鄰苯二甲酸二丁酯污染對大豆幼苗生理生化指標的影響畢業(yè)論文

學號：XXXXXXXXXX畢業(yè)論文鄰苯二甲酸二丁酯污染對大豆

幼苗生理生化指標的影響Dibutylphthalatepollutiononthephysiologicalandbiochemicalindexesofsoybeanseedlings學生XXX指導教師（職稱）XXX（教授）完成時間2012年03月19日至2012年06月08日

鄰苯二甲酸二丁酯污染對大豆幼苗生理生化指標的影響摘要本實驗研究了鄰苯二甲酸二丁酯污染對大豆幼苗生理生化指標的影響，測定了大豆幼苗的葉綠素含量、丙二醛（MDA）的含量、脯氨酸（Pro）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）等指標來反映污染對大豆幼苗生長的影響。結(jié)果表明:隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的增加，大豆種子的發(fā)芽勢及發(fā)芽率呈現(xiàn)下降趨勢；且幼苗的葉綠素含量、以及可溶性糖含量均呈現(xiàn)下降趨勢，而丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量和超氧化歧化酶（SOD）含量普遍升高。且鄰苯二甲酸二丁酯在2.50mg/L時對發(fā)芽率、葉綠素含量、可溶性糖含量的抑制程度最大，說明此時鄰苯二甲酸二丁酯對大豆的生長有較大的抑制作用。關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸二丁酯；污染；大豆幼苗；生理生化指標

DibutylphthalatepollutiononthephysiologicalandbiochemicalindexesofsoybeanseedlingsABSTRACTThisstudyinvestigatedtheinfluenceofdibutylphthalatepollutiononthephysiologicalandbiochemicalindexesofsoybeanseedlings,measuredthechlorophyllcontentofsoybeanseedlings,thecontentofmalondialdehyde(MDA),proline(Pro)content,superoxidedismutase(SOD)andotherindicatorstoreflecttheimpactofpollutiononthegrowthofsoybeanseedlings.Theresultsshowthat:withtheincreaseoftheconcentrationofdibutylphthalate,andsoybeanseedgerminationenergyandgerminationrateshowadownwardtrend;andchlorophyllcontentofseedlings,andsolublesugarcontentshowedadownwardtrend,whilemalondialdehyde(MDA)content,prolinecontentandsuperoxidedismutase(SOD)activityisgenerallyincreased.Anddibutylphthalateonthegerminationrateof2.50mg/L,chlorophyllcontent,solublesugarcontentofthedegreeofinhibitionofthedibutylphthalateinhibitedthegrowthofsoybean.KEYWORD：Dibutylphthalate;pollution;soybeanseedlings;physiologicalandbiochemicalindexes目錄TOC\o"1-3"\h\u摘要 IIABSTRACT III第一章前言 61.1植物的逆境生理相關(guān)性概念 61.2鄰苯二甲酸二丁酯的介紹 61.3大豆的介紹 71.4植物受逆境脅迫影響的研究現(xiàn)狀 71.5研究內(nèi)容 81.6研究目的及意義 8第二章實驗部分 92.1儀器與試劑 92.1.1表2-1主要儀器 92.1.2表2-2實驗主要試劑及生產(chǎn)廠家 102.2材料與方法 112.3大豆種子萌發(fā)率及脅迫處理 112.3.1脅迫處理對大豆種子萌發(fā)率影響的實驗 112.3.2留樣再進行后期實驗 112.4葉綠體色素含量的測定 122.4.1原理 122.4.2方法 132.4.3結(jié)果計算 132.5大豆幼苗葉片中丙二醛（MDA）的測定 132.5.1實驗原理 132.5.2測定方法 142.5.3計算 142.6幼苗組織中游離脯氨酸（Pro）含量測定 152.6.1實驗原理 152.6.2方法步驟 152.6.3結(jié)果計算 152.7超氧化物歧化酶（SOD）含量的測定 162.7.1原理 162.7.2操作方法 16第三章結(jié)果與討論 183.1數(shù)據(jù)處理與分析：用EXCEL2010進行數(shù)據(jù)處理分析 183.2大豆種子萌發(fā)率的探討 183.2.1鄰苯二甲酸二丁酯脅迫對大豆種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率的影響 183.3葉綠素含量分析 193.4丙二醛測定含量 203.5可溶性糖的含量 213.6游離脯氨酸含量 223.7超氧化物歧化酶（SOD）含量 243.7.1超氧化物歧化酶（SOD）標準曲線的制作 243.7.2SOD含量的數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析 25結(jié)論 27收獲與體會 28致謝 29參考文獻 30 第一章前言1.1植物的逆境生理相關(guān)性概念 凡是對植物生存與生長不利的環(huán)境因子總稱為逆境（stress）[[]郝建軍,康宗利主編.植物生理學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005.06.[]郝建軍,康宗利主編.植物生理學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005.06.植物在環(huán)境脅迫下發(fā)生的相應變化稱為脅變（strain）[[]朱廣廉.植物生理學實驗[M].北京:北京大學出版社,1990.[]朱廣廉.植物生理學實驗[M].北京:北京大學出版社,1990.逆境對植物的傷害輕則表現(xiàn)為生長發(fā)育受抑制，重則表現(xiàn)為某些細胞受傷死亡或器官出現(xiàn)壞死癥狀，甚至整株死亡。逆境對植物的傷害有三種方式：原初直接傷害、原初間接傷害和次生脅迫傷害。原初直接傷害是原初脅迫對細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的直接損傷；原初間接傷害是由原初環(huán)境脅迫通過降低代謝速度、改變代謝方向、造成代謝紊亂、產(chǎn)生有毒物質(zhì)等對植物和細胞產(chǎn)生的傷害；次生脅迫傷害是由原初脅迫引起次生脅迫所導致的傷害，例如高溫脅迫引起植物水分虧缺所產(chǎn)生的傷害。生活在自然環(huán)境中的植物對于環(huán)境脅迫都具有一定的抵抗能力，這種能力稱為植物的抗逆性（stressresistance），簡稱抗性[[]趙世杰,劉華山,董新純等.植物生理學實驗指導[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,1998.[]趙世杰,劉華山,董新純等.植物生理學實驗指導[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,1998.植物抗逆性主要有兩種形式：二是耐逆性（stresstolerance），即植物通過自身的生理生化變化來適應環(huán)境的能力。在逆境條件（鄰苯二甲酸二丁酯）作用下，植物對其具有適應能力或抗性，有的則表現(xiàn)為較為敏感。當脅迫超出了植物正常生長、發(fā)育所能承受的范圍，將導致植物體內(nèi)產(chǎn)生一系列的生理生化變化，甚至使植物受到傷害死亡[[]曾巧云,莫測輝,蔡全英.農(nóng)業(yè)土壤中鄰苯二甲酸酯的污染現(xiàn)狀與危害[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2009年第7期[]曾巧云,莫測輝,蔡全英.農(nóng)業(yè)土壤中鄰苯二甲酸酯的污染現(xiàn)狀與危害[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2009年第7期1.2鄰苯二甲酸二丁酯的介紹鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutylphthalate,DBP）是酞酸酯類化合物的一種，作為聚氯乙稀、聚乙烯、聚苯乙烯生產(chǎn)中的改性添加劑，主要用于增大產(chǎn)品的可塑性和提高產(chǎn)品的強韌度[[]百度百科HYPERLINK"/view/854648.htm"/view/854648.htm,2012-05-28.]。由于該類化合物無法聚合到塑料的基質(zhì)中去，隨著時間的推移，它們可由塑料轉(zhuǎn)移到外環(huán)境中，造成大氣、水、土壤的污染[[]葉常明.環(huán)境中的鄰苯二甲酸酯.環(huán)境科學進展,1993,2(36~46).]。調(diào)查顯示，市場銷售的畜禽類食品、蔬菜、水果和干貨中均已檢測出DBP，甚至在人體血液中也有檢出[[]李文英,熊麗,劉榮,蔣園,胡芹芹,王黎明.2007.鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）對斑馬魚（Brachydaniorerio）生理生化特性的影響［J］.生態(tài)毒理學報,3（1）:117-122]。DBP可通過呼吸、飲水、食物及皮膚接觸等途徑進入人體，其潛在的生態(tài)毒性已引起人們的廣泛關(guān)注[[][]百度百科HYPERLINK"/view/854648.htm"/view/854648.htm,2012-05-28.[]葉常明.環(huán)境中的鄰苯二甲酸酯.環(huán)境科學進展,1993,2(36~46).[]李文英,熊麗,劉榮,蔣園,胡芹芹,王黎明.2007.鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）對斑馬魚（Brachydaniorerio）生理生化特性的影響［J］.生態(tài)毒理學報,3（1）:117-122[]趙鴻均.1989.塑料大棚園藝［M］.北京:科學出版社,36-40[]劉慧杰,舒為群.2004.鄰苯二甲酸二丁酯生殖發(fā)育毒性研究進展［J］.環(huán)境與健康雜志,21（2）:122-124[]李佳華,慕君玲,郭紅巖,王曉蓉,尹大強.2005.鄰苯二甲酸二丁酯污染對苦草生理生化指標的影響［J］.環(huán)境化學,24（1）:31-351.3大豆的介紹大豆（學名：Glycinemax），是一種其種子含有豐富的蛋白質(zhì)的豆科植物。大豆呈橢圓形、球形，顏色有黃色、淡綠色、黑色等，故又有黃豆、青豆、黑豆之稱。大豆最常用來做各種豆制品、榨取豆油、釀造醬油和提取蛋白質(zhì)。豆渣或磨成粗粉的大豆也常用于禽畜飼料。大豆含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、不飽和脂肪酸、鈣及B族維生素是我國居民膳食中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源。大豆蛋白質(zhì)含量約為35%—40%，除蛋氨酸外，其余必需氨基酸的組成和比例與動物蛋白相似，而且富含谷類蛋白質(zhì)缺乏的賴氨酸，是與谷類蛋白質(zhì)互補的天然理想食品。大豆中脂肪含量約為15%—20%，其中不飽和脂肪酸占85%，亞油酸高達50%，且消化率高，還含有較多磷脂。大豆中碳水化合物含量約為25%—30%，有一半是膳食纖維，其中棉籽糖和水蘇糖在腸道細菌作用下發(fā)酵產(chǎn)生氣體，可引起腹脹。大豆中含有豐富的磷、鐵、鈣，每100g大豆中分別含有磷571mg、鐵11mg、和鈣367mg，明顯多于谷類。由于大豆中植酸含量較高，可能會影響鐵和鋅等礦物元素的生物利用。大豆中維生素B1、維生素B2和煙酸等B族維生素含量也比谷類多數(shù)倍，并含有一定數(shù)量的胡蘿卜素和豐富的維生素[[]百度百科[]百度百科HYPERLINK"/view/30289.htm"/view/30289.htm,2012-05-28.1.4植物受逆境脅迫影響的研究現(xiàn)狀一直以來，很多的農(nóng)業(yè)生物科技工作者采用不同的作物對其抗逆性進行了較深入詳細的研究，包括轉(zhuǎn)基因研究、抗氧化作用研究、逆境環(huán)境下保護酶系統(tǒng)的影響。其中，逆境脅迫的研究又包括鹽脅迫、水分脅迫、溫度脅迫、鹽堿地脅迫等。1.5研究內(nèi)容為此本實驗研究了鄰苯二甲酸二丁酯污染對大豆幼苗生理生化指標的影響，測定大豆幼苗的葉綠素含量、丙二醛（MDA）的含量、脯氨酸（Pro）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）等指標來反映污染對大豆幼苗生理生化指標的影響。所涉及實驗內(nèi)容流程包括：一、設計實驗方案，大豆種子萌發(fā)率及脅迫處理；二、當大豆幼苗長到一定高度后進行分組移栽，分為5組，每組3盆，共15盆。對移栽后的大豆幼苗植株施加一定梯度濃度的鄰苯二甲酸二丁酯脅迫培養(yǎng)；三、待經(jīng)過合適的脅迫時間及栽種后，取樣測定大豆幼苗的各項生理指標并分析其所產(chǎn)生的生理變化。1.6研究目的及意義研究的目的是通過研究植物在不同濃度梯度條件下的大豆幼苗組織生理生化變化，測量出鄰苯二甲酸二丁酯對大豆幼苗抗逆性影響的相應生理指標。進行數(shù)據(jù)分析論證，并在此基礎(chǔ)上，通過數(shù)據(jù)處理得出鄰苯二甲酸二丁酯噴灑大豆幼苗的最適濃度，對農(nóng)作物抗逆性的深入研究與發(fā)展具有重要的意義。第二章實驗部分 2.1儀器與試劑2.1.1表2-1主要儀器儀器名稱型號生產(chǎn)廠家可見分光光度計722N型上海菁華科技有限公司常規(guī)離心機80-2型離心機金壇大地自動化儀器廠（0-4000r/min）；常州澳華儀器有限公司（0-4000r/min）電熱恒溫水浴槽（鍋）上海精宏實驗設備有限公司大/小漏斗電子分析天平冰箱華凌冰箱濾紙、擦鏡紙、吸水紙培養(yǎng)皿塑料盆15mL離心管研缽試管、具塞刻度試管20mL、大試管20mL量筒100mL刻度吸管10mL、2mL剪刀注射器/滴管5-10mL/微量注射器（微量進樣器）棕色容量瓶25mL/容量瓶1000mL玻璃棒

2.1.2表2-2實驗主要試劑及生產(chǎn)廠家試劑名稱純度生產(chǎn)廠家鄰苯二甲酸二丁酯分析純天津市大茂化學試劑廠黃（大）豆市售佳惠商場（超市）10%次氯酸鈉分析純天津市大茂化學試劑廠蒸餾水、自來水自制砂子、石英砂實驗試劑J天津市大茂化學試劑廠10%、20%三氯乙酸分析純AR上海凌峰化學試劑有限公司2-硫代巴比妥酸上?？曝S化學試劑有限公司四水硝酸鈣分析純AR廣州化學試劑廠氫氧化鈉（片）分析純天津市白世化工有限公司氯化鈉，0.9%氯化鈉，生理鹽水分析純天津市大茂化學試劑廠硝酸鉀分析純天津市大茂化學試劑廠95%乙醇分析純天津市大茂化學試劑廠/天津市進豐有限公司無水乙醇分析純天津市大茂化學試劑廠/天津市進豐有限公司甲苯分析純廣州市東紅化工廠冰乙酸分析純天津市光復精細化工研究所85%磷酸分析純洛陽市化學試劑廠水合茚三酮分析純天津市光復精細化工研究所L-脯氨酸合格/生化試劑J天津市光復精細化工研究所氯仿/三氯甲烷分析純廣州市東紅化工廠冰塊自制磺基水楊酸分析純天津市大茂化學試劑廠80%丙酮分析純廣州市東紅化工廠37%HCL分析純廣州市東紅化工廠碳酸鈣粉分析純天津市廣成化學試劑有限公司硝酸銨磷酸二氫鉀分析純AR天津市大茂化學試劑廠硫酸鎂分析純天津市永大化學試劑廠有限公司七水硫酸亞鐵分析純天津市大茂化學試劑廠牛血清蛋白乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa）分析純AR廣東光華科技股份有限公司碘化鉀硼酸分析純AR天津市大茂化學試劑廠硫酸錳分析純AR天津市大茂化學試劑廠硫酸鋅分析純天津市永大化學試劑廠有限公司二水合鉬酸鈉分析純AR廣東光華科技股份有限公司硫酸銅分析純AR天津市大茂化學試劑廠氯化鈷考馬斯亮藍G250合格/生物染劑天津市光復精細化工研究所鄰苯三酚分析純浙江省溫州市東升化工試劑廠三羥甲基氨基甲烷（Tris）合格天津市光復精細化工研究所氯化鈷分析純天津市永大化學試劑廠有限公司2.2材料與方法經(jīng)篩選過的子粒飽滿的市售“黃（大）豆”為試驗材料，是在佳惠市場（超市）購買。2.3大豆種子萌發(fā)率及脅迫處理2.3.1脅迫處理對大豆種子萌發(fā)率影響的實驗方法與步驟：1、挑選大小一致、飽滿的大豆用自來水水洗3遍，30℃浸種4.5小時，然后置于鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿30粒，加入1/2濃度的Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)2d，每處理重復3次[[]馮文新,張寶紅.鈣處理對鹽脅迫下大豆種子萌發(fā)及其生理生化指標的影響.大豆科學,1997,16(1):48-52[]馮文新,張寶紅.鈣處理對鹽脅迫下大豆種子萌發(fā)及其生理生化指標的影響.大豆科學,1997,16(1):48-52（1）CK:1/2Hoagland；0.00mg/L鄰苯二甲酸二丁酯，10mL；（2）T1:1/2Hoagland，0.50mg/L鄰苯二甲酸二丁酯，10mL；（3）T2:1/2Hoagland，2.50mg/L鄰苯二甲酸二丁酯，10mL；（4）T3:1/2Hoagland，5.00mg/L鄰苯二甲酸二丁酯，10mL；（5）T4:1/2Hoagland，10.0mg/L鄰苯二甲酸二丁酯，10mL。2、后置于實驗室（畢業(yè)實驗是在寒假期間完成的，沒有恒溫培養(yǎng)箱可用，培養(yǎng)溫度約15℃）中培養(yǎng)5天進行萌發(fā)，每天定時觀察,統(tǒng)計大豆種子的發(fā)芽數(shù)[[]陳曉曉,張雯,武陽,楊旭.鄰苯二甲酸二丁酯對擬南芥幼苗的氧化損傷[J].生態(tài)毒理學報.2010,第5卷,第3期,402-406[]陳曉曉,張雯,武陽,楊旭.鄰苯二甲酸二丁酯對擬南芥幼苗的氧化損傷[J].生態(tài)毒理學報.2010,第5卷,第3期,402-4062.3.2留樣再進行后期實驗1、選擇長勢一致的各6個大豆幼苗轉(zhuǎn)入播種于盛有用水反復沖洗的砂子的塑料盆中[[]中國科學院上海植物生理研究所,上海市植物生理學會.現(xiàn)代植物生理學實驗指南[M].北京:科學出版社,1999.[]中國科學院上海植物生理研究所,上海市植物生理學會.現(xiàn)代植物生理學實驗指南[M].北京:科學出版社,1999.2、每天定時定量澆1/10的Hoagland溶液，室外自然光照下培養(yǎng)。待大豆幼苗長到3葉期時，分別進行如下處理:（1）CK（對照組）:1/10Hoagland；0.00mg/L鄰苯二甲酸二丁酯，10mL；（2）T1:1/10Hoagland，0.50mg/L鄰苯二甲酸二丁酯，10mL；（3）T2:1/10Hoagland，2.50mgl/L鄰苯二甲酸二丁酯，10mL；（4）T3:1/10Hoagland，5.00mg/L鄰苯二甲酸二丁酯，10mL；（5）T4:1/10Hoagland，10.0mg/L鄰苯二甲酸二丁酯，10mL。每個處理三個重復。每天用相應的營養(yǎng)液澆灌材料，以保持處理濃度不變，每天定時定量處理植物，連續(xù)處理兩周后取樣，洗凈，用吸水紙吸干，每個處理三個重復。3、在植物幼苗處理這一段時間內(nèi)，每天定時觀察大豆幼苗生長情況，后期取樣檢測葉綠素含量、丙二醛（MDA）的含量、脯氨酸的含量、超氧化物歧化酶（SOD）含量及活性等指標，取其平均值，以比較不同濃度的鄰苯二甲酸二丁酯脅迫下，對大豆幼苗生理生化指標的影響。測定項目發(fā)芽率及發(fā)芽勢的計算[[]慈恩，高明，王子芳，等.鎘對紫花[]慈恩，高明，王子芳，等.鎘對紫花苜蓿種子萌發(fā)與幼苗生長的影響研究.農(nóng)業(yè)學報，2007，第15卷第1期:97~98.發(fā)芽勢(%)=3d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；（2.0）發(fā)芽率(%)=7d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；（2.1）2.4葉綠體色素含量的測定2.4.1原理葉綠素的含量是植物生長狀態(tài)的一個反映，一些環(huán)境如受到污染等的脅迫作用都可以影響葉綠素的含量與組成，并因之影響植物的光合作用，這與植物的逆境生理有重要相關(guān)性。根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長下測定其吸光度，即可公式計算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)的質(zhì)量濃度C和液層厚度L成正比，即：A=ａCL，式中，ａ為比例常數(shù)。當溶液濃度以質(zhì)量濃度為單位，液層厚度為1cm時，ａ為該物質(zhì)的吸光值。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光值可通過測定已知質(zhì)量濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長的總吸光度等于各組分在相應波長下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性[[]侯福林主編.植物生理學實驗教程[M].北京:科學出版社,2004:89]。要測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在3個特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、葉綠素b時，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰[[[]侯福林主編.植物生理學實驗教程[M].北京:科學出版社,2004:89[]楊善元:1983.關(guān)于測定葉綠素含量及a:b值等若干問題,植物生理學通訊,1983(4):69由于葉綠體色素在不同溶劑中吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時，計算公式也有所不同。葉綠素a、葉綠素b在體積分數(shù)為95%的乙醇中最大吸收峰的波長分別為665nm,和649nm，類胡蘿卜素為470nm，據(jù)此可關(guān)系式為：（2.2）（2.3）2.4.2方法1、取新鮮大豆幼苗葉片，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。2、稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2-3mL體積分數(shù)為95%的乙醇，研成勻漿，再加乙醇10mL,繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3-5min.。3、取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。4、用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中，直到濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25mL，搖勻。5、把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以體積分數(shù)為95%的乙醇為空白，在波長665nm、649nm和479nm下測定吸光度[[][]張志良主編.植物生理學實驗指導（第二版）[M].北京:高等教育出版社2.4.3結(jié)果計算將測定得到的吸光值代入上面的式子：（2.2）、（2.3）。據(jù)此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度（Ca、Cb：mg/L），二者之和為總?cè)~綠素的濃度。最后根據(jù)下式可進一步求出植物組織中葉綠素的含量：2.5大豆幼苗葉片中丙二醛（MDA）的測定 2.5.1實驗原理植物器官衰老或在逆境條件下，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物之一，其含量可以反映植物遭受傷害的程度。在酸性和高潮條件下，MDA可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成紅棕色的三甲川（3，5，5-三甲基惡唑-2，4-二酮），其最大吸收峰在532nm處。但是糖與TBA顯色反應產(chǎn)物在532處也有吸收(最大吸收峰在450nm處)，因此測定植物組織中MDA時會受可溶性糖等多種物質(zhì)的干擾。由于植物在遭受鄰苯二甲基二丁酯化學脅迫時可溶性糖會會增加，因此測定植物組織中MDA-TBA反應物質(zhì)含量時一定要排除可溶性糖的干擾[[]趙世杰等,植物組織中丙二醛測定方法的改進.植物生理學通訊,1994,30(3):2[]趙世杰等,植物組織中丙二醛測定方法的改進.植物生理學通訊,1994,30(3):2采用雙組分分光光度計法可分別求出MDA和可溶性糖的含量。據(jù)郞伯-比爾定律：A=αCL，當液層厚度為1cm時，α=A/C,α稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時，某一波長下的消光值等于此混合液在該波長下各顯色物質(zhì)的消光值之和。已知蔗糖與TBA顯色反應產(chǎn)物在450nm和532nm波長下的比吸收系數(shù)分別為85.40和7.400；MDA在450nm波長下無吸收，故該波長的比吸收系數(shù)為0。532nm波長下的比吸收系數(shù)為155，根據(jù)雙組分分光度計法建立方程組，求解方程得計算公式為：(2.5),(2.6)式中:C1——可溶性糖的濃度（mmol/L）;C2——MDA的濃度（umol/L）；A450，A532,A600分別代表450，532，600nm波長下的消光度值。2.5.2測定方法MDA的提取[[][]郝再彬,蒼晶,徐仲等編,植物生理實驗,哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學出版社,2004.09稱取剪碎試材1g，加入2mL質(zhì)量分數(shù)為10%的TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8mLTCA進一步研磨，勻漿4000r/min離心10min，上清液為樣品提取液。顯色反應和測定吸取離心的上清液2mL（對照加2mL蒸餾水），加入2mL質(zhì)量分數(shù)為0.6%的TBA溶液，混勻，將混合物于沸水浴上反應15min，迅速冷卻后離心。取上清液測定450、532、600nm波長下消光度。2.5.3計算按式（2.5）直接求得大豆葉片樣品提取液中可溶性糖的濃度。按式（2.6）直接求得大豆葉片樣品提取液中MDA的濃度。從求得MDA的濃度，根據(jù)植物組織的質(zhì)量計算測定樣品中MDA的質(zhì)量摩爾濃度。（2.7）式中：c——MDA的濃度（umol/L）;N——提取液體積（mL）;W——植物組織鮮重（g）。2.6幼苗組織中游離脯氨酸（Pro）含量測定2.6.1實驗原理采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減少了其他氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品狀態(tài)（干樣或鮮樣）限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應生成穩(wěn)定的紅色絡合物，用甲苯萃取后，此絡合物在波長520nm處有一最大吸收峰。在一定范圍內(nèi)脯氨酸濃度的高低與其消光值成正比[[]張志良主編.植物生理學實驗指導(第二版).北京:高等教育出版社[]張志良主編.植物生理學實驗指導(第二版).北京:高等教育出版社2.6.2方法步驟1、取7支具塞刻度試管按表2-3加入各試劑?；靹蚝笤诜兴屑訜?0min。表2-3各試管中試劑加入量試劑管號管號0123456脯氨酸標準溶液/mL0水/mL0.80.40冰乙酸/mL2222222茚三酮顯色液/mL3333333脯氨酸質(zhì)量/ug0248121620(2)取出冷卻后向各管加入5mL甲苯，充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層，以0號管為對照在波長520nm下比色。（3）c消光值為縱坐標，脯氨酸質(zhì)量為橫坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程。（1）脯氨酸提取[[]朱廣廉等.植物體內(nèi)游離脯氨酸的測定.植物生理學通訊[J],1983,19(1):35[]朱廣廉等.植物體內(nèi)游離脯氨酸的測定.植物生理學通訊[J],1983,19(1):35（2）吸取上清液2mL，加2mL冰乙酸和3mL顯色液，于沸水浴中加熱40nim,下步操作按標準曲線制作方法進行甲苯萃取和比色。2.6.3結(jié)果計算從標準曲線中查出測定液中脯氨酸的質(zhì)量，按下式計算樣品中脯氨酸干或鮮重的質(zhì)量分數(shù)。（2.8）式中：C——提取液中脯氨酸的質(zhì)量（ug），由標準曲線求得；V——提取液總體積（mL）;α——測定時所吸取的體積（mL）；W——樣品重（g）2.7超氧化物歧化酶（SOD）含量的測定2.7.1原理超氧化物歧化酶（SOD）是需氧生物中普遍存在的一種含金屬酶，它能夠防御活性氧化損傷及氧化物自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害。因此，其活性與植物抗性密切相關(guān)。SOD可催化下列反應：，大豆幼苗中含有較多的SOD，組織或細胞破碎后，可用pH=7.8的磷酸緩沖液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮將其析出[[]郝再彬,蒼晶,徐仲等編,植物生理實驗[M],哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學出版社,2004.09[]郝再彬,蒼晶,徐仲等編,植物生理實驗[M],哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學出版社,2004.092、考馬斯亮藍G-250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在465nm；當它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物時呈青色，其吸收峰改變?yōu)?95nm波長；考馬斯亮藍G250-蛋白質(zhì)復合物的高消光效應導致了蛋白質(zhì)宣測定的高敏感度[[]郭敏亮,姜涌明.考馬斯亮藍顯色液組分對蛋白質(zhì)測定的影響[J].生物化學與生物物理進展.1996,23(6)[]郭敏亮,姜涌明.考馬斯亮藍顯色液組分對蛋白質(zhì)測定的影響[J].生物化學與生物物理進展.1996,23(6)蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h保持穩(wěn)定。以牛血清蛋白（BSA）為標準品配制濃度梯度標準液，用考馬斯亮藍G250法進行蛋白含量的測定，作標準曲線[[]陳鈞輝,李俊,張冬梅,張?zhí)?朱婉華編.生物化學實驗(第四版).北京:科學出版社,2008.06[]陳鈞輝,李俊,張冬梅,張?zhí)?朱婉華編.生物化學實驗(第四版).北京:科學出版社,2008.062.7.2操作方法1、組織或細胞破碎：稱取5g大豆幼苗葉片或細胞，置于研缽中研磨，使組織或細胞破碎。2、SOD的提?。簩⑸鲜銎扑榈慕M織或細胞，加入2-3倍體積的0.05mol/LpH=7.8的磷酸緩沖液中，繼續(xù)研磨攪拌10min，使SOD充分溶解到緩沖液中，然后在4000r/min下，離心20min，棄沉淀，得提取液。3、除雜蛋白：提取液加入0.25倍體積的氯仿—乙醇混合溶劑攪拌15min，4000r/min離心20min，去雜蛋白沉淀，得粗酶液。4、SOD的沉淀分離：將上述粗酶液加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，4000r/min離心20min,得SOD沉淀。將SOD沉淀溶于0.05mol/LpH7.8的磷酸緩沖液中，于55-60℃熱處理15min，再4000r/min離心10min棄沉淀，得到SOD酶液。將上述提取液、粗酶液和酶液分別取樣，測定各自的SOD酶含量[[]郭勇編著.現(xiàn)代生化技術(shù)(第二版).[M].北京:科學出版社,2005.2[]郭勇編著.現(xiàn)代生化技術(shù)(第二版).[M].北京:科學出版社,2005.2（1）標準曲線的制備：取7支干凈的試管，按表2-4進行編號并加入試劑。表2--4考馬斯亮藍蛋白標準曲線的制作（牛血清蛋白濃度為：0.1mg/ml）試劑管號1（空白）234567樣液管標準牛血清蛋白（ml）--SOD樣液（ml）———————1.00.9%NaCL（ml）1.0-考馬斯亮藍G250（ml）4.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）0A595（nm)混勻，室溫靜置3min，以第1管為空白，于波長595nm處比色，讀取吸光度，以吸光度為縱坐標，各標準液濃度（ug/mL)作為橫坐標作圖得標準曲線。（2）樣液的測定：另取1支干凈試管，加入樣品液1.0ml及考馬斯亮藍染液4.0ml，混勻，室溫靜置3min,于波長595nm處比色，讀取吸光度，由樣品液的吸光度查標準曲線即可求出含量。第三章結(jié)果與討論3.1數(shù)據(jù)處理與分析：用EXCEL2010進行數(shù)據(jù)處理分析3.2大豆種子萌發(fā)率的探討3.2.1鄰苯二甲酸二丁酯脅迫對大豆種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率的影響發(fā)芽率反映了種子發(fā)芽的潛在能力，發(fā)芽勢是指種子發(fā)芽初期它在規(guī)定時間內(nèi)能正常發(fā)芽的種子粒數(shù)占供檢種子粒數(shù)的百分率，可作為判斷田間出苗率的指標[[]段光明.鋅對小麥抗旱熱性的保護機制[J].山西大學學報(自然科學版),1993,16(2):213.]。種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢越高，種子發(fā)芽速度越快，整齊度越好，在較廣的范圍內(nèi)就越能迅速生長[[[]段光明.鋅對小麥抗旱熱性的保護機制[J].山西大學學報(自然科學版),1993,16(2):213.[]DhindsaR.S.LeafSenescenceCorrelatedwithIncreasedLevelsofMembranePermeabilityandLipidPeroxidationandDecreasedLevelsofaSuperoxideDismutaseandCatalase[J].Exp.Bot,1981,(32):932.1鄰苯二甲酸二丁酯對發(fā)芽勢的影響由圖1-1可知：在萌發(fā)的前三天中，隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的增加，大豆種子的發(fā)芽勢普遍降低，最低點在10.00mg/L處，此時它正處于濃度的最大值，發(fā)芽情況受到抑制，發(fā)芽速度最慢，整齊度最差；另外，在0.00mg/L處的發(fā)芽勢位于高峰狀態(tài)，很明顯在沒有脅迫信用下，種子的發(fā)芽速度最快，整齊度好。這說明高濃度的鄰苯二甲酸二丁酯脅迫對大豆種子的發(fā)芽勢有顯著的抑制作用。圖1-1鄰苯二甲酸二丁酯-發(fā)芽勢鄰苯二甲酸二丁酯對發(fā)芽率的影響由圖1-2中可知：在萌發(fā)一周中所測得的大豆發(fā)芽率，普遍隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的增加，大豆種子的發(fā)芽率均有所下降，雖然在后兩個濃度梯度有回升現(xiàn)象，但仍低于空白對照組。其中在0.00mg/L時，發(fā)芽率最高，發(fā)芽速度最快，而在2.50mg/L時，發(fā)芽率最低，大豆種子在該濃度時嚴重受到抑制。因此該實驗表明，鄰苯二甲酸二丁酯在2.50mg/L時對大豆種子的發(fā)芽率抑制最大，在0.00mg/L至2.50mg/L以及大于2.5mg/L時的濃度，雖有抑制，但作用不明顯。圖1-2鄰苯二甲酸二丁酯-發(fā)芽率對比以上兩個圖例，可以知道，低濃度的鄰苯二甲酸二丁酯對大豆種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢影響不大，但當濃度高于0.50mg/L時，其對大豆種子的萌發(fā)存在明顯的抑制作用；從中可知大豆種子的萌發(fā)的指標隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的遞增先升高后降低，在濃度為2.50mg/L時皆處于低峰值。從大豆種子的萌發(fā)特性來看，2.50mg/L為最有不利于大豆種子萌發(fā)的濃度。3.3葉綠素含量分析葉綠素的含量是植物生長狀態(tài)的一個反映，一些環(huán)境如受到污染等的脅迫作用都可以影響葉綠素的含量與組成，并因之影響植物的光合作用，這與植物的逆境生理有重要相關(guān)性。過量的鄰苯二甲酸二丁酯滲入細胞后，使原生質(zhì)凝聚，葉綠素破壞。葉綠素含量的降低，直接影響到光合作用，光能的利用率降低，光合產(chǎn)物減少。由圖1-3可知：隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的增加中，葉綠素也隨著明顯地減少。在0.50mg/L時葉綠素含量達到最高峰值，此時的濃度最有利于光合作用，但超過0.50mg/L時葉綠素含量驟減，在2.50mg/L時跌到最低峰，此時，大豆幼苗葉片光合作用嚴重受到抑制。之后，圖中曲線趨于平緩，即5.00mg/L與10.00mg/L時的光合作用受抑制程度與2.50mg/L時差不多。所以，大豆幼苗在鄰苯二甲酸二丁酯脅迫下，光合作用顯著受抑制，尤其在2.50mg/L時，葉綠素含量最低，即受破壞程度最大。圖1-3鄰苯二甲酸二丁酯-葉綠素含量3.4丙二醛測定含量植物器官衰老或在逆境條件下，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物之一，其含量高低表明了葉片細胞膜脂的過氧化程度，是大豆細胞膜遭受逆境傷害程度的指標。由圖1-4可知：隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的增加，丙二醛含量也由低到高的逐步增加。在0.00mg/L至0.50mg/L之間，曲線成比例上升且上升趨勢很快，而0.50mg/L至10.00mg/L之間，曲線趨于平緩上升，其中0.00mg/L時丙二醛處于最低峰值，10.00mg/L時處于最高峰值。從中可以看出，鄰苯二甲酸二丁酯對丙二醛有促進作用生成作用，這也表明了它對細胞的質(zhì)膜有傷害，都會使脂膜發(fā)生氧化，不論濃度高低，導致導致過氧化產(chǎn)物MDA增加，質(zhì)膜透性加大，細胞內(nèi)離子平衡失調(diào)，代謝紊亂，生長受到抑制。圖1-4鄰苯二甲酸二丁酯-丙二醛3.5可溶性糖的含量隨著鄰苯二甲酯二丁酯濃度的增加，大豆幼苗組織中的可溶性糖普遍減少。在沒有脅迫下的空白對照組（0.00mg/L）中，可溶性糖位于最高峰，而在有脅迫且濃度為2.50mg/L時，可溶性糖含量最低。可溶性糖是淀粉水解的產(chǎn)物，也是大豆抵抗逆境脅迫的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其濃度的增大可降低大豆幼苗組織中的滲透勢。而在葉綠素與鄰苯二甲酸二丁酯濃度關(guān)系中，光合作用在2.50mg/L處受抑制程度最大，因此淀粉合成少，可溶性糖也因此降低。同時，大豆幼苗組織中可溶性糖的減少，導致了其組織中的滲透勢越來越大，使得鄰苯二甲酸二丁酯對組織的破壞作用加強。圖1-5鄰苯二甲酸二丁酯-可溶性糖3.6游離脯氨酸含量植物在逆境脅迫下，游離脯氨酸會大量積累，且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)，同時植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植株體內(nèi)的水分情況，因此，脯氨酸是反映是植物缺水情況及抗逆性的生理指標之一[[]Troll,W.andJ.Lindsley:1955.Jour.Biol.Chem.,215:665-660[]Troll,W.andJ.Lindsley:1955.Jour.Biol.Chem.,215:665-660脯氨酸(Pro)在滲透調(diào)節(jié)中起著重要作用[[]GaryV.Theeffectsofbenzyladenine,cycloheximidoandcordycepinonwitinginducedABAandprolineaccumulationandABAandsaltinducedprolineaccumulationinbarleyleaves.Planthysiology,1986,82:703-707]。脯氨酸是植物細胞質(zhì)中一種游離氨基酸，具有很高的水溶性[[]劉友良,汪良駒.見:余叔文,湯章城主編.植物生理與分子生物學(第二版).北京:科學出版社,1998,752～769]。前人研究指出，脯氨酸(Proline)是多種植物細胞的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它可以保護細胞膜系統(tǒng)，維持胞內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)，減少胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解，脯氨酸含量的增高能夠降低小麥葉片細胞的滲透勢，防止細胞脫水。他的積累可以防止氮素的流失，而且不產(chǎn)生毒性副作用[]GaryV.Theeffectsofbenzyladenine,cycloheximidoandcordycepinonwitinginducedABAandprolineaccumulationandABAandsaltinducedprolineaccumulationinbarleyleaves.Planthysiology,1986,82:703-707[]劉友良,汪良駒.見:余叔文,湯章城主編.植物生理與分子生物學(第二版).北京:科學出版社,1998,752～769[]斯琴巴特爾,吳紅英.鹽脅迫對玉米種子萌發(fā)及幼苗生長的影響.干旱區(qū)資源與境,孫金月,趙玉田,常汝鎮(zhèn),梁博文,劉方.小麥細胞壁糖蛋白的耐鹽性保護作用與機制研究.中國農(nóng)業(yè)科學1997,30(4):9-152000,14(4):76-80由表2-5、圖片1-1、圖1-6、圖1-7，可知：隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的增加，游離脯氨酸的量從無到有，又急劇增加到最高峰值，后又急劇下載接近于0，最后消失。其中在2.50mg/L時值達到頂峰，說明此時大豆細胞膜系統(tǒng)受到嚴重破壞，此時對大豆幼苗的生長最不利。脯氨酸的標準曲線制作：表2-5脯氨酸的標準曲線

根據(jù)脯氨酸標準曲線表格進行各項實驗操作，制作得到實驗圖：圖片1-1脯按酸標準曲線的實驗圖根據(jù)脯氨酸標準曲線表格進行各項實驗操作，用可見光分光光度計測定得到吸光度，后制作散點圖，得到以下脯氨酸標準曲線：圖1-6脯氨酸標準曲線圖1-7鄰苯二甲酸二丁酯-脯氨酸質(zhì)量分數(shù)3.7超氧化物歧化酶（SOD）含量植物在正常生長條件下，細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，活性氧水平很低，不會傷害細胞[[]王建華,劉鴻先.SOD在植物逆境及衰老中的作用.植物生理學通訊,1980,(1):1-7]。在鹽分脅迫生長環(huán)境中，會產(chǎn)生過多的活性氧自由基，為了清除這些活性氧自由基，植物體內(nèi)形成了多種防御機制，主要有兩種，一種是抗氧化酶類，如超氧化物歧化酶(SOD)[]王建華,劉鴻先.SOD在植物逆境及衰老中的作用.植物生理學通訊,1980,(1):1-73.7.1超氧化物歧化酶（SOD）標準曲線的制作表2-6超氧化物歧化酶（SOD）標準曲線 牛血清蛋白濃度為：0.1mg/ml根據(jù)考馬斯亮藍測定超氧化物歧化酶（SOD)標準曲線進行各項實驗操作，制作得到實驗圖：圖片1-2考馬斯亮藍測定SOD酶含量實驗圖根據(jù)考馬斯亮藍測定超氧化物歧化酶（SOD)標準曲線進行各項實驗操作，用可見光分光光度計測定得到吸光度，后制作散點圖，得到以下SOD標準曲線：圖1-8超氧化物歧化酶（SOD）標準曲線圖3.7.2SOD