FITCAnnexinVPI雙染色法檢測凋亡細胞

/FITＣ－AｎnexｉnV/PI雙染色法檢測凋亡細胞實驗目的了解凋亡細胞的變化及檢測方法。了解ＦIＴＣ-ＡnnｅxiｎV/PI雙染色法檢測凋亡細胞的原理及方法。實驗原理細胞凋亡是細胞內由多個基因控制的死亡程序被活化而導致的細胞自殺（ｃｅｌlｓuicide）。膜磷脂酰絲氨酸原來位于細胞膜的內部.在細胞凋亡早期，細胞膜上的膜磷脂酰絲氨酸外翻與AnneｘinV結合,使其被染成綠色。在細胞凋亡晚期,細胞膜破裂，使得PＩ進入細胞當中與DNＡ結合，使其被染成紅色。細胞壞死（ｃelｌnecｒosiｓ):是由外部化學、物理或生物因素的侵襲而造成的細胞崩潰裂解,也被描述為細胞謀殺（cｅlｌmurdｅr）。喜樹堿（camptothｅｃin，CＰT)是一種植物來源的抗腫瘤藥物，可誘導腫瘤細胞凋亡。AnnexiｎV是一種可與磷脂酰絲氨酸(phoｓphatidylsｅrine,PS）特異結合但不能通過正常細胞膜的物質.碘化丙啶(pｒｏｐiｄiuｍiodide，ＰI）是一種發(fā)出紅色熒光的DNA結合染料,也不能透過活細胞完整細胞膜.細胞凋亡早期，細胞膜ＰS由膜脂雙層內側轉位至外側，F(xiàn)ITC標記的AnnｅxinV（AnnｅxinＶ－ＦＩTC)即可與其結合，使細胞膜處呈綠色。細胞凋亡中晚期,膜通透性變大,PＩ可進入細胞與核內DＮA結合。激光共聚焦顯微鏡(LSCM）以單色激光作為光源，并用附設光源針孔（pinｈole）使光源成為點光源。除此之外，在檢測器前方也有一個檢測針孔，點光源對標本內焦平面上的每一檢測針孔后的光電點掃描，標本上的被照射點在檢測針孔成像，由倍增管或冷電耦合器件逐點或逐線接受，迅速在計算機監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像,光源針孔與檢測針孔的位置相對于物鏡焦平面是共軛的,焦平面上的點同時聚焦于光源針孔和檢測針孔，焦平面以外的點不會在檢測針孔成像,這就是所謂的“共聚焦”，這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點。多通道LSＣＭ還可同屏采集顯示3個不同發(fā)射波長的熒光色及１個混合色圖像，對研究2種或2

種以上物質的共存有明顯優(yōu)點。在顯微鏡的載物臺上加一個微量步進馬達控制載物臺的升降，最小步進距離為0.1μｍ，使焦平面依次位于標本的不同層面上，可以逐層獲得標本的各個光學橫斷面的圖像，實現(xiàn)“光學切片"的目的.通過不同的焦平面產(chǎn)生的光學切片，可得到一塊較厚標本的三維圖像,這是ＬSCM最重要的作用之一。將存儲在計算機中的光學切片的焦平面信息結合起來，即可描述該標本的三維圖像。目前LＳCM最大有效解析厚度為0．45mm,掃描最小距離為0.１μｍ。流式細胞分選儀的作用原理：當經(jīng)熒光染色或標記的單細胞懸液放入樣品管中，被高壓壓入流動室內。流動室內充滿鞘液,在鞘液的包裹和推動下，細胞被排成單列,以一定速度從流動室噴口噴出。在流動室的噴口上配有一個超高頻的壓電晶體，充電后振動,使噴出的液流斷裂為均勻的液滴,待測細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正、負不同的電荷，當液滴流經(jīng)過帶有幾千伏的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉,落入各自的收集容器中，沒有充電的液滴落入中間的廢液容器,從而實現(xiàn)細胞的分離。流式細胞分選技術是利用流式細胞分選儀，以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強度，從而對細胞（或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態(tài)等進行定性或定量檢測的一種現(xiàn)代細胞分析技術,它可根據(jù)發(fā)射光的熒光強度和波長將發(fā)光顆粒亞群分開并可實現(xiàn)單克隆分選，能復雜樣本中的細胞進行鑒定、分類、定量和分離，單次可同時對其中一種到四種特定細胞進行超高速分選純化、高通量單克隆分選或細胞芯片制備。分選后的細胞能直接用于培養(yǎng)、移植、核酸提取、單細胞PCＲ擴增或原位雜交等，可進一步進行細胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同細胞之間的差異化研究。硬件中樣本細胞丟棄的比例低于5%,保證樣本中目標細胞的高回收率。實驗儀器及試劑材料:提前7天接瘤,并在實驗前24~４8h腹腔注射用生理鹽水配制的羥基喜樹堿溶液誘導凋亡。試劑:１mg／mL羥基喜樹堿溶液。0．０1mol/LPＢS（ｐH7．4)。AnnｅxiｎV-FITＣ凋亡檢測試劑盒。2mg/ｍL的ＰＩ貯存液：用ｐH7。4的ＰBS配制,—２０℃保存（3個月)。用時在PBS中稀釋1５００倍.5mg／mLＤAPI貯存液：甲醇配制，—20℃保存(3個月）。用時在PBＳ中稀釋100０0倍。用品激光共聚焦顯微鏡、10mＬ低速離心機、流式細胞分選儀剪刀、1０ｍＬ一次性注射器及針頭、乳膠手套、酒精棉球、10mL離心管、膠頭吸管、EＰ管、１０mL離心管、載玻片、吸水紙、載玻片染色盒(缸）等實驗步驟離心收集腹水瘤細胞。抽取腹腔液,150０r/min離心5mｉｎ,棄上清液。用PBS洗滌細胞。150０r/min離心5min，棄上清液。用PBS配制10%細胞懸液。4、ＡnｎexｉｎV—FITC/PI染色。在1。5mLeｐｐenｄoｒf管中加入10％的腫瘤細胞懸液0。5ｍL，2０00r／min離心5min，棄上清液。加入0。５mL結合緩沖液懸浮細胞。按試劑盒要求加入適量AnnexiｎV—ＦITC混勻,避光，室溫染色15mｉn按濃度要求加入適量PI貯存液，染色５mｉn。制備裝片，熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察。正常細胞：熒光光源時不被觀察。凋亡早期細胞：熒光光源時膜顯示綠色.凋亡晚期細胞：熒光光源時膜顯示綠色、核顯示紅色。壞死細胞：熒光光源時核呈紅色、膜綠色熒光不明顯.流式細胞儀分選。合并細胞樣品，以10%未染色細胞為內參，分選收集ＦITC陽性細胞。實驗結果如上圖所示，細胞膜被染成綠色，細胞核被染成紅色的細胞為凋亡細胞。其細胞膜上明顯的突出即為細胞凋亡后期的凋亡小體。圖中一些不在細胞上的綠色熒光小體,可能是已經(jīng)脫落下來的凋亡小體.另外，圖中一些不被染色且細胞表面光滑的細胞為正常細胞。如上圖所示,基本的信息都與第一個圖中一致，但是這個圖中還包括很多細胞形狀的周圍很大一部分被染成淡綠色,但是內部并沒有被染成紅色的核。這些細胞可能是壞死細胞,細胞膜破碎擴散導致周圍一片都被染成綠色,但是可能細胞內的核質已經(jīng)外流或者消失，所以不見被染成紅色的核.(分選后可能是量太少，導致在激光共聚焦顯微鏡中無法觀察到染好色的凋亡細胞。)實驗分析實驗中的所有染色過程都必須避光,因為在光情況下染料易分解，在最后共聚焦熒光觀察時觀察就不明顯.在分選細胞以后，在共聚焦顯微鏡下無法觀察到凋亡細胞,而將細胞懸液量加多一點在普通顯微鏡下觀察卻可以觀察到凋亡細胞，這可能是因為在共聚焦顯微鏡下觀察能加的量太少,而使細胞不容易觀察到.與前兩組的毫無細胞進行對比后發(fā)現(xiàn),在細胞分選時應該在接收管中加少許的緩沖液,防止細胞在進入接收管時直接打在管壁上被打碎。實驗注意事項盡量避免熒光染料、染色過程及染色標本暴露于光下.ＰI等DＮA結合染料有致癌性,操作時應注意自我防護及環(huán)境保護