克隆基因的表達

關(guān)于克隆基因的表達第一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第五章克隆基因的表達第一節(jié)基因表達的基本條件第二節(jié)原核表達載體的構(gòu)建第三節(jié)克隆基因在植物細胞中的表達第二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)基因表達的基本條件1、基因表達的基本過程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達效率的因素第三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日1、基因表達的基本過程第四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日1、基因表達的基本過程基因的表達主要涉及到兩個過程：轉(zhuǎn)錄和翻譯。首先，目的基因通過轉(zhuǎn)錄(transcription)形成mRNA（信使RNA,messengerRNA)；然后，tRNA（轉(zhuǎn)運RNA,transferRNA）將各種氨基酸運送到核糖體并按照mRNA的密碼子順序?qū)⒏鞣N氨基酸連接成特定的氨基酸序列(translation)最終得到基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）。第五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)基因表達的基本條件1、基因表達的基本過程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達效率的因素第六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日Transcription(轉(zhuǎn)錄):

makinganRNAcopyofaDNAsequence.RNApolymeraseopensthepartoftheDNAtobetranscribed.OnlyonestrandofDNA(thetemplatestrand,antisensestrand)istranscribed.

轉(zhuǎn)錄的具體過程第七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日轉(zhuǎn)錄的具體過程Antisensestrand第八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日有效轉(zhuǎn)錄的基本條件Groupsofgenescodingforrelatedproteinsarearrangedinunitsknownasoperons.Anoperonconsistsofanoperator,promoter,regulator,andstructuralgenes.Theregulatorgenecodesforarepressorproteinthatbindstotheoperator,obstructingthepromoterofthestructuralgenes.Theregulatordoesnothavetobeadjacenttoothergenesintheoperon.Iftherepressorproteinisremoved,transcriptionmayoccur.半乳糖苷酶滲透酶轉(zhuǎn)乙?；傅诰彭摚参迨唔?，編輯于2023年，星期日第十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日Operonsareeitherinducibleorrepressibleaccordingtothecontrolmechanism.Seventy-fivedifferentoperonscontrolling250structuralgeneshavebeenidentifiedforE.coli.Bothrepressionandinductionareexamplesofnegativecontrolsincetherepressorproteinsturnofftranscription.第十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日

啟動子（promoter）：在基因序列中，標志著轉(zhuǎn)錄起始的可被RNA聚合酶識別的位點(DNA區(qū)段)，一般位于基因的上游。

終止子（terminator）：位于基因的編碼序列之外（一般在下游）的一段標志著轉(zhuǎn)錄停止的RNA聚合酶識別位點。有效轉(zhuǎn)錄的基本條件Prokaryoticgeneregulationdiffersfromeukaryoticregulation,butsinceprokaryotesaremucheasiertoworkwith,wefocusonprokaryotesatthispoint.

PromotersaresequencesofDNAthatarethestartsignalsforthetranscriptionofmRNA.Terminatorsarethestopsignals.mRNAmoleculesarelong(500-10,000nucleotides).

第十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)基因表達的基本條件1、基因表達的基本過程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達效率的因素第十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日TheGeneticCodeTocodeforthe20essentialaminoacidsageneticcodemustconsistofatleasta3-baseset(triplet)ofthe4bases.Ifoneconsidersthepossibilitiesofarrangingfourthings3atatime(4X4X4),weget64possiblecodewords,orcodons(a3-basesequenceonthemRNAthatcodesforeitheraspecificaminoacidoracontrolword).ThegeneticcodewasbrokenbyMarshallNirenbergandHeinrichMatthaei,adecadeafterWatsonandCrick'swork.Thegeneticcodeconsistsof61amino-acidcodingcodonsandthreeterminationcodons,whichstoptheprocessoftranslation.Thegeneticcodeisthusredundant(degenerateinthesenseofhavingmultiplestatesamountingtothesamething),with,forexample,glycinecodedforbyGGU,GGC,GGA,andGGGcodons.正確翻譯的基本條件第十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日Thegeneticcode第十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日MessengerRNA(mRNA)istheblueprintforconstructionofaprotein.TransferRNA(tRNA)isthetruckdeliveringtheproperaminoacidtothesiteattherighttime.tRNAwillforma"cloverleaf"structureduetocomplementarybasepairing.Atthetopofthelargelooparethreebases,theanticodon,whichisthecomplementofthecodon.Thereare61differenttRNAs,eachhavingadifferentbindingsitefortheaminoacidandadifferentanticodon.第十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日Ribosomesaretheorganelle(inallcells)whereproteinsaresynthesized.Theyconsistoftwo-thirdsrRNAandone-thirdprotein.Ribosomesconsistofasmall(inE.coli,30S)andlarger(50S)subunits.ThelengthofrRNAdiffersin

each.The30Sunithas16SrRNAand21differentproteins.The50Ssubunitconsistsof5Sand23SrRNAand34differentproteins.ThesmallersubunithasabindingsiteforthemRNA.

ThelargersubunithastwobindingsitesfortRNA第十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日TranslationistheprocessofconvertingthemRNAcodonsequencesintoanaminoacidsequence.Theinitiatorcodon(AUG)codesfortheaminoacidN-formylmethionine(f-Met).NotranslationoccurswithouttheAUGcodon.f-Metisalwaysthefirstaminoacidinapolypeptidechain,althoughfrequentlyitisremovedaftertranslation.TheintitatortRNA/mRNA/smallribosomalunitiscalledtheinitiationcomplex.Thelargersubunitattachestotheinitiationcomplex.Aftertheinitiationphasethemessagegetslongerduringtheelongationphase.第十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日NewtRNAsbringtheiraminoacidstotheopenbindingsiteontheribosome/mRNAcomplex,formingapeptidebondbetweentheaminoacids.ThecomplexthenshiftsalongthemRNAtothenexttriplet,openingtheAsite.ThenewtRNAentersattheAsite.WhenthecodonintheAsiteisaterminationcodon,areleasingfactorbindstothesite,stoppingtranslationandreleasingtheribosomalcomplexandmRNA.Oftenmanyribosomeswillreadthesamemessage,astructureknownasapolysomeforms.Inthiswayacellmayrapidlymakemanyproteins.第二十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日正確翻譯的基本條件1、具備起始密碼子2、具備終止密碼子3、具有正確的閱讀框第二十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日基因表達的基本過程第二十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)基因表達的基本條件1、基因表達的基本過程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達效率的因素第二十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日4、影響克隆基因表達效率的因素一般而言，所用啟動子的強度、DNA的轉(zhuǎn)錄其始序列、密碼子的選擇、mRNA的二級結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、基因的拷貝數(shù)等都會在一定程度上影響到轉(zhuǎn)基因的表達。啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響大多數(shù)大腸桿菌啟動子都含有兩種保守區(qū),即-10區(qū)(位于轉(zhuǎn)錄其始位點上游5-10bp，故稱為-10區(qū)，序列為5’--TTGACA)和-35區(qū)(位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游25bp處，一般有10bp組成，故稱為-35區(qū)，5’--TATAAT)。當然，實際的啟動子中很少具備與上述序列完全一致的區(qū)域，但是研究表明，啟動子的這兩個區(qū)域與上述保守序列的相似程度越高，該啟動子的表達能力也就越強。另外，這兩個保守區(qū)間的距離也是影響啟動子強度的重要因素，即這個間距越是接近于17bp，啟動子的活性就越強。第二十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日b.翻譯起始序列對表達效率的影響

mRNA的有效翻譯依賴于核糖體和其的穩(wěn)定結(jié)合，大腸桿菌的mRNA序列中，核糖體的結(jié)合位點是起始密碼子AUG和其上游的SD序列。所謂SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一種位于位于起始密碼子上游的一段保守序列，為細菌核糖體有效結(jié)合和翻譯起始所必需。一般SD序列的長度約為3-9bp，位于起始密碼子上游3-11堿基的位置，它與16S核糖體RNA的3‘端互補，控制了翻譯的起始。５’--AGGAGGUXXXAUG---mRNA３’AUUCCUCCACUAG-----16SrRNA3’末端第二十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日c.啟動子與克隆基因間的距離對基因表達的影響

研究表明啟動子和目的基因間的距離對基因的表達效率影響很大，所以在構(gòu)建新的表達載體時要考慮到這儀因素的影響。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的終止子序列，否則會導致細胞能量的大量消耗，或是形成不應(yīng)有的二級結(jié)構(gòu)，最終影響的目的基因的表達效率。PromoterSDATGGeneTerminatorTAAmRNA第二十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第五章克隆基因的表達第一節(jié)基因表達的基本條件第二節(jié)原核表達載體的構(gòu)建第三節(jié)克隆基因在植物細胞中的表達第二十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)原核表達載體的構(gòu)建一、原核表達真核基因的困難二、構(gòu)建原核表達載體的策略三、常用于原核表達載體的啟動子第二十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日一、原核表達真核基因的困難細菌的RNA聚合酶不識別真核基因的啟動子；真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列，在原核細胞中不能結(jié)合到核糖體上；真核基因一般含有內(nèi)含子，而原核細胞沒有象真核細胞那樣的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，所以mRNA中的內(nèi)含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表達出有功能的真核蛋白；表達的真核蛋白在原核細胞中很不穩(wěn)定，容易被細菌蛋白酶降解破壞。第二十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日二、構(gòu)建原核表達載體的策略將真核基因克隆到一個強大的原核啟動子和SD序列的下游，使得真核基因處于原核調(diào)控體系中。采用真核基因的cDNA序列作為構(gòu)建表達載體的目的基因，這樣就解決了原核細胞沒有RNA剪接功能的問題。構(gòu)建載體時，將真核基因插在幾個原核密碼子的后面，翻譯后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，這樣就可以避免被原核蛋白酶的識別和降解，最后可以將融合多肽切除。第三十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日三、常用于原核表達的啟動子Lac啟動子是β-半乳糖苷酶編碼基因LacZ的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，該啟動子可以被IPTG誘導，所以在培養(yǎng)基中加入該安慰誘導物就可以誘導目的基因的表達。Trp啟動子是編碼參與色氨酸生物合成的幾種酶的基因簇的上游調(diào)控序列，可以被色氨酸抑制，但可以被β-吲哚丙烯酸（β-

IAA）誘導。Tac啟動子是一種由Lac和Trp啟動子雜合而成的啟動子，其強度得到了很大的提高，也可被IPTG誘導表達。λPL啟動子是負責λDNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動子之一，是一種極強的啟動子。第三十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第五章克隆基因的表達第一節(jié)基因表達的基本條件第二節(jié)原核表達載體的構(gòu)建第三節(jié)克隆基因在植物細胞中的表達第三十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)克隆基因在植物細胞中的表達一、真核基因表達的特點二、用于植物表達的啟動子類型三、Ti質(zhì)粒及農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化第三十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日真核基因表達的特點一條成熟的mRNA只能翻譯成一條多肽，不存在象原核生物那樣的多基因操縱子模式；基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)很大，而且往往遠離啟動子達幾百個甚至上千個堿基，它們并不直接影響RNA聚合酶與啟動子區(qū)的結(jié)合，而是通過改變基因5’上游區(qū)DNA的構(gòu)型來影響RNA聚合酶與啟動子區(qū)的結(jié)合；mRNA合成后穿過核膜進入細胞質(zhì)中后才進行翻譯工作，而且通常都有復雜的成熟和剪接過程；基因的啟動子區(qū)和原核基因差異很大，而且有增強子序列存在。第三十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日真核基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游序列的特點特點起始位點上游調(diào)控區(qū)其它調(diào)控區(qū)原核生物嘌呤和嘧啶都能起始轉(zhuǎn)錄范圍小，-10區(qū)，-30到-70區(qū)為正調(diào)控區(qū)，+10到-20區(qū)為負調(diào)控區(qū)；有TTGACA區(qū)(-30~-40）參與調(diào)控。真核生物有“帽子”結(jié)構(gòu)專一性（嘧啶腺苷酸嘧啶），只有嘌呤（A為主）才能起始轉(zhuǎn)錄范圍大，TATAA/TA區(qū)位于-20到-30，-40到-110區(qū)為上游激活區(qū)；除了有對應(yīng)的CAAT區(qū)外，還有GC區(qū)和增強子。第三十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游序列的比較TTGACATATAATPu>Py-35區(qū)-30-70正調(diào)控區(qū)-20負調(diào)控區(qū)+1-10區(qū)GC區(qū)….CAAT區(qū)TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30增強子CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCTTA原核真核第三十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)克隆基因在植物細胞中的表達一、真核基因表達的特點二、用于植物表達的啟動子類型三、Ti質(zhì)粒及農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化第三十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達的啟動子類型天然誘導型啟動子組織特異性表達誘導型表達化學誘導型調(diào)控體系組織特異型啟動子組成型表達花椰采花葉病毒(CaMV)

35S啟動子水稻肌動蛋白1(actin1)act1啟動子

第三十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日表達組織啟動子來源目的植物作者花藥煙草Ta29煙草油菜Mariani（1990）種子菜豆植物凝集素基因PHA-LtobaccoAltabella（1990）葉片PEPC（PepcarboxylaseGeneofMaize）maizeKozial（1993）韌皮部水稻蔗糖合酶基因RSs1tobaccoShi（1994）果實ovarytissue（patent）tomatoMartineau（1995）胚乳玉米淀粉合酶基因GBSmaizeRussell（1997）根系發(fā)根農(nóng)桿菌的rolD啟動子番茄Varvara（2001）髓部玉米pGL2riceDatta（1998）部分用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的組織特異性啟動子第三十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日RSuS1啟動子的組織特異性表達35S-GusRSP1/2-Gus第四十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日

化學誘導型調(diào)控系統(tǒng)是指可被某些化學物質(zhì)誘導而表達啟動或表達關(guān)閉的轉(zhuǎn)基因調(diào)控系統(tǒng)。和植物天然的誘導型啟動子相比，該類系統(tǒng)的應(yīng)用更加靈活和自由，人們可以根據(jù)需求在轉(zhuǎn)基因作物生長的任何時期對轉(zhuǎn)基因的表達進行調(diào)控。作為理想的化學誘導物必須具備以下特性：第一，化學誘導物要對轉(zhuǎn)基因誘導的專一性高，在受體作物中其本身含量低且對受體作物無毒害作用；第二，對環(huán)境友好，且造價不高；第三，誘導效率要高，其工作濃度低且不是常用的化學物質(zhì)；第四，方便于噴灑或蘸根處理。

化學誘導型表達調(diào)控系統(tǒng)的原理第四十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日用于轉(zhuǎn)基因表達誘導物的分子式Moleculesusedforthechemicalinductionoftransgeneexpressioninplants.TetracyclineDexamethasoneEthanolRH-5992第四十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日化學誘導型表達調(diào)控系統(tǒng)的原理一般來說，化學誘導調(diào)控系統(tǒng)都包含兩個轉(zhuǎn)錄單元。第一個轉(zhuǎn)錄單元由一個組成型啟動子（通常為35S啟動子）驅(qū)動一個對特定化學成分敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子構(gòu)成；第二個轉(zhuǎn)錄單元由多拷貝的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、微型植物啟動子（通常為截短的35S啟動子）和目的基因串聯(lián)而成。第四十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日A去抑制型B失活型第四十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)克隆基因在植物細胞中的表達一、真核基因表達的特點二、用于植物表達的啟動子類型三、Ti質(zhì)粒及農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化第四十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日人們很早就發(fā)現(xiàn)雙子葉植物常發(fā)生一種冠癭瘤病，該病在法國、東歐和意大利的葡萄和果樹上曾大面積發(fā)生。1907年Smith和Townsent等首先發(fā)現(xiàn)這種冠癭瘤病是由根癌農(nóng)桿菌引發(fā)的。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與植物遺傳轉(zhuǎn)化第四十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與植物遺傳轉(zhuǎn)化1974年Zaenen等在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離了一種與腫瘤誘導有關(guān)的大型質(zhì)粒（大于200kb），稱為Ti質(zhì)粒。1977年Chilton等在研究農(nóng)桿菌侵染后形成的植物腫瘤細胞時，用分子雜交發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中存在著農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的一個片段，稱為T-DNA（Transfer-DNA）。實驗表明，T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞后整合進植物基因組中并得以表達，從而導致了冠癭瘤的發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，整合到植物基因組中的T-DNA可以通過減數(shù)分裂穩(wěn)定地傳給植物的后代，Ti質(zhì)粒的上述特性成為農(nóng)桿菌介導法植物遺傳轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)。第四十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日Ti質(zhì)粒為根癌農(nóng)桿菌核外的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，長約200Kb