慢病毒miR-126表達(dá)模型及其在肝星狀細(xì)胞的基因表達(dá),病毒學(xué)論文

慢病毒miR-126表達(dá)模型及其在肝星狀細(xì)胞的基因表達(dá),病毒學(xué)論文肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)活化及向肌成纖維母細(xì)胞(myofibroblast，MFB)轉(zhuǎn)化是肝纖維化構(gòu)成的中心環(huán)節(jié)，但機(jī)制復(fù)雜。既往對(duì)HSC基因表示出及其調(diào)控的研究，主要集中于mRNA的編碼區(qū)；然而，非編碼小分子RNA在基因表示出調(diào)控中的關(guān)鍵作用突破了傳統(tǒng)的觀點(diǎn)。微小RNA(microR-NA，miRNA)是一種長度約為22核苷酸(nucleotide，nt)內(nèi)源性的非編碼RNA，它們通過種子序列端堿基互補(bǔ)導(dǎo)致靶mRNA降解及抑制蛋白質(zhì)的合成，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表示出。miRNA在生物的生理調(diào)控和疾病的發(fā)生經(jīng)過中具有非常重要的作用，通過高度時(shí)序性、組織特異性的表示出，精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)30%~40%基因編碼蛋白，尤其是絕大多數(shù)信號(hào)通路下游分子的水平，并介入幾乎所有生命活動(dòng)及疾病經(jīng)過，包括細(xì)胞增殖和凋亡、生長發(fā)育、脂肪代謝及腫瘤發(fā)生等，處于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心位置。本實(shí)驗(yàn)將模擬內(nèi)源性miRNA體內(nèi)生成的生物經(jīng)過，以RNA聚合酶‖啟動(dòng)子的質(zhì)粒作為載體，在該啟動(dòng)子的下游插入miR-126編碼序列，構(gòu)建慢病毒miR-126表示出載體，通過過表示出技術(shù)體外轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞后可望獲得穩(wěn)定而持久的目的基因表示出，進(jìn)而為miR-126在肝纖維化發(fā)病經(jīng)過中靶點(diǎn)驗(yàn)證和功能研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1、材料與方式方法1.1材料慢病毒表示出系統(tǒng)〔systembiosciences,SBI,Cat.#Lv500A〕：包括慢病毒包裝質(zhì)粒如pPACK包裝質(zhì)粒混合物lentiviruspackageplasmidmix〔systembiosciences，Cat.#Lv500A-1〕、慢病毒表示出載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPTM；大腸桿菌DH5：上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；293TN細(xì)胞株：Sys-temBiosciences美國公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒：德國Qiagen公司；UNIQ-10柱式動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒：遼寧大連寶生物公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒：大連寶生物〔TaKaRa〕工程有限公司；TrizolLipofectmaine2000：美國In-vitrogen公司產(chǎn)品；葡萄糖，蛋白胨，酵母提取物，瓊脂粉：英國Oxoid公司產(chǎn)品；PCR試劑、T4連接酶、2000bpDNA分子量marker：日本TaKaRa公司產(chǎn)品；DulbeccoModifiedEagleMedi-um〔DMEM〕：美國Gibco公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國Promega公司。1.2方式方法1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)mir-126序列信息〔SangermiRBase數(shù)據(jù)庫收錄〕設(shè)計(jì)引物如下：上游引物5-GC-GAATTCCAGAGGGCAGCTAGCCCT-3，下游引物5-GCG-GATCCAAGCCTCACCTGTTCT-3，下劃線為酶切位點(diǎn)，上游引物的酶切位點(diǎn)為EcoRI，下游為BamHI，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。1.2.2PCR擴(kuò)增根據(jù)試劑盒講明書操作，以大鼠基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到約568bp的片段，PCR反響條件如下：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物取5L進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴(kuò)增條帶大小，按瓊脂糖凝膠回收試劑盒講明書回收目的片段，回收產(chǎn)物使用紫外分光光度計(jì)測定濃度，-20℃保存待用〔圖1〕。1.2.3重組慢病毒表示出載體miR-126的連接、序列鑒定及其病毒滴度測定對(duì)質(zhì)粒表示出載體(pcDNA-copGFPvector)以及回收的PCR片段進(jìn)行酶切線性化處理，將退火后稀釋產(chǎn)物和經(jīng)過線性化處理的載體連接于22℃連接2小時(shí)，轉(zhuǎn)化E.coliDH5感受態(tài)細(xì)胞，使用無菌牙簽挑取5個(gè)單菌落，使用載體多克隆位點(diǎn)兩端的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測陽性菌落，PCR產(chǎn)物5L進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴(kuò)增條帶大小〔圖2〕。DNA序列鑒定由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。復(fù)蘇293TN細(xì)胞，培養(yǎng)24h后進(jìn)行慢病毒miR-126轉(zhuǎn)染。使用病毒梯度稀釋法進(jìn)行病毒滴度測定，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP的表示出〔圖3〕，比擬GFP陽性率。1.2.4體外轉(zhuǎn)染慢病毒miR-126細(xì)胞分組如下：HSC組〔blank組〕；HSC+慢病毒載體〔Lv-GFP組〕；HSC+重組慢病毒載體〔Lv-miR-16，MOI:10組〕；HSC+重組慢病毒載體〔Lv-miR-16，MOI:25組〕；HSC+重組慢病毒載體〔Lv-miR-16，MOI:50組〕。以上3-6組分別組按感染復(fù)數(shù)〔MOI〕值感染HSC，步驟如下：復(fù)蘇HSC-T6到6孔培養(yǎng)板；24h后換液，更換培養(yǎng)液為不同MOI的轉(zhuǎn)染液，對(duì)照組中則添加新鮮的DMEM過夜培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染24h后，追加5mL培養(yǎng)液〔DMEM+10%FBS〕；72h后全部換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)；熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，比擬感染效率；取最佳MOI值得細(xì)胞組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)〔圖4〕。1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR〔RealtimePCR〕方式方法檢測各組感染后HSC細(xì)胞中miR-126的表示出各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后3d行Real-timePCR檢測miR-126基因的表示出，取1g總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒講明書操作合成cDNA第一鏈，取2L逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增基因名稱、引物序列、退火溫度、產(chǎn)物長度如表1?！矆D5〕。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件和SAM〔version2.1〕軟件包處理，各組數(shù)值均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗(yàn)比擬兩樣本的均數(shù)，方差分析進(jìn)行組件比擬，P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、結(jié)果。2.1pre-miR-126的PCR擴(kuò)增2%瓊脂樣凝膠電泳，110V恒壓15分鐘，PCR(mir126)=568bp，檢測值與理論值完全相符。2.2PCR鑒定陽性克隆及測序鑒定2%瓊脂糖凝膠電泳，被檢測的5個(gè)菌落均為陽性菌落。陽性菌落對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物長度=PCR(mir126)=656bp=568bp(PCR產(chǎn)物)-4bp(保衛(wèi)堿基)+92bp(載體多克隆位點(diǎn)兩端部分)。紫外分光光度檢測純度OD260/OD280：1.89和濃度為1.20g/l。測序鑒定圖譜結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致，未發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變。2.3慢病毒的包裝及滴度測定慢病毒顆粒體外293TN細(xì)胞后，倒置熒光顯微鏡下可見GFP的表示出〔圖3〕，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少，通過病毒的滴度計(jì)算公式計(jì)算：病毒滴度=(10/10)105=1105i-fu/L=1108ifu/mL。2.4不同MOI值Lv-126感染HSC的轉(zhuǎn)染效率的觀察Lv-miR-126慢病毒載體體外轉(zhuǎn)染HSC-T6后，熒光顯微鏡下比擬各組轉(zhuǎn)染率(圖4)分別為：20.62.5%(MOI=10)；69.73.6%(MOI:25)；86.11.4%(MOI:15)；98.32.7%(MOI:50)。結(jié)果顯示，隨著MOI值的增加，轉(zhuǎn)染率隨之增高。當(dāng)MOI為50時(shí)，細(xì)胞生長狀態(tài)佳，陽性率在95%以上。講明慢病毒Lv-miR-126體外轉(zhuǎn)染最佳量效比為MOI：50，因而，我們選擇MOI值50作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的MOI值。2.5Realtime、PCR檢測miR-126的表示出圖5顯示miR-126轉(zhuǎn)染后miR-126表示出分析結(jié)果。MOI為50時(shí)重組慢病毒體外轉(zhuǎn)染效率高，miR-126轉(zhuǎn)染后獲得了較高的表示出。3、討論miRNAs是一類在進(jìn)化上高度保守、長度約22nt的非編碼RNA，位于基因表示出上游的調(diào)控元素。成熟的miRNA能通過完全互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)方式與mRNA3非編碼區(qū)結(jié)合，特異性抑制靶基因的翻譯活性，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表示出。miRNA表示出異常會(huì)導(dǎo)致生理的異常及疾病的發(fā)生與進(jìn)展，研究表示清楚，非編碼小分子RNA在基因表示出調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，介入并調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、凋亡等生物學(xué)行為。miR-126及其互補(bǔ)類似物miR-126*是當(dāng)前最受關(guān)注與血管生成有關(guān)的基因表示出調(diào)控因子，定位于表皮生長因子樣構(gòu)造域7(epidermalgrowthfactor-1ikedomain7,EGFL7)基因7號(hào)內(nèi)含子內(nèi)。在結(jié)直腸癌、胃癌、前列腺癌、肝癌中miR-126表示出較正常組織為低。研究表示清楚，在很多病變的細(xì)胞或組織中，miR-126直接與VEGF的3UTRs序列互相作用調(diào)控VEGF蛋白的表示出，并與之成負(fù)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)還證明：miR-126通過靶向作用于表皮生長因子域7(EGFL7)、VCAM-l、同源框A9(HOXA9)、胰島素受體底物-1(IlLS-1)、p85-B等與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表示出，在腫瘤構(gòu)成中起重要作用。前期實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)通過芯片掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-126在HSC活化經(jīng)過中表示出差異明顯，提示miR-126可能在一定程度上介入了HSC生物學(xué)行為的調(diào)控。因而我們通過等待通過過表示出技術(shù)，使miR-126在HSC到達(dá)最高的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定持久的表示出，對(duì)基因治療慢性肝病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。外源基因進(jìn)入細(xì)胞通常需要載體，提供高效的基因轉(zhuǎn)移、長期穩(wěn)定的基因表示出及具有生物安全性的病毒載體是所有基因治療必須解決的問題。當(dāng)前所用的載體按來源，可分為病毒載體和非病毒載體。與非病毒載體相比，病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高、可在體內(nèi)穩(wěn)定表示出等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用的是第三