6000之間的聚乙二醇． 優(yōu)點：操作條件溫和，不易引起生物大分子變性；沉淀效能高；沉淀后有機聚合物容易去除。（5）選擇性變性沉淀法：運用蛋白質、酶與核酸等生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變化沉淀而得到分離提純。熱變性、表面活性劑和有機溶劑變性、選擇性酸堿變性。（6）晶體沉淀法：蛋白質結晶形成過程。5、制備核酸：從生物材料中分離出的DNA或RNA，往往是以DNA-蛋白質（DNP）或RNA-蛋白質（RNP）復合物形式存在的。因此，制備核酸時，需先將這些復合物進行解聚，除去蛋白質，分離DNA與RNA,然后再通過沉淀法得到核酸。（1）DNP/RNP復合物的解聚：去污劑（SDS等可使膜蛋白和脂肪溶解，隨后加入適量的乙酸鉀溶液以沉淀核酸抽提液中的SDS-蛋白質）、有機溶劑（有機溶劑如苯酚、氯仿是蛋白質的一類變性劑，上層水相為核酸）、蛋白水解酶（可避免剪切和破壞核酸）（2）DNA與RNA的分離：酶水解法（提取DNA時，可用RNase水解RNA雜質）（3）核酸的沉淀：乙醇-鹽溶液（加入NaAC或NH4AC以及2倍體積（對DNA）或2.5倍體積（對RNA）的冷無水乙醇，就可將核酸沉淀出來）、異丙醇（加入NaAC和0.54-1倍體積的異丙醇，離心即可得到核酸沉淀）三、層析法1、層析技術：亦稱色譜技術，是一種物理的分離方法。是運用混合物中各組分的物理化學性質的差別，使各組分以不同限度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而達成分離。2、共同特點：①色譜分離體系都有流動相和固定相兩個相。②色譜過程中，流動相對固定相作連續(xù)的相對運動。③被分離樣品在兩相中具有不同的作用力，各組分混合物在流動相的帶動下通過固定相，實現(xiàn)分離。層析法的最大特點是分離效率高，它能分離各種性質極相類似的物質。3、常用術語：（1）色譜柱：裝有固定相的管子玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜柱（2）固定相：層析的一個基質，可以是固體物質（如吸附劑，凝膠，離子互換劑等），也可以是液體物質（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，互換等作用。（3）流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等。構成柱層析的流動相的溶液涉及：平衡液（用于柱平衡、溶解樣品的緩沖液）、洗滌液（作為洗去雜質的溶液）和洗脫液（改變洗滌液的組成作為洗脫有效成分的溶液）。（4）層析:當流動相中樣品混合物通過固定相時，就會與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質和結構上的差異，與固定相互相作用的類型、強弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的順序從固定相中流出。（5）操作容量（互換容量）：在一定條件下，某種組分與基質（固定相）反映達成平衡時，存在于基質上的飽和容量。（數(shù)值越大，表白基質對該物質的親合力越強。）（6）分派系數(shù)：在一定條件下，某種組分在固定相和流動相中含量（濃度）的比值。用K表達。K=溶質在固定相中的濃度/溶質在流動相中的濃度=Cs/Cm凝膠層析，分派系數(shù)實質上表達某個組分在內水體積和在外水體積中的濃度分派關系。（7）遷移率（比移值）：在一定條件下，在相同的時間內某一組分在固定相移動的距離與流動相自身移動的距離之比值。用Rf表達。K↑→Rf↓（8）Vt＝Vo＋Vi＋VgVo:外水體積，是指凝膠柱中凝膠顆粒周邊空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。即柱床內凝膠顆粒外空隙之間的水相體積?？梢酝ㄟ^測定完全排阻的大分子物質的洗脫體積來測定，比如藍色葡聚糖-2023，分子量為200萬，所有型號凝膠都會排阻Vi：內水體積，是指凝膠顆粒中孔穴的體積，固定相體積就是指內水體積。即凝膠顆粒內部所含水相體積?？捎昧蛩徜@、N-乙酰酪氨酸乙酯或其它與凝膠無吸附力的小分子物質測定。Vg：基質體積，是指凝膠顆粒實際骨架體積。即凝膠自身的體積。Vt：床體積，就是指凝膠柱所能容納的總體積。πr2h。Ve：洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積，即自加入樣品時到組分最大濃度峰出現(xiàn)時所流出的體積。大分子先被洗脫出來，Ve值小，Kav值也??；而小分子后被洗脫出來，Ve值大，Kav值也大。對于完全排阻的大分子，Ve＝Vo，Kav＝0；而對于完全滲透的小分子，Ve＝Vt，Kav＝1。一般Kav值在0－1之間，如Kav值大于1，則表達尚有些物質與凝膠有吸附作用，則Ve>Vt。(9)塔板理論：假定：1）塔板之間不連續(xù)；2）塔板之間無分子擴散；3）組分在各塔板內兩相間的分派瞬間達至平衡，達一次平衡所需柱長為理論塔板高度H；4）某組分在所有塔板上的分派系數(shù)相同；5）流動相以不連續(xù)方式加入，即以一個一個的塔板體積加入。當塔板數(shù)n較少時，組分在柱內達分派平衡的次數(shù)較少，曲線呈峰形，但不對稱；當塔板數(shù)n>50時，峰形接近正態(tài)分布。理論塔板數(shù)：可得理論塔板高度H越小、理論塔板數(shù)n越多、色譜峰越窄，則柱效越高。分離度也大，從而提高了柱效.(9)速率理論：u為流動相線速度；A，B，C為常數(shù)，其中A—分別表達渦流擴散系數(shù)；B—分子擴散系數(shù)；C—傳質阻力系數(shù)（涉及液相和固相傳質阻力系數(shù)）。4、色譜法分類：（1）按固定相的外型：柱色譜(固定相裝于柱內的色譜法)、平板色譜(固定相呈平板狀的色譜)（2）按分離機理：吸附色譜(不同組份在固定相的吸附能力強弱不同)、分派色譜(不同組份在固定相上的溶解能力（分派系數(shù)）不同)、離子互換色譜(不同組份在固定相（離子互換劑）上的親和力不同)、凝膠色譜(不同尺寸分子在固定相上（多孔凝膠）的滲透作用不同)、親和色譜(不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力不同)（3）按流動相形式：氣相色譜（GC）（氣固（GSC）、氣液（GLC））、液相色譜（LC）（液固（LSC）、液液（LLC））（4）按壓力：高壓液相、普通液相（5）按照展開程序：洗脫法（用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑）、頂替法（對固定相的吸附或溶解能力比所有試樣組分強的物質為頂替劑）、和迎頭法。1、吸附層析：1、吸附柱層析：吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相，由于吸附劑對不同物質有不同的吸附力而使混合物分離的一種層析方法1-1.原理：運用吸附層析介質表面的活性分子或活性基團，對流動相中不同溶質產生吸附作用，運用其對不同溶質吸附能力的強弱而進行分離在吸附劑的表面存在著許多隨機分布的吸附位點，這些位點通過范德瓦爾力和靜電引力與蛋白質和核酸等生物分子結合，其結合力的大小與各種生物分子的結構和吸附劑的性質有密切關系。1-2.一般環(huán)節(jié)（以羥基磷灰石為例）：解決基質 ——裝柱——平衡——上樣——洗滌——洗脫——收集（透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥）與繪制洗脫曲線——基質再生1-3.注意柱的d:h=1:10～1:40吸附劑用量為分離樣品的30～50倍分析時的加樣量一般≤1／10Vt制備時的加樣量一般≤1／2Vt1-4、吸附劑有極性和非極性兩種，前者有羥基磷灰石，硅膠，氧化鋁和人造沸石等，后者有活性炭等。優(yōu)秀吸附劑：表面積大，顆粒均勻，吸附選擇性好，穩(wěn)定性強，成本低廉。一般極性強的吸附劑易吸附極性強的物質，非極性的吸附劑易吸附非極性的物質。但為了便于解吸附，對于極性大的物質應選擇極性小的吸附劑，否則反之。1-5、洗脫1-5-1、合適的洗脫劑：純度高；穩(wěn)定性好；能較完全洗脫下所分離的成分；粘度小；易和所需要的成分分開。1-5-2.（1）簡樸洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結束。（2）分步洗脫：按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進行逐級洗脫（3）梯度洗脫：當混合物中組分復雜且性質差異較小時采用。洗脫能力是逐步連續(xù)增長的，梯度可以指濃度、極性、離子強度或PH等。最常用的是濃度梯度。2、薄層層析：以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相，按紙層析操作進行展層的一種層析方法簡便、快速、微量的層析方法；用的吸附劑及其選擇原則和柱層析相同；（1）與柱層析的重要區(qū)別：薄層層析規(guī)定吸附劑的粒度更細，并規(guī)定粒度均勻（2）操作方法：薄層板的制備（薄層厚度一般為0.2～0.5mm，涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干，再在105～110℃活化約60分鐘，置干燥器中備用）——點樣（用定量微升毛細管按規(guī)定吸取溶液后，以垂直方向小心接觸板面使成圓點狀，原點直徑應不大于3mm，點樣時須注意盡量不要損害薄層表面。）——展開（點樣后的薄層板置入加有展開劑的薄層展開箱中，密閉。一般采用上行展開，浸入后展開劑前沿距原點約5mm。展開距離一般在10cm左右）——檢測（有顏色者直接在日光下觀測，沒有的可以用噴灑法或浸漬法均勻鋪上顯色劑在熒光下觀測，還可在薄層掃描儀中進行光密度掃描或熒光掃描。斑點移動的距離Rf=展層劑移動的距離）（3）影響薄層色譜分析的重要因素：A．樣品的預解決及供試液的制備B、薄層色譜的點樣技術C、吸附劑的活性與相對濕度的影響D、溶劑蒸汽在薄層色譜中的作用E、溫度的影響（4）儀器與材料：薄層板及吸附劑；涂布器；點樣器材；展開相；顯色與檢測儀器。（5）常用吸附劑：硅膠層析用硅膠為一多孔性物質，分子中具有硅氧烷的交鏈結構，同時在顆粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強弱與硅醇基的含量多少有關。硅醇基吸附水分后通過氫鍵形成水合硅醇基，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增長而減少。吸附色譜法一般采用含水量10-12%的硅膠，當含水量小于1%時活性最高，若吸水量超過17％，吸附力極弱不能用作為吸附劑。對硅膠的活化：加熱脫水法活化。（6）展開劑種類：單一溶劑，混合溶劑規(guī)定：*將混合樣品分開*易揮發(fā)，粘度小，組成簡樸*對樣品的定性與定量無干擾*毒性小，對人與環(huán)境安全選擇：選用時考慮展層劑的極性與溶解度單一溶劑極性石油醚＜環(huán)己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜正丙醇＜乙醇＜甲醇＜吡啶＜乙醚3、聚酰胺薄膜層析：聚酰胺對極性物質的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。選擇適當?shù)恼箤觿┦狗蛛x物在聚酰胺膜表面發(fā)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續(xù)過程，就能導致分離物質達成分離目的。用DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜層析鑒定肽N-末端2、疏水層析1、疏水層析：從分離純化生命物質的機制來看，它屬于吸附層析這一大類。是基于溶質、極性流動相和非極性固定相表面間的疏水效應建立起來的層析技術。疏水層析比較適合分離純化鹽析后或高鹽洗脫下來的物質。這不僅使有效成分的純度得到提高，并且還保持了其本來的結構和生物活性。2、原理：運用蛋白質疏水性的差異進行分離。高鹽結合，低鹽洗脫親水性較強的物質，一般在高濃度鹽溶液中，會發(fā)生局部可逆性變性，并能被迫與疏水層析的固定相結合在一起，然后通過減少流動相的離子強度，即可將固定在固定相的物質，按其結合能力大小，依次進行解吸附。2-1、吸附劑：在疏水層析過程中，所使用的固定相一般都是由載體和配體（疏水性基團）兩部分構成，其配體對疏水性物質具有一定的吸附力，而載體有親水性和非親水性之分。親水性：載體：重要是交聯(lián)瓊脂糖(SepharoseC1-4B)配體：苯基或辛基化合物（耦合）特點：不耐高壓，一般僅合用于常壓層析系統(tǒng)非親水性：載體：硅膠,樹脂(苯乙烯,二乙烯聚合物)等配體：苯基,辛基,烷基(C4,C8,C18)等（共價結合）特點：能耐壓,機械性能好,不僅合用于常層析,并且還合用于高壓層析.3、操作環(huán)節(jié)：層析柱的制備（將吸附劑（如苯基-SepharpseCL-4B）懸浮于乙醇溶液中,浸泡一段時間,采用離心(或過濾)方法,棄上清液,收集沉淀物,并以50%濃度懸浮于樣品緩沖液中.裝柱,洗滌,平衡）——加樣與洗脫（樣品中加入鹽類使變性利于吸附。樣品漸漸加入固定相后，先用平衡緩沖液洗滌，再減少鹽濃度洗脫）——再生（用8mol/L脲素溶液或含8mol/L脲素的緩沖液洗滌層析柱（以除去固定相吸附的雜質），接著用平衡緩沖液平衡。）4、優(yōu)點：操作簡樸，蛋白質回收率高，蛋白質變性也許小，選擇性強柱子：交聯(lián)瓊脂糖再生：尿素3、離子互換層析1、離子互換層析：是以離子互換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與互換劑上的平衡離子進行可逆互換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法2、原理：依據(jù)各種離子或離子化合物與離子互換劑的結合力不同而進行分離純化的。2-1、離子互換劑：是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物載體通過一定的化學反映共價結合上某種電荷基團形成的。分三部分：高分子聚合物載體，電荷基團，平衡離子（以羧甲基纖維素為例）平衡離子帶負電的離子互換劑與帶負電的離子基團發(fā)生互換作用，稱為陰離子互換劑(anion-exchangeresin)。陰離子互換反映：(R（高分子聚合物載體）-X+（電荷基團）)Y-（平衡離子）+A-(R-X+)A-+Y-2-2、選擇系數(shù)若值＞1，即[RB]＞[RA]，這表達離子互換劑對B+的結合力要比對A+的大；若值=1，即[RB]=[RA]，這表達其對B+和A+的結合力相同；若值＜1，即[RB]＜[RA]，表達其對B+的結合力要比對A+的小。2-3、一般來講，離子價數(shù)越高，結合力越大；價數(shù)相同時，原子序數(shù)越高，結合力越大?；Q劑對離子的結合力順序為：Na+<Ca2+<Al3+<Ti4+；Li+<Na+<K+<Rb+<Cs+；Mg2+<Ca2+<Sr2+<Ba2+；F-<Cl-<Br-<I-。等電點pI>pH的蛋白帶正電，能與陽離子互換劑結合，一般pI越大的蛋白與離子互換劑結合力越強。3、離子互換劑的選擇3-1、載體疏水性離子互換劑：聚苯乙烯離子互換劑（又稱為聚苯乙烯樹脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔網狀結構的聚苯乙烯為載體。聚苯乙烯離子互換劑互換容量高、機械強度大、流速快。重要用于分離無機離子、有機酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物質，另一方面可用于從蛋白質溶液中除去表面活性劑（如十二烷基硫酸鈉、tritonX-100）、尿素和兩性電解質。此外，還可用于分離某些不易變性的蛋白質。親水性離子互換劑：載體為天然或人工合成的與水有較強的親和力的物質如纖維素（Cellulose）、球狀纖維素（Sephacel）、葡聚糖（Sephadex）、瓊脂糖（Sepharose）等.3-2、電荷基團看被分離的物質在其穩(wěn)定的pH下所帶的電荷，假如帶正電，例如polymyxin、cytochromeC這些堿性蛋白質，他們在酸性溶液中較穩(wěn)定，親和力強，則選擇陽離子互換劑；如帶負電，像heparin、nucleicacid這類酸性物質，在堿性溶液中較穩(wěn)定，則選擇陰離子互換劑；兩性離子，以胰島素（insulin）為例，它的等電點為pH5.3，因此在pH<5.3（酸性）溶液中，采用陽離子互換劑，在pH>5.3的堿性溶液中，使用陰離子互換劑。3-3、常用離子互換劑介紹:3-3-1、纖維素纖維素離子互換劑是以微晶纖維素為載體，通過化學方法引入電荷基團構成的。纖維素目前種類很多，其中以DEAE-纖維素（二乙基氨基纖維素）和CM-纖維素（羧甲基纖維素）最常用，它們在生物大分子物質（蛋白質，酶，核酸等）的分離方面顯示很大的優(yōu)越性。一是它具有開放性長鏈和松散的網狀結構，有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際互換容量要比離子互換樹脂大的多；二是它具有親水性，對蛋白質等生物大分子物質吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達成分離的目的，因此不致引起生物大分子物質的變性和失活。三是它的回收率高。所以離子互換纖維素已成為非常重要的一類離子互換劑。3-3-2、葡聚糖（Sephadex）交聯(lián)葡聚糖離子互換劑是以交聯(lián)葡聚糖G-25和G-50為載體，通過化學方法引入電荷基團制成的。這類互換劑的外形呈珠狀，對蛋白質和核酸等大分子物質有較高的結合容量，并且流速比無定形纖維素離子互換劑快。3-3-3、瓊脂糖（Sepharose）瓊脂糖離子互換劑重要是以交聯(lián)瓊脂糖CL-6B(SepharoseCL-6B)等為載體，通過化學方法引入電荷基團制成的。這類離子互換劑的外形呈珠狀，網孔大，特別適合分離大分子量的蛋白質和核酸等物質，即使在流速快的操作下，也不影響分辨率。3-4常用術語3-4-1．交聯(lián)度：每種交聯(lián)劑在基質中占的百分數(shù)離子互換劑中的載體都是通過交聯(lián)劑交聯(lián)而制成的固體物質。這種基質比較穩(wěn)定，不溶于水和其它普通溶劑，機械性能好。3-4-2．吸水量或膨脹度如葡聚糖凝膠Sephadex:G25，G后面的阿拉伯數(shù)字代表凝膠吸水量（毫升水/克干膠）乘以10。1.交聯(lián)度大，孔徑小，吸水量少，膨脹度也小,反之亦然。2.電荷基團越強，膨脹度越大3.交聯(lián)度小的離子互換劑處在低離子強度時，其膨脹度比處在高離子強度時大。弱陽離子互換劑的膨脹度是隨著pH值的提高而增大，而弱陰離子互換劑的膨脹度卻是隨著pH值的減少而增大的交聯(lián)度大的離子互換劑的膨脹度幾乎與離子強度的變化無關。3-4-3．互換容量：離子互換劑能提供互換離子的量，它反映離子互換劑與溶液中離子進行互換的能力。樣品組分與離子互換劑作用的表面積越大當然互換容量越高。離子互換劑的總互換容量通常以每毫克或每毫升互換劑具有可解離基團的毫克當量數(shù)（meq/mg或meq/ml）來表達。3-5平衡離子與離子互換劑結合力不會過強，否則組分離子難以與互換劑結合而使互換容量減少。不對樣品組分有明顯影響。一般來講強酸型離子互換劑對H+離子的結合力比Na+離子小，弱酸型離子互換劑對H+離子的結合力比Na+離子大。一般來講強堿型離子互換劑對OHˉ離子的結合力比Clˉ離子小，弱堿型離子互換劑對OHˉ離子的結合力比Clˉ離子大。4、基本操作：層析柱及離子互換劑的解決（前解決：膨化后用水懸浮去除雜質和細小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑解決后要用水洗至中性，再用另一種試劑解決，最后再用水洗至中性；裝柱：直徑和柱長比一般為1:10到1:50之間）——平衡緩沖液（一方面要保證各個待分離物質如蛋白質的穩(wěn)定，另一方面是要使各個待分離物質與離子互換劑有適當?shù)慕Y合，并盡量使待分離樣品和雜質與離子互換劑的結合有較大的差別。）——上樣（一般為柱床體積的1－5％為宜）——洗脫緩沖液（1.要保證在整個洗脫液梯度范圍內，所有待分離組分都是穩(wěn)定的。2.要使結合在離子互換劑上的所有待分離組分在洗脫液梯度范圍內都可以被洗脫下來。3.洗脫液體積應足夠大，使分離的各峰不致于太擁擠。4.此外可以使梯度范圍盡量小一些，以提高分辨率。）——洗脫速度（一般來說洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會導致分離時間長、樣品擴散、譜峰變寬、分辨率減少等副作用）——樣品的濃縮、脫鹽——離子互換劑的再生（酸（HCl）堿(NaOH)交替浸泡，或高濃度的鹽溶液（NaCl）清洗，20％乙醇或含0.02％疊氮鈉的緩沖液中可以長期保存）梯度洗脫：1.改變離子強度在洗脫過程中逐步增大離子強度，從而使與離子互換劑結合的各個組分被洗脫下來。2.改變PH陽離子互換劑一般是pH從低到高洗脫，陰離子互換劑一般是pH從高到低。5、應用1.水解決2.分離純化小分子物質3.分離純化生物大分子物質4.測定蛋白質的等電點4、凝膠過濾1、凝膠過濾：運用某些化學惰性的多孔網狀結構物質(多孔性凝膠填料)為介質,使預分離的混合物質按照分子量大小分別先后流出層析柱，而得以分離、純化的方法。凝膠：指具有大量液體（一般是水）的柔軟而富有彈性的物質，它是一種通過交聯(lián)而具有立體網狀結構的多聚體。分組分離是指將樣品混合物按分子量大小提成兩組，一組分子量較大，另一組分子量較小。例如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質，以及一些注射劑去除大分子熱源物質等等。分級分離則是指將一組分子量比較接近的組分分開。2、原理：凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內部具有立體網狀結構，形成很多孔穴。比孔穴孔徑大的分子不能擴散到孔穴內部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動相向下流動，它們經歷的流程短，流動速度快，所以一方面流出；而較小的分子則可以完全滲透進入凝膠顆粒內部，由此反復進出凝膠顆粒中，經歷的流程長，使移動速度減慢，所以最后流出；而分子大小介于兩者之間的分子在流動中部分滲透，滲透的限度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時間介于兩者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品通過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達成了分離目的。3、優(yōu)缺陷凝膠過濾層析是層析分離中最簡樸，最單純的一種類型。具有條件溫和、方法簡樸、易操作、分離范圍廣、反復性好、回收率高的優(yōu)點，常用作蛋白的精細純化，能達成比較滿意的分離效果。局限性之處：是需要較濃的樣品上樣濃度，收獲的是被稀釋了的蛋白液，純化效果好，但生產流程長，因而不適合生產規(guī)模的大樣品制備。4、常用術語（詳見色譜法）4-1.分派系數(shù)與各種體積對于某一型號的凝膠，在一定的分子量范圍內，各個組分的Kav與其分子量的對數(shù)成線性關系：Kav＝－blgMW＋c（其中b、c為常數(shù)，MW表達物質的分子量。）Ve和Kav也成線性關系：Ve＝－b’lgMW＋c’（其中b’、c’為常數(shù)。）4-2．排阻極限：指不能進入凝膠顆?？籽▋炔康淖钚》肿拥姆肿恿?。代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。所有大于排阻極限的分子都不能進入凝膠顆粒內部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時被最先洗脫出來。例如SephadexG-50的排阻極限為30,000，它表達分子量大于30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。4-3.分級分離范圍：表達一種凝膠合用的分離范圍，對于分子量在這個范圍內的分子，用這種凝膠可以得到較好的線性分離。例如SephadexG-75對球形蛋白的分級分離范圍為3,000－70,000，它表達分子量在這個范圍內的球形蛋白可以通過SephadexG-75得到較好的分離。對于同一型號的凝膠，球形蛋白與線形蛋白的分級分離范圍是不同的。4-4.吸水率和床體積吸水率是指1g干的凝膠吸取水的體積或者重量，但它不涉及顆粒間吸附的水份。所以它不能表達凝膠裝柱后的體積。（該值低于７.５g/g的為硬膠；高于７.５g/g的稱為軟凝膠.）床體積是指1g干的凝膠吸水后的最終體積。5、凝膠的種類和性質5-1、凝膠基質應具有的條件：（1）親水性大，表面基質惰性，即基質與溶質之間不發(fā)生任何化學或物理互相作用（2）化學穩(wěn)定性高，在較寬的pH值和離子強度范圍以及化學試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長（3）基質內含的帶電離子基團少，以減少非特異吸附性，提高蛋白質收率（4）一定的孔徑分布范圍（5）良好的機械強度，允許較高的操作壓力（流速）5-2、固定相：（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠（Sephadex:G25,G50,G75,G100）、瓊脂糖凝膠（Sepharose：2B,4B,6B）、聚丙烯酰胺（Bio-gel:P-6，P-30，P-60，P-100）都具有較小的交聯(lián)結構，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶漲到它干體的許多倍。它們合用于水溶性作流動相，不適宜在高效液相色譜中。（2）半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯。常以有機溶劑作流動相。（3）剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等，它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。5-2-1葡聚糖凝膠一般以G型葡聚糖凝膠(經水溶液膨脹)作為固定相，以水溶液作為流動相，對水溶性物質進行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠過濾層析。而以LH型葡聚糖凝膠(經乙醇或二甲亞砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有機溶劑膨脹）作為固定相，以有機溶劑為流動相，對脂溶性物質進行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠滲透層析。Sephadex:G25，G后面的阿拉伯數(shù)字代表凝膠吸水量（毫升水/克干膠）乘以10。具有大量羥基，親水性很好，性質穩(wěn)定。由于具有羥基基團，故呈弱酸性，這使得它有也許與分離物中的一些帶電基團（特別是堿性蛋白）發(fā)生吸附作用。但一般在離子強度大于0.05M的條件下，幾乎沒有吸附作用。所以在用Sephadex進行凝膠層析實驗時常使用一定濃度的鹽溶液作為洗脫液，這樣就可以避免Sephadex與蛋白發(fā)生吸附。同時新得凝膠可用易得到的蛋白質進行預層析。此外,葡聚糖凝膠對芳香族化合物或雜環(huán)化合物以及某些凝集素具有較強的吸附作用,采用凝膠過濾層析分離它們時,往往運用的是吸附性能,而不是排阻原理.5-2-2瓊脂糖凝膠瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的天然線性多糖，它是瓊脂去掉其中帶電荷的瓊脂膠得到的。是由D－半乳糖（D-galactose）和3,6－脫水半乳糖（anhydrogalactose）交替構成的多糖鏈。它在100C時呈液態(tài)，當溫度降至45C以下時，多糖鏈以氫鍵方式互相連接形成雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經凝聚即成為束狀的瓊脂糖凝膠。Sepharose6B：B是指的顆粒中瓊脂糖含量近似值（%），分離球狀蛋白和病毒的分子量極限：104～4×106；4B是：104～2×107；2B是：104～4×107瓊脂糖凝膠在pH為4－9之間是穩(wěn)定的，它在室溫下很穩(wěn)定，穩(wěn)定性要超過一般的葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠不耐高溫，使用溫度以0－30C為宜。瓊脂凝膠Sepharose具有親水性,大孔性,非特異吸附力和大量活潑的羥基等優(yōu)點。瓊脂糖凝膠對樣品的吸附作用很小。此外瓊脂糖凝膠的機械強度和孔穴的穩(wěn)定性都很好，一般好于前兩種凝膠，在高鹽濃度下，柱床體積一般不會發(fā)生明顯變化，使用瓊脂糖凝膠時洗脫速度可以比較快。瓊脂糖凝膠的排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質，但分辨率較低。5-2-3聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺（acrylamide）與甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。以過硫酸銨作為催化劑,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。改變丙烯酰胺的濃度，就可以得到不同交聯(lián)度的產物。Bio-GelP-2，后面的數(shù)字2基本代表它們的排阻極限的10-3。數(shù)字越大，可分離的分子量也就越大。①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N,N+甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子,沒有或很少帶有離子的側基,電滲作用較小,不易和樣品互相作用.②是一種人工合成的物質,在聚合前可調節(jié)單體濃度比,形成不同限度交鏈結構,其空隙度可在一個較廣泛圍內變化,可根據(jù)欲分離物質分子的大小,選擇合適的凝膠成分,使之既有適宜的空隙度,又有較好的機械性質。一般來說,含丙烯酰胺7－7.5%的凝膠,機械性能合用于分離分子量范圍1萬至100萬物質,1萬以下的蛋白質則采用含丙烯酰胺15－30%的凝膠,而分子量特別大的可采用含丙烯酰胺4%的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠在水溶液、一般的有機溶液、鹽溶液中都比較穩(wěn)定。聚丙烯酰胺凝膠在酸中的穩(wěn)定性較好，在pH為1－10之間比較穩(wěn)定。但在較強的堿性條件下或較高的溫度下，聚丙烯酰胺凝膠易發(fā)生分解。在有SDS、鹽酸胍、尿素、20％乙醇溶液中可安全使用。5-2-4、多孔硅膠和多孔玻璃珠

將硅膠或玻璃制成具有一定直徑的網孔狀結構的球形顆粒。這類凝膠屬于硬質無機凝膠，它們的最大的特點是機械強度很高、化學穩(wěn)定性好，使用方便并且壽命長.多孔硅膠和多孔玻璃珠的分離范圍都比較寬，多孔硅膠一般為102－5×106，多孔玻璃珠一般為3×103－9×106。它們的最大缺陷是吸附效應較強（特別是多孔硅膠），也許會吸附比較多的蛋白，但可以通過表面解決和選擇洗脫液來減少吸附。此外它們也不能用于強堿性溶液，一般使用時pH應小于8.5。5-3、選擇分組分離：要選擇大分子能被凝膠排除(Kav=0)而小分子能滲入(Kav≈1)的凝膠，分離效果最佳。一般常用排阻極限較小的凝膠類型。如SephadexG-25.1.將一蛋白質混合物脫鹽,凝膠的選擇應考慮能排除混合物中所有的蛋白質.由于大多數(shù)蛋白質的分子質量均超過5×103Da,所以選擇SephadexG-25或Bio-GelP-6都是適當?shù)?2.假如已知所需的蛋白質的分子質量較高,則可選擇排阻限度比較高的凝膠,如選擇SephadexG-50或Bio-GelP-30則可得到更有效的分離.3.如所需的物質的分子質量較小,則可選擇交聯(lián)度高的凝膠如SephadexG-10或Bio-GelP-2來脫鹽.用組別分離也可除去大分子樣品中混雜的小分子雜質及不需要的離子等.分級分離：根據(jù)樣品組分的具體情況來選擇凝膠的類型，分段分離對象Kav之間的差異通常在0.1－0.2范圍，凝膠的分離范圍應涉及所要的各個組分的分子量，假如分離范圍選擇過小，則某些組分不能得到分離；但分離范圍選擇過大，則分辨率較低，分離效果也不好。顆粒大?。侯w粒小，分辨率高，但相對流速慢，實驗時間長，有時會導致擴散現(xiàn)象嚴重；顆粒大，流速快，分辨率較低，但條件得當也可以得到滿意的結果。6、基本環(huán)節(jié)：凝膠的選擇和解決（膨化：干膠用量（g）＝柱床體積（ml）/凝膠的膨脹度（ml/g）。由于凝膠解決過程以及實驗過程也許有一定損失，所以一般凝膠用量在計算的基礎上再增長10％－20％。吸水率越小，膨化時間越短，加熱煮沸可縮短時間。之后要純化和排出氣泡）——層析柱的選擇（根據(jù)樣品量多少與對分辨率的規(guī)定。一般柱長度不超過100cm，層析柱的直徑和長度比一般在1:25－1:100之間。脫鹽來說,柱長與直徑的比例應為5:1-15:1的范圍;而分級分離則應為20:1－100:1的范圍.）——加樣量（一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的1％－5％左右；而分組分離時加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10％－25％。加樣前既不能在膠面上存留洗脫劑,也不要使洗脫劑流干.加樣前一定要使膠床上表面平坦均勻）——洗脫液的選擇（能溶解被洗脫物質并不使其變性的緩沖液、具有一定濃度鹽）——洗脫速度——凝膠的再生和保存（再生：一，先用水反復進行逆向沖洗，再用緩沖液進行平衡。平衡畢，即可反復使用。二，把凝膠倒出，用低濃度的酸或堿按其預解決方法進行，解決后重新裝柱即可再行使用。保存：反復洗滌去除蛋白等雜質，然后加入適當?shù)目咕鷦?，通常加?.02％的疊氮化鈉，4°C下液態(tài)保存。）問題與方法：流速減慢分辨率低樣品回收率低7、應用：（1）生物大分子的純化（2）分子量的測定（3）脫鹽及去除小分子雜質（4）去熱源物質（5）溶液的濃縮8、優(yōu)點：（1）溶質與介質不發(fā)生任何形式的互相作用，因此可采用恒定洗脫法洗脫，操作條件溫和，產品收率可接近100％（2）每批分離操作結束后不需進行苛刻介質清洗或再生，容易事先循環(huán)操作，提高產品純度（3）分離機理簡樸，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大9、缺陷：（1）僅根據(jù)溶質之間的相對分子質量差別進行分離，選擇性低，料液解決量小，一般為柱體積的5％（2）經洗脫后產品被稀釋，因此需要在具有濃縮作用的單元操作（超濾、離子互換和親和色譜等）后使用5、親和層析1、親和層析：運用生物大分子和固定相表面存在某種特異性吸附而進行選擇性分離的一種生物大分子分離的層析方法為親和層析（affinitychromotography）。親和層析是分離純化蛋白質、酶等生物大分子最為特異而有效的層析技術，分離過程簡樸、快速，具有很高的分辨率，在生物分離中有廣泛的應用。同時它也可以用于某些生物大分子結構和功能的研究。2、原理把具有辨認能力的配體L以共價鍵的方式固化到具有活化基團的載體M上，制成親和吸附劑M-L，L與欲分離的大分子物質S之間能可逆地結合與解離。把親和吸附劑裝入小層析柱（幾毫升到幾十毫升床體積）后，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可借助靜電引力、范德華力，以及結構互補效應等作用吸附到固定相上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來，并形成了第一個層析峰；3、操作過程層析柱的制備（選材詳見下方，大小依據(jù)吸附劑的容量和需要純化的蛋白質的量。樣品量可達1/2柱體積，若靶蛋白是較低的結合常數(shù)﹥10-4/M可用較長的柱，結合較牢、結合常數(shù)＜10-13/M則選用短柱。）——上樣（目的蛋白質對配體的特異性結合需要合適的pH、緩沖液鹽濃度、離子強度。）——洗脫（用平衡洗脫液洗去未吸附在親和吸附劑上的雜質。1.特異性洗脫：一種是選擇與配體有親和力的物質進行洗脫，另一種是選擇與待分離物質有親和力的物質進行洗脫。特異性強，可以進一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率。2.非特異性洗脫：通過改變洗脫緩沖液pH、離子強度、溫度等條件，減少待分離物質與配體的親和力而將待分離物質洗脫下來。）——親和吸附劑的再生和保存（再生使用大量的洗脫液或較高濃度的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡即可再次使用。保存一般是加入0.01%的疊氮化鈉，4C下保存。也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。）4、特點：（1）選擇特異性強，純化效率高。（2）操作簡樸,環(huán)節(jié)少。不影響樣品的生物活性,適合生物大分子的操作。（3）柱子填充載體昂貴,要分離一種物質必須找到適宜的配體,所以不適合所有生物大分子樣品。5、選擇并制備合適的親和吸附劑：（1）載體的選擇１.極低的非特異吸附性,不影響配體與待分離物的結合２.高度親水性，易與水溶液中的生命大分子物質接近３.物理化學性質穩(wěn)定；（偶聯(lián)與層析過程中）抗微生物和酶的侵蝕；抗PH、離子強度、溫度、變性劑等的變化４.結構是松散的多孔網絡，利于大分子的流動與滲透，并充足與配體結合５.大量的化學基團能被有效的活化，且容易和配體結合（纖維素具有不可忽視的吸附性；交聯(lián)葡聚糖與配體結合后，多孔性大大減少；交聯(lián)瓊脂糖交聯(lián)后減少了羥基的數(shù)目，導致配體的結合數(shù)目減少（Sepharose4B）；聚丙烯酰胺凝膠與配體結合后，多孔性大大減少，且由于其含大量酰胺基，不宜在載體和配體之間引入間隔物（Bio-300）；多空玻璃珠多孔性好，機械性能強；但對某些物質具有一定的吸附能力√）（2）配體的選擇將一對能可逆結合和解離生物分子的一方與水不溶性載體相偶聯(lián)制成親和吸附劑，這樣一對生物分子中，被偶聯(lián)的一方就叫作配體。與待分離的生物大分子有適當?shù)挠H和力親和力太弱，待分離物質不易與配體結合，導致親和層析吸附效率很低。并且吸附洗脫過程中易受非特異性吸附的影響，引起分辨率下降。但假如親和力太強，待分離物質很難與配體分離，這又會導致洗脫的困難。2.具有與基質共價結合的基團（與待分離的物質之間的親和力要有較強的特異性）配體與樣品中其它組分沒有明顯的親和力，對其它組分沒有非特異性吸附作用。這是保證親和層析具有高分辨率的重要因素。3．可以與載體穩(wěn)定的共價結合在實驗過程中不易脫落，并且配體與基質偶聯(lián)后，對其結構沒有明顯改變，特別是偶聯(lián)過程不涉及配體中與待分離物質有親和力的部分，對兩者的結合沒有明顯影響。4.配體自身應具有較好的穩(wěn)定性在實驗過程中不易脫落，并且配體與基質偶聯(lián)后，對其結構沒有明顯改變，特別是偶聯(lián)過程不涉及配體中與待分離物質有親和力的部分，對兩者的結合沒有明顯影響。常用的配體克制劑、效應物、酶的輔助因子、類似底物、抗體【涉及半抗原（堿基、核苷、核苷酸、寡核苷酸）－蛋白質復合物抗體】和其它物質（如外源凝集素、polyA、polyU、染料和金屬離子）等。（3）載體的活化載體的活化是指通過對載體進行一定的解決，使載體表面上的一些基團轉變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結合的活性基團。1.瓊脂糖：通常具有大量的羥基，通過一定的解決可以引入各種適宜的活性基團。一般用BrCN活化載體,它可以和伯氨基（NH2）反映，重要生成異脲衍生物，衍生出載體的親電功能基團（亞胺碳酸活性基團），具有伯氨基的配體，如氨基酸、蛋白質都可以結合在基質上。優(yōu)點：在溫和條件下可以活化，可使結合配體量更大。缺陷：1.結合不穩(wěn)定；2.有劇毒，易揮發(fā)．環(huán)氧乙烷基活化活化，活化后的載體都具有環(huán)氧乙基，可以結合具有伯氨基（NH2）、羥基（OH）和硫醇基（SH）等基團的配體。優(yōu)點是1.活化后不引入電荷基團；2.載體與配體形成的N－C、O－C和S－C鍵都很穩(wěn)定，所以配體與載體結合緊密，親和吸附劑使用壽命長，并且便于在親和層析中使用較強烈的洗脫手段；3.此外這種解決方法沒有溴化氰的毒性。缺陷是用環(huán)氧乙基活化的載體在與配體偶聯(lián)時需要堿性條件，pH為9~13，溫度為20~40C。這樣的條件對于一些比較敏感的配體也許不合用。羰基二咪唑（CDI）活化劑優(yōu)點是1.相對安全；2.其活化與偶聯(lián)效率較高、操作簡便,偶聯(lián)反映容易控制；3.活化后的樹脂非特異性吸附低。（4）配體與載體的偶聯(lián)用物理與化學的方法把配體偶聯(lián)到載體上?；瘜W偶聯(lián)法是通過配體的親核基團（-NH2,-SH，－OH）對活化的載體材料進行親核襲擊實現(xiàn)的。配體和載體偶聯(lián)完畢后，必須要反復洗滌，以去除未偶聯(lián)的配體；并且用適當?shù)姆椒ǚ忾]載體中未偶聯(lián)上配體的活性基團，也就是使載體失活，以免影響后面的親和層析分離。（5）提高吸附劑的操作容量1.在配體和載體之間引入“間隔臂”配體結合在載體上，它在與待分離的生物大分子結合時，很大限度上要受到基質和待分離的生物大分子間的空間位阻效應的影響。加入一段有機分子，使基質上的配體離開載體的骨架向外擴展伸長，這樣就可以減少空間位阻效應，大大增長配體對待分離的生物大分子的吸附效率。加入手臂的長度要恰當，太短則效果不明顯；太長則容易導致彎曲，反而減少吸附效率。常用的方法是將適當長度的氨基化合物NH2(CH2)nR共價結合到活化的載體上，R通常是氨基或羧基，n一般為2－12。增長配體量或者活性基團（配體結合量）配體與載體以最少的鍵連接在以蛋白質和多肽為配體時，以最少的共價鍵連接到載體上，有助于保持蛋白質的高級結構狀態(tài)，有助于保持起生物學功能。偶聯(lián)反映在較不利的pH條件下（如pH7.0左右）進行，就能減少蛋白質分子與基質連接的鍵。4.基質的影響載體的孔徑過小會增長基質的排阻效應，使被分離物與配體結合的機率下降，減少親和層析的吸附容量。一般多選擇較大孔徑的載體，以使待分離物有充足的空間與配體結合。6、聚焦層析1、聚焦層析:在等電點聚焦方法的基礎上發(fā)展起來的。它是根據(jù)蛋白質等電點的差異，結合離子互換技術的大容量色譜，能分離幾百毫克蛋白質樣品。這一方法既有聚焦作用的性能，又有濃縮樣品和分辨率高等優(yōu)點固定相：多緩沖互換劑：也是一種離子互換劑。帶有多種電荷基團的配體載體偶聯(lián)而制成的。（以Sepharose6B為載體，通過化學方法把帶有多種電荷基團的配體與其偶聯(lián)而制成的） 流動相：多緩沖劑（是一系列等電點既相異又相近的具有多胺基，多羧基的脂肪鏈化合物構成的，彼此間分子量雖不同，但均在300-1000Da范圍內）2、原理：當洗脫液多緩沖劑流進多緩沖互換劑時，由于互換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故pH梯度溶液可以自動形成。蛋白質按其等電點在pH梯度環(huán)境中進行排列的過程叫做聚焦效應當洗脫液多緩沖劑流進多緩沖互換劑時，由于互換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故pH梯度溶液可以自動形成。先洗出pH值高的，后洗出pH值低的.3、操作過程：（1）測定樣品的等電點（2）選擇適當?shù)亩嗑彌_劑和多緩沖互換劑（使用1～3個pH梯度單位的系統(tǒng)，該系統(tǒng)要涉及被分離樣品的pI在內，并有1/2～2/3柱長的吸附﹑解吸附的差異性。）（3）用起始緩沖液平衡的互換劑裝入柱中（其pH值比pH梯度上限高約0.4個pH單位，以克服因起始緩沖液與洗脫液之間PH差值引起的PH波動），用量為床體積的10～15倍）（4）讓5~10ml多緩沖劑流過柱體（聚焦層析的分辨率受裝柱的質量和床面平坦限度制約。）（5）加樣（上樣量取決于每個區(qū)帶中蛋白質的量，通常每10ml床體積加100mg左右的樣品。一般上樣體積不超過床體積的1/2）（6）用多緩沖劑洗脫（7）洗脫液被分離、分析（8）層析柱再生，用起始緩沖液重新平衡4、特點：高分辨、高度濃縮和高度專一等特點7、高效液相色譜1、高效液相層析：幾乎包含了所有普通液相層析的方法。依據(jù)不同分子的大小、形狀、所帶電荷、親水性、與某種分子特定的親和性、選擇適當?shù)墓潭ㄏ鄬Υ蠓肿舆M行分離。該層析的共同特性是在高壓強下，使待分離液體快速通過細粒度載體,使大分子物質獲得分離。優(yōu)點：高效、快速、選擇性好、反復性好、應用范圍廣2、高效液相色譜儀：（1）高壓輸液系統(tǒng)(流動相)溶劑貯存器：由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2L，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔徑約2m，可防止顆粒物進行泵內。泵：輸出壓力高、可調范圍寬、流量恒定、無脈動，流量精度和反復性為0.5%左右。此外，還應耐腐蝕，密封性好。按其性質可分為恒壓泵和恒流泵梯度洗脫裝置：一類是外梯度裝置（又稱低壓梯度），流動相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統(tǒng)，僅需一臺泵即可；另一類是內梯度裝置（又稱高壓梯度），將兩種溶劑分別用泵增壓后，按電器部件設立的程序，注入梯度混合室混合，再輸至柱系統(tǒng)。（2）進樣系統(tǒng)(加樣)1）微量注射器進樣。裝置簡樸、死體積小。但進樣量小且重現(xiàn)性差。2）高壓進樣閥：六通閥。由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣準確，反復性好。六通閥：泵出的層析液將進樣閥與層析柱相連，空間充滿。使用加樣器將樣品注入樣品回路。轉動進樣閥使樣品回路與泵連通，加樣孔因此與內部斷開聯(lián)系。層析開始。（3）分離系統(tǒng)(層析柱、固定相和流動相選擇等)柱形多為直形，長度一般為5-70cm，直徑為1-50mm。色譜柱基質都是由機械強度高的樹脂（硬性固體）和硅膠或是厚壁玻璃（剛性固體，二氧化硅和氧化硅）構成，它們都是通過解決的惰性材料，具有多孔性及比表面積大的。內部充滿微粒固定相，基質顆粒直徑在5-10um(分析型）和數(shù)微米范圍內。粒度小，柱床極易達成均勻，致密狀態(tài)，可以減少渦流擴散效應，并且微孔淺，樣品在微孔區(qū)內傳質短。流動相溶劑1、溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。2、溶劑與檢測器匹配。3、高純度：不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產生“偽峰”。4、化學穩(wěn)定性好5、適宜的粘度：粘度過高，柱壓增長，不利于分離；過低，易產氣憤泡。（4）檢測系統(tǒng)(將濃度換算為電信號)1、溶質性檢測器，僅對被分離組分的物理或化學特性有響應：紫外、熒光、電化學檢測器等；2、總體檢測器，對試樣和洗脫液總的物理性響應：示差折光檢測器等。（5）記錄系統(tǒng)(繪制洗脫曲線、收集或根據(jù)參數(shù)進行檢測)。3、高效液相色譜（HPLC）與經典液相色譜的比較：高速：HPLC采用高壓輸液設備，流速大增長，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經典方法靠重力加料，完畢一次分析需時數(shù)小時。高效：填充物顆粒極細且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質阻力小，因而柱效很高。可以在數(shù)分鐘內完畢數(shù)百種物質的分離。高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測器——10-11g。8、氣相色譜1、氣相色譜：以氣體為流動相。待測物樣品被轉變?yōu)闅怏w后進入到色譜分離柱頂部,以惰性氣體（指不與待測物反映的氣體，只起運載氣化樣品的作用，也稱載氣）將待測物樣品（氣體）帶入柱內進行分離。2、原理：其分離原理是基于待測物在氣相和固定相之間的吸附-脫附（氣固色譜）和分派（氣液色譜）來實現(xiàn)的。因此可將氣相色譜分為氣固色譜和氣液色譜。3、氣相色譜特點：（1）分辨力強，能分析同分異構體。（2）效率高，能分析很復雜的混合物。（3）靈敏度好，能分析10-12~10-7個分子量的物質。（4）速度快（5）樣品用量少4、氣相色譜儀：（1）氣路系統(tǒng)：壓力計、流量計、氣體凈化裝置（2）進樣系統(tǒng)：進樣器、氣化室（3）柱分離系統(tǒng)：核心部分——色譜柱A.填充柱（固體吸附劑或涂有固定液的載體。）材料：不銹鋼或玻璃內徑：2~4mm；長：1~3m。形狀：重要有U型和螺旋型二種B.毛細管柱（可用固定液直接涂在毛細管內壁上。管中成空心，滲透性好，效率高，樣品在其中暢通無阻，移動快，出現(xiàn)的峰形銳利、分辨率強。）材料：玻璃或石英內徑：0.2~0.5mm；長度：30~300m通常彎成直徑10~30cm的螺旋狀）載體：1.比表面積大2.穩(wěn)定性好3.對樣品無吸附性4.對樣品無催化性5.具有一定的機械強度固定液：1.固定液一般為高沸點的有機物，在載體表面呈液膜狀態(tài),2.熱穩(wěn)定性好，在操作溫度下，不發(fā)生聚合、分解或交聯(lián)等現(xiàn)象，且有較低的蒸汽壓，以免固定液流失。3.化學穩(wěn)定性好，固定液與樣品或載氣不能發(fā)生不可逆的化學反映。4.固定液的粘度和凝固點低，以便在載體表面能均勻分布。5.各組分必須在固定液中有一定的溶解度，否則樣品會迅速通過柱子，難于使組分分離。6.對各組分具有良好的選擇性。制備：1.固定液的涂漬：一般固定液與載體比例是5/100到25/100。將載體倒入溶劑中使溶劑用量以能浸沒載體。3.老化：固定液涂漬后裝入色譜柱內通載氣加熱老化。老化的目的是除去殘留溶劑和揮發(fā)性物質，同時也有助于固定液均勻牢固地涂布在載體表面。4.色譜柱的填充：將載體裝入柱中，常用減壓法操作。（4）溫控系統(tǒng)（5）各類檢測器濃度型：組分濃度變化。熱導、電子捕獲檢測器質量型：組分量變化?；鹧骐x子化、火焰光度計5、分析（1）定性分析：以柱子末端出現(xiàn)色譜峰所需時間為依據(jù)擬定各色譜峰所代表的化合物1.運用純物質對照定性2.相對保存值法：α=tri/trS′=Vri/Vrs僅隨固定液及柱溫變化而變化，與其它操作條件無關。3.加入已知物增長峰高法4.保存指數(shù)定性法5.雙柱或多柱定性法：可克服在一根柱上，不同物質也許出現(xiàn)相同的保存時間的情況。6.與其它方法結合定性：如GC-MS，GC-IR，GC-MS-MS（2）定量分析：通過計算色譜峰的面積求出混合樣品中各組分的百分含量Ai=fi×mi式中mi為被測組分i的質量；Ai為被測組分i的峰面積；fi為被測組分i的校正因子。峰面積：（1）對稱形峰面積的測量——峰高乘以半峰寬法A=1.065×h×W1/2（2）不對稱形峰面積的測量——峰高乘平均峰寬法A=1/2×h（W0.15+W0.85）式中W0.15和W0.85分別為峰高0.15倍和0.85倍處的峰寬。校正因子：（相對）fi=fi/fs即某組分I的絕對校正因子fi為組分I與標準物質s的絕對校正因子之比。fi=（Ai/mi）/（As/ms）=（ms/mi）（Ai/As）可見，相對校正因子fi就是當組分I的質量與標準物質s相等時，組分I峰的面積是標準物質的峰面積的倍數(shù)。1.歸一化法2.內標法3.外標法4.校正曲線定量法6、色譜常用術語：（1）色譜流出曲線：由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖，所得曲線。（2）色譜峰：色譜流出曲線上的突起部分（3）死時間：不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)極大值所需的時間。它正比于色譜柱的空隙體積。流動相平均線速ū：ū=L/t0r（4）保存時間：試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點所通過的時間。（5）校正保存時間：某組分的保存時間扣除死時間tr′=tr-t0r（6）死體積：色譜柱在填充后，柱管內固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭的空間以及檢測器的空間的總和?？捎伤罆r間與色譜柱出口的載氣流速Fco（cm3·min-1）計算。V0r=t0rFco（氣相）（7）保存體積：從進樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積：Vr=trFco（8）校正保存體積：某組分的保存體積扣除死體積。Vr=Vr-V0r=tr’Fco（9）相對保存值：某組分2的校正保存值與組分1的校正保存值之比。r2,1=tr2‘/tr1′=Vr2‘/Vr1’（10）區(qū)域寬度：1.標準偏差：即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。2.半峰寬W1/2：即峰高一半處相應的峰寬。它與標準偏差的關系為：W1/2=2.3543.峰底寬度W：即色譜峰兩側拐點上的切線在基線上截距間的距離。它與標準偏差的關系是W=4（11）分離度(R)：相鄰兩組合色譜峰保存值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值。R=2(tr2-tr1)/（W1+W2）R值越大，表白相鄰兩組分分離越好。液相色譜與氣相色譜的比較：相同點：基本概念：比如分離度等基本理論：塔板理論與速率方程等不同點：應用范圍。氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質。液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或對熱敏感的物質、離子型化合物及高聚物的分離分析液相色譜能完畢難度較高的分離工作①氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，不參與分派平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相互相作用。而在液相色譜中流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增長了一個因素。還可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動相，增大分離的選擇性。②液相色譜固定相類型多，如離子互換色譜和排阻色譜等，分析時選擇余地大；而氣相色譜則不也許。③液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有助于色譜分離條件的選擇。比較表1.固定相2．流動相3.分離效果4、各種層析的比較測試題：已知物質A和B在一根30.00cm長的柱上的保存時間分別為16.40min和17.63min。不被保存組分通過該柱的時間為1.30min。峰底寬度分別為1.11min和1.21min，計算：（1）柱的分離度；（2）柱的平均塔板數(shù)；（3）達成1.5分離度所需的柱長度。解：（1）柱的分離度R=2（17.63-16.40）/（1.11+1.21）=1.06（2）柱的平均塔板數(shù)n=16(16.40/1.11)2=3493n=16(17.63/1.21)2=3397n平均=（3493+3397）/2=3445（3）達成1.5分離度所需的柱長度R1/R2=(n1/n2)1/2n2=3445(1.5/1.06)2=6898L=nH=6898(300/3445)=60cm四、電泳1、蛋白質鑒定的重要參數(shù)：(1)蛋白質的純度和質量鑒定(鑒定和分子量測定)(2)蛋白質帶電性鑒定（等電點）(3)蛋白質結構鑒定(一、二級結構、晶體結構等)(4)蛋白質生物學功能鑒定(生物活性、比活、酶活)(5)免疫學鑒定（抗原-抗體反映、酶聯(lián)免疫反映）1、電泳2、電泳技術：就是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質進行分離的一類實驗技術。帶電顆粒在電場中移動是物質的一種運動現(xiàn)象。移動的速度與顆粒帶電的強弱、分離介質的阻力、電極液的粘度和電場強度等因素有關。生物大分子在電場中移動的速度除上述因素外還與分子形狀、相對分子質量大小、分子的帶電性質及數(shù)目等因素有關。3、電泳分類電泳槽自由界面電泳槽：U形管下部放待分離的蛋白溶液，管臂聯(lián)接到電極上管狀電泳槽：圓盤電泳槽有上下兩個電泳槽和帶有鉑金電極的蓋板式電泳槽（最常見）：將凝膠灌裝在兩塊平行的玻璃板中間，因而稱板狀電泳(slabelectrophoresis)。涉及標準相對分子質量蛋白在內的多個樣品可在同一塊凝膠上在相同的條件下進行電泳；還可進行雙向電泳。分離原理(1)區(qū)帶電泳(zoneelectrophoresis，ZEP)：在半固相或膠狀介質上加一個點或一薄層樣品溶液，加電場，帶電顆粒在均一的緩沖液系統(tǒng)中分離成獨立的區(qū)帶，這是當前應用最廣泛的電泳技術。(2)移界電泳(movingboundaryelectrophoresis，MBEP)：是把電場加在生物大分子溶液和緩沖溶液之間的界面上，帶電顆粒的移動速度通過光學方法觀測界面的移動來測定。(3)穩(wěn)態(tài)電泳(steadystateelectrophoresis)：帶電顆粒在電場作用下電遷移一定期間后達成一個穩(wěn)定狀態(tài)，此后，電泳條帶的寬度不隨時間的變化而變化，如等速電泳(isotachophoresis，ITP)、等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)。3.支持介質(1)薄膜類：薄膜類涉及紙類，醋酸纖維素薄膜，聚酰胺薄膜等.(2)凝膠類：凝膠類涉及淀粉凝膠，瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠等。4、電泳原理：在電場中被分離物質的泳動速度除受自身性質如所帶電荷的性質和數(shù)量、分子自身的大小和形狀、分子的水化限度、解離趨勢等影響外，還與其它外界環(huán)境因素有關。1電場強度的影響：電場強度是指電場中每厘米的電位降，也稱電位梯度或電勢梯度。電場強度對電泳的速度起著重要作用，電場強度高，帶電顆粒泳動速度快，電場強度低，帶電顆粒泳動速度慢。2溶液pH值的影響：大部分生物大分子都具有陽離子和陰離子基團，這些基團的解離常數(shù)不同，溶液的pH值決定被分離物質帶電基團的解離限度，所以生物大分子的凈電荷取決于環(huán)境的pH值。3溶液離子強度的影響：溶液中的離子強度直接影響被分離物質的電動電勢()。帶電顆粒的遷移率與離子強度的平方根成反比。假如溶液的離子強度越大，電動電勢越小，泳動速度越慢；假如溶液的離子強度越小，電動電勢越大，泳動速度越快。高離子強度時電泳條帶較細窄。一般最適合的離子強度在0.02—0.2之間。4電滲的影響：固體支持物表面的電荷使支持物附近溶液分子形成偶電層，溶液在電場中向一定方向移動，即電滲現(xiàn)象，溶液移動的同時攜帶顆粒一起移動。5溫度的影響：在凝膠電泳過程中要產生焦耳熱，而熱對電泳的分離效果影響很大。溫度升高時，介質粘度下降，分子運動加劇，使自由擴散的速度變快，遷移率增長。6介質的影響：介質的交聯(lián)度直接影響分離效果，介質的純度影響聚膠效果，介質的非特異性吸附會增大電滲。2、蛋白質電泳1、蛋白質的兩性解離蛋白質與多肽同樣，可以發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時(IsoelectricpointpI)，蛋白質的溶解度最小，在電場中不移動。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質的電學性質不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質粒子帶負電荷，在電場中向正極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質粒子帶正電荷，在電場中向負極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質電泳(Electrophoresis)。2、聚丙烯酰胺電泳聚丙烯酰胺凝膠由單體的丙烯酰胺()（CH2=CHCONH2Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）（CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成.化學聚合常加入催化劑過硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED）1.單體和雙體在凝膠中的總濃度（T）a代表單體的重量（g）；b代表雙體的重量（g）；m代表溶液中的體積（ml）2.交聯(lián)度（c）雙體占總濃度的百分含量交聯(lián)度為5％時，a:b=19:13、優(yōu)點：(1)孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級，具有良好的分子篩效應。根據(jù)待分離大分子的相對分子質量，通過改變凝膠濃度及交聯(lián)度來調節(jié)凝膠的孔徑，使大分子得到較好的分離。(2)在一定濃度范圍內，凝膠透明，有彈性，機械性能好(3)凝膠是由—C—C—C—C—結合的酰胺類多聚物，側鏈上具有不活潑的酰胺基，沒有其它帶電基團，所以凝膠性能穩(wěn)定，電滲作用小，無吸附，化學惰性強。與生物大分子不發(fā)生化學反映，電泳過程中不受溫度、pH的變化的影響。(4)具有高分辨率和靈敏度，特別是在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體，樣品不易擴散。并有多種染色方法提高電泳條帶顯色的靈敏度，分離蛋白質的靈敏度可達10-6g。(5)單體純度高，在相同的實驗條件下，電泳結果具有很好的反復性。(6)凝膠雜質少，在很多溶劑中不溶，可合用于少量樣品的制備，不致污染樣品。4、不連續(xù)系統(tǒng)Ornstein-Davis高pH堿性不連續(xù)系統(tǒng)，濃縮膠丙烯酰胺濃度為4％，pH=6.7；分離膠的丙烯酰胺濃度為12.5％，pH=8.9；電極緩沖液的pH=8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配膠的緩沖液用Tris、SDS和HCl配制。（1）