銀杏葉提取物檢測(cè)

中文摘要-.z.第一章引言1第一章引言術(shù)語(yǔ)和定義：總黃酮醇苷：包括槲皮素(Quercetin)、山奈素(Kaempferel)、異鼠李素(Isorhamnetin)的糖苷類。銀杏葉提取物(EGB)因其具有抗氧化，拮抗血小板活化因子，改善血液流變學(xué)特性等藥理活動(dòng)，因而引起了廣闊研究者的興趣，不管是衡量提取工藝的優(yōu)劣和控制EGB的質(zhì)量，還是為后續(xù)藥理藥效的實(shí)驗(yàn)研究提供可靠數(shù)據(jù)，一種能穩(wěn)定，可靠的定量分析其主要藥效物質(zhì)黃酮類化合物的方法是十分必要的。國(guó)內(nèi)主要以鋁鹽顯色然后比色的方法或直接進(jìn)展比色的方法測(cè)定黃酮含量，但因此法受酚類物質(zhì)干擾比擬大，準(zhǔn)確性和專屬性比擬差，只能做定性或半定量分析。樣品經(jīng)酸水解后，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定槲皮素，山奈素，異鼠李素3種苷元的含量，在乘以一定的因子換算成總黃酮醇苷的方法，因其準(zhǔn)確，快速等優(yōu)點(diǎn)一逐漸被廣泛承受，也是國(guó)際上公認(rèn)的分析銀杏葉總黃酮含量的方法。應(yīng)用范圍：本方法采用高效液相色譜法測(cè)定銀杏葉提取物中總黃酮醇苷的含量，本方法適用于銀杏葉經(jīng)加工制成的提取物[1]。1.1銀杏葉提取物簡(jiǎn)介[2][本品來(lái)源]本品為銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的枯燥葉提取物。[植物性狀]落葉喬木，可高達(dá)40m。樹(shù)干直立，樹(shù)皮灰白。枝有長(zhǎng)短兩種，葉在短枝上簇生，在長(zhǎng)枝上互生。葉片扇形，長(zhǎng)4-8cm，寬5-10cm，先端中間2淺裂，基部楔形，葉脈平行，叉形分歧；葉柄長(zhǎng)2.5-7cm?；ㄆ?-5月，果期7-10月。9-10月間采收，曬干。[植物分布]全國(guó)大局部地區(qū)有產(chǎn)，主產(chǎn)**、**、**、**、**、**、**等地。[產(chǎn)品性狀]銀杏葉提取物GinkgobilobaP.E為淺黃棕色可流動(dòng)性粉末，有本品固有的香氣，味苦。[產(chǎn)品含量]按枯燥品計(jì)，銀杏總黃酮含量≥24.0%。1.2銀杏葉提取物的成效[3][藥理作用]銀杏葉目前仍被中國(guó)醫(yī)藥用于治療記憶喪失，胃部疼痛，痢疾，高血壓、精神緊*和呼吸道問(wèn)題如哮喘，支氣管炎和循環(huán)不良及其引起的焦慮。銀杏的活性成分是萜烯局部，其中包括銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯。這些銀杏黃酮－糖甙成分具有強(qiáng)大的抗氧化與自由基能力。促進(jìn)循環(huán)銀杏葉提取物Ginkgo

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P.E.能同時(shí)促進(jìn)大腦和身體肢體的循環(huán)。銀杏葉提取物Ginkgo

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P.E.的一個(gè)主要保健功能就是抑制一種稱為血小板活化因子〔PAF〕的物質(zhì)，PAF是一種從細(xì)胞中釋放的介質(zhì)，其會(huì)導(dǎo)致血小板聚集〔堆積在一起〕。高含量的PAF會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，中樞神經(jīng)系統(tǒng)血流量降低，發(fā)炎，和支氣管收縮。與自由基非常相似，高PAF水平也會(huì)導(dǎo)致衰老。銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯可在缺血〔體內(nèi)組織缺少氧氣〕時(shí)期內(nèi)保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞不受損傷。該功能可能能對(duì)苦于中風(fēng)的患者有輔助治療的作用。除了抑制血小板粘著外，銀杏提取物調(diào)節(jié)血管*力和彈力。換句話說(shuō)，其可令血管循環(huán)更加有效率。該提升循環(huán)效率作用對(duì)循環(huán)系統(tǒng)中的大血管〔動(dòng)脈〕和較小血管〔毛細(xì)血管〕都有同樣作用?？寡趸饔勉y杏葉提取物Ginkgo

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P.E.可能在大腦，眼球視網(wǎng)膜和心血管系統(tǒng)中可發(fā)揮抗氧化特性。其在大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抗氧化作用可能有助于防止因年齡導(dǎo)致的大腦功能衰落。銀杏葉提取物在大腦中的抗氧化功能特別使人感興趣。大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別易受自由基攻擊。自由基導(dǎo)致大腦損傷被廣泛認(rèn)為是導(dǎo)致伴隨衰老而來(lái)的多種疾病的影響因素，其中甚至包括阿茲海默癥?？顾ダ瞎δ茔y杏葉提取物Ginkgo

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P.E.提升大腦血流量并對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有極好的滋補(bǔ)作用。包含上萬(wàn)患者的數(shù)百次科學(xué)研究證實(shí)了銀杏葉提取物的成效對(duì)包括大腦血流缺乏和老年患者的智力衰退在內(nèi)的諸多問(wèn)題的效力。銀杏對(duì)許多衰老的可能病癥都有很好的效果，例如：焦慮和憂郁、記憶損傷、難以集中注意力，機(jī)敏度下降、智力下降、眩暈，頭痛,耳鳴〔耳中鳴響〕、視網(wǎng)膜黃斑部退化〔成人失明的最普遍原因〕、內(nèi)耳騷動(dòng)〔其會(huì)導(dǎo)致局部失聰〕、末端循環(huán)不良、陰莖血流不良導(dǎo)致的陽(yáng)痿。癡呆，阿茲海默癥和記憶力提升科學(xué)家回憶了所有已出版的對(duì)銀杏和輕微記憶損傷的高質(zhì)量研究，并得出結(jié)論：銀杏在提升記憶力和感知功能方面較撫慰劑明顯更加有效。銀杏在歐洲被廣泛用于治療癡呆。銀杏被認(rèn)為可有助于防止或治療這些腦部紊亂的原因是其可增加腦部血流量及其抗氧化功能。盡管許多臨床試驗(yàn)有科學(xué)上的缺陷，銀杏可能增加阿茲海默癥患者思考能力，學(xué)習(xí)能力和記憶力的證據(jù)仍被抱以很大期望。-.z.第一章引言3月經(jīng)前不快病癥一次評(píng)價(jià)銀杏葉提取物Ginkgo

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P.E.對(duì)有月經(jīng)前不快病癥婦女益處的雙盲受控?fù)嵛縿┭芯?，該試?yàn)包括143名年齡在18-45歲的婦女，并跟蹤她們兩個(gè)月經(jīng)周期。在第一個(gè)周期的第16天每個(gè)婦女都收到銀杏葉提取物Ginkgo

biloba

P.E.〔每天兩次，每次80mg〕或撫慰劑，治療持續(xù)至下一周期的第5天，并在該周期的第16天重新開(kāi)場(chǎng)。結(jié)果令人印象深刻。和撫慰劑比擬，銀杏明顯地減輕月經(jīng)前不快病癥的主要征候，特別是乳房疼痛和情緒不穩(wěn)。性功能不良盡管目前沒(méi)有關(guān)于此功能的雙盲試驗(yàn)根據(jù)，但病例報(bào)告和開(kāi)放研究提出銀杏能使因撲洛扎克類藥物及其它抗抑郁藥物而來(lái)的性功能不良好轉(zhuǎn)。1.2.7眼部問(wèn)題銀杏中的類黃酮也許能停頓或緩解*些視網(wǎng)膜病變。視網(wǎng)膜受損有許多可能原因，包括糖尿病和視黃斑病變。視黃斑病變〔一般稱為老年黃斑病變或ARMD〕是漸進(jìn)的退化性眼部疾病，并易發(fā)生于老年人身上。其是美國(guó)導(dǎo)致失明的主要原因。研究提出銀杏也許有助于保持ARMD患者的視力。劑量：主流意見(jiàn)認(rèn)為用于治療包括眩暈、耳鳴和間歇性跛行在內(nèi)的末端微循環(huán)問(wèn)題時(shí)，每天120-160ml的劑量十分適合。治療癡呆癥，輕微憂郁和提升認(rèn)知能力，可使用更高的劑量〔大約240mg/天〕。為取得最正確效果，每日服用量一般被分為2-3次服用。確認(rèn)使用提取物的標(biāo)準(zhǔn)為含有至少24％的銀杏黃酮糖苷和6％的萜烯內(nèi)酯－因?yàn)檫@是提取物在每次臨床試驗(yàn)中提取物顯示實(shí)質(zhì)成效的等。-.z.第二章實(shí)驗(yàn)材料4第二章實(shí)驗(yàn)材料2.1實(shí)驗(yàn)儀器和試劑及試藥：儀器：安捷倫化學(xué)工作站；超聲波清洗儀〔功率250W，頻率20KHz〕；電子天平〔感量為十萬(wàn)分之一〕；十八烷基硅烷鍵合硅膠柱試劑：甲醇〔色譜純〕；水〔二次蒸餾水〕；0.4％磷酸水溶液：取4.00ml磷酸〔分析純〕加水稀釋成1000ml，搖勻即得；25%鹽酸：取69.4ml鹽酸加水稀釋成100ml，搖勻即得試藥：槲皮素對(duì)照品〔含量測(cè)定用，批號(hào)：100081-200406，97.3%中國(guó)藥品生物制品檢定所提供〕；山奈素對(duì)照品〔批號(hào)：110861-202108，95.9%中國(guó)藥品生物制品檢定所提供〕；異鼠李對(duì)照品〔批號(hào)：110860-200608，置五氧化二磷減壓枯燥12小時(shí)后使用，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供〕2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.4%磷酸溶液〔50：50〕為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500[4]。-.z.第三章實(shí)驗(yàn)操作5第三章實(shí)驗(yàn)操作3.1方法原理：方法原理：本品加甲醇-25%鹽酸溶液〔4：1〕加熱回流，冷卻，用甲醇稀釋，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液進(jìn)入高效液相色譜儀進(jìn)展色譜別離，用紫外吸收檢測(cè)器，于波長(zhǎng)360nm處檢測(cè)槲皮素的吸收值，計(jì)算出其含量。3.2對(duì)照品制備：分別精細(xì)稱取槲皮素對(duì)照品、山奈素對(duì)照品、異鼠李素對(duì)照品，加甲醇制成每1mL分別含30ug、30ug、20ug的混合溶液；或精細(xì)稱取已標(biāo)示槲皮素、山奈素、異鼠李素含量的銀杏葉對(duì)照提取物35mg，照供試品溶液的制備方法，同法制成對(duì)照提取物溶液[5]。3.3供試品制備：取本品約35mg，精細(xì)稱定，加甲醇-25%鹽酸溶液〔4：1〕的混合溶液25mL，置水浴中加熱回流30分鐘，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液[5]。3.4測(cè)定法：分別精細(xì)吸取對(duì)照品溶液〔或?qū)φ仗崛∥锶芤骸澈凸┰嚻啡芤焊?0uL，注入高效液相色譜儀，用紫外吸收檢測(cè)器于波長(zhǎng)360nm處測(cè)定槲皮素、山奈素和異鼠李素的峰面積，計(jì)算出其含量[5]?？傸S酮醇苷=〔槲皮素+山奈素+異鼠李素〕×2.51〔本品按枯燥品計(jì)算含黃酮醇苷不得少于24.0%〕3.4.1儀器精細(xì)度試驗(yàn)精細(xì)吸取提取物對(duì)照品溶液10μl，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣4次，測(cè)定槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積，結(jié)果見(jiàn)下表。表3-1精細(xì)度試驗(yàn)〔槲皮素峰面積〕序號(hào)1234平均值RSD(%)峰面積2672.92652.82672.82682.22670.10.47表3-1精細(xì)度試驗(yàn)〔山奈素峰面積〕序號(hào)1234平均值RSD(%)峰面積2646.72655.52693.62690.62671.60.89表3-3精細(xì)度試驗(yàn)〔異鼠李素峰面積〕序號(hào)1234平均值RSD(%)峰面積1391.51390.51414.91425.41405.51.24結(jié)果對(duì)照品的槲皮素峰面積的RSD=0.56%，小于2.0%，山奈素峰面積的RSD=0.89%小于2.0%，異鼠李素峰面積RSD=1.24%小于2.0%，說(shuō)明儀器精細(xì)度良好。3.4.2供試品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)取銀杏葉提取物〔批號(hào)：N111212,廠家：**恒凱銀杏制品**〕，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別在0h、2h、4h、6h、依法測(cè)定槲皮素、山奈素、異鼠李素峰面積，結(jié)果見(jiàn)下表。表3-4穩(wěn)定性試驗(yàn)〔槲皮素峰面積〕序號(hào)1234平均值RSD(%)峰面積3318.63319.13316.83326.73320.30.14-.z.7表3-5穩(wěn)定性試驗(yàn)〔山奈素峰面積〕序號(hào)1234平均值RSD(%)峰面積3065.33069.13045.93109.63072.40.88表3-6穩(wěn)定性試驗(yàn)〔異鼠李素峰面積〕序號(hào)1234平均值RSD(%)峰面積689.8688.7685.9691.2688.90.33結(jié)果槲皮素峰面積的RSD=0.14%，小于2.0%，山奈素峰面積的RSD=0.88%，小于2.0%，異鼠李素峰面積的RSD=0.33%，小于2.0%，說(shuō)明供試品溶液在6小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次樣品〔批號(hào)：N111212〕4份，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)下表。表3-7重復(fù)性測(cè)定結(jié)果序號(hào)1234平均值RSD(%)取樣量mg35.9135.1431.8632.4926.31.22槲峰面積3318.83326.62839.02852.1濃度〔槲〕1.8121.8161.5481.577山峰面積3067.22968.82603.22638.8濃度〔山〕1.6161.5641.3711.390異峰面積689.2622.0711.2723.0濃度(異)0.3800.3430.3920.399含量〔%〕26.6126.5926.0926.01結(jié)果含總黃酮醇苷的平均含量為26.3%，RSD=1.22%，試驗(yàn)說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。3.4.4樣品的含量測(cè)定取對(duì)照品、銀杏葉提取物〔批號(hào)：N111212〕、兩份，按"對(duì)照品溶液制備、供試品溶液制備，〞方法制備對(duì)照品、供試品溶液，分別精細(xì)吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，〔采用體積外標(biāo)法，F(xiàn)=M對(duì)×N對(duì)×W∕A對(duì)〕結(jié)果見(jiàn)下表，圖譜見(jiàn)附錄。表3-8對(duì)照品測(cè)定結(jié)果稱樣量mg峰面積平均面積校正因子〔×10-5〕平均〔×10-5〕RSD(%)槲皮素15.422743.72744.551.09331.091850.132745.4槲皮素15.322736.82733.601.09062730.4山奈素15.192760.92760.61.05331.05400.132760.3山奈素15.112752.42753.051.05262753.7異鼠李素9.221667.91667.151.10601.104350.161666.4異鼠李素9.161663.21661.351.10271659.5-.z.第三章實(shí)驗(yàn)操作9表3-9樣品含量測(cè)定結(jié)果樣品號(hào)稱樣量mg峰面積平均面積濃度含量〔%〕平均〔%〕RSD(%)135.91槲皮素3318.63318.851.18226.6226.60.043319.1山奈素3065.33067.21.6163069.1異鼠李素689.8689.250.380688.7235.14槲皮素3326.93326.651.81626.603326.4山奈素2970.92968.851.5642966.8異鼠李素623.1622.000.343620.9由以上測(cè)定結(jié)果可知總黃酮醇苷的含量為26.6%，水分為1.2%，所以本品按枯燥品計(jì)算為26.9%，符合2021版中國(guó)藥典檢查之規(guī)定。-.z.第四章黃銅醇苷質(zhì)量控制方法評(píng)述10第四章黃酮醇苷質(zhì)量控制方法評(píng)述銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木植物,是最古老的中生代侏羅紀(jì)孑遺植物之一,素有裸子植物"活化石〞之稱,屬我國(guó)特產(chǎn)植物。自20世紀(jì)60年代聯(lián)邦德國(guó)開(kāi)發(fā)出銀杏葉制劑Tebonin以來(lái),從70年代開(kāi)場(chǎng)銀杏葉制劑的產(chǎn)品在歐洲至今一直盛銷不衰。80年代起由于發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯是血小板活化因子(PAF)的特效拮抗劑,而PAF是引起哮喘等許多疾病的重要因素,進(jìn)而推動(dòng)了對(duì)銀杏的更進(jìn)一步深入研究,同時(shí)也興起了全球范圍內(nèi)的"銀杏熱"。銀杏葉的主要活性成分是黃酮苷類及萜內(nèi)酯類。其中黃酮類主要來(lái)源于銀杏葉,含量較高,約為2.5%～5.9%,包括黃酮、黃酮醇及其苷、雙黃酮、兒茶素等幾大類化合物。目前從銀杏中鑒定出的黃酮類化合物達(dá)44種［6］,其中雙黃酮6種,其極性低,在銀杏提取物中含量<01％,至今未發(fā)現(xiàn)其生物活性;黃酮苷元7種,極性低,在銀杏提取物中含量<0.1%；黃酮糖苷20種,該成分極性較大,在EGb中含量>20%,能消除氧自由基,具有擴(kuò)*血管、增加血流量、改善腦動(dòng)脈和末梢血流作,但這類化合物廣泛存在于其他植物中,似乎不是銀杏葉獨(dú)特療效的關(guān)鍵成分;桂皮酰衍生物有5種,據(jù)報(bào)道其中有2種成分對(duì)心血管系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用［7］,另外有兒茶素4種及原花青素和原翠雀素。本文將對(duì)銀杏提取物及其制劑中黃酮苷類的含量測(cè)定方法作一介紹評(píng)述。4.1滴定法［8］以鉑電極作指示電極,鎢電極作參比電極,在含KBr的鹽酸介質(zhì)中,以KBrO3標(biāo)準(zhǔn)液為滴定劑,根據(jù)示波器熒光屏上熒光點(diǎn)的最大位移來(lái)指示滴定終點(diǎn),由所消耗的KBrO3的量計(jì)算出EGB中總黃酮的含量(以蘆丁計(jì))。結(jié)果說(shuō)明本法與紫外分光光度法比擬結(jié)果無(wú)顯著性差異(99%置信度)。且與紫外分發(fā)光度法相比,具有儀器簡(jiǎn)單,操作方便,測(cè)定快速淮確等特點(diǎn),且可防止色素和其它雜質(zhì)的干擾。但需要注意的是底液鹽酸的酸度,支持電解質(zhì)KBr的用量以及滴定速度。4.2紫外分光光度法(UV法)用紫外分光光度法測(cè)定銀杏葉提取物及其制劑中黃酮苷類,其中又可分為：4.2.1絡(luò)合―分光光度法［9］本法采用硝酸鋁-亞硝酸鈉為顯色劑,生成鋁螯合物在510nm處測(cè)定,以蘆丁為對(duì)照品。雙波長(zhǎng)紫外分光光度法［10］方法是取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,配制含蘆丁的甲醇標(biāo)準(zhǔn)液,在268nm和285nm測(cè)定吸收度差ΔA(ΔA＝A268-A285),繪制濃度C(mg/L)與ΔA的關(guān)系曲線,用最小二乘法求回歸方程,同時(shí)使蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在一定范圍內(nèi)與ΔA呈線性相關(guān)。分光光度法被一些藥典所采用,但不專屬,只能大約估計(jì)總的類黃酮不可能細(xì)致地定性、定量測(cè)定苷元,特別是銀杏葉中因含有大量花色青素、葉綠素、鞣酸和其他酚性成分對(duì)測(cè)定干擾很大,因而測(cè)定結(jié)果偏高,重復(fù)性差,準(zhǔn)確度低但本法要求簡(jiǎn)單,操作方便,對(duì)基層鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)等不具備HPLC測(cè)定條件的單位,比色法仍是一種簡(jiǎn)易可行的測(cè)定方法,亦可用于企業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)中初步質(zhì)量控制。4.3薄層掃描法［1］(TLC掃描法)利用雙波長(zhǎng)掃描儀對(duì)銀杏黃酮醇苷的3種水解苷元槲皮素、異鼠李素、山柰酚進(jìn)展掃描測(cè)定,以黃酮醇苷的平均分子量與各苷元分子量的比值作轉(zhuǎn)化因子,計(jì)算總黃酮醇苷的含量。該法由于需要薄層掃描儀,儀器價(jià)格較貴,與HPLC方法比擬無(wú)明顯優(yōu)勢(shì),因而研究及報(bào)道均較少。4.4高效液相色譜法(HPLC法)70年代后期,HPLC法取代了分光光度法,廣泛用于銀杏提取物及其制劑中黃酮苷類的分析,目前關(guān)于HPLC法測(cè)定銀杏黃酮苷類國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道很多,主要差異有：①按進(jìn)樣方式可分為樣品直接進(jìn)樣法測(cè)定、直接進(jìn)樣后多元梯度淋洗進(jìn)展指紋分析法［12-13］和樣品經(jīng)酸水解后,梯度洗脫分析測(cè)定主要水解苷元的含量。前一種方法主要用于控制制劑的質(zhì)量和鑒別制劑的優(yōu)劣,后一種方法主要適用于植物藥的穩(wěn)定性和質(zhì)量控制分析。②按對(duì)樣品的前處理所采用的水解方式有鹽酸水解法［14］和硫酸水解法［15］,鹽酸和硫酸的濃度通常分別為25%、4%水解的時(shí)間為30min［2］、60min［14］、2h［17］、3h[15]不等。③按使用對(duì)照品的不同有單用蘆?。?8］、槲皮素［19］,也有用槲皮素＋山柰素＋異鼠李素［20］,由于各樣品中槲皮素、山柰素和異鼠李素之間的比例隨著工藝的不同,甚至不同銀杏葉原料也有變化,多個(gè)對(duì)照品加在一起較單用槲皮素一個(gè)對(duì)照品準(zhǔn)確可靠。④按測(cè)定波長(zhǎng)有300、340、350、354、360、365、370、375nm等［21］。⑤按根據(jù)文獻(xiàn)［22］總黃酮的換算系數(shù)即以3O｛2O［6O(p羥基反式桂皮?；?βD葡萄糖基］αL鼠李糖基｝槲皮素的分子量756.7分別除以槲皮素苷元、山柰素苷元和異鼠李素苷元,得到換算系數(shù)分別為2.51、2.64、2.39,或取平均值2.51為換算系數(shù),測(cè)得苷元的總面積之后乘以2.51即得總黃酮苷的含量。計(jì)算公式有:①(Q+K+I)×2.51［22］;-.z.12②2.23Q+2.63K+2.38I［23］;③2.51Q+2.64K+2.39I［22］;④2.504Q+2588K+2.437I［24-25］;⑤2.34Q+2.60K+2.30I［26］等。采用HPLC法測(cè)定銀杏提取物及其制劑中銀杏黃酮苷類的含量,從方法學(xué)本身來(lái)說(shuō),技術(shù)已經(jīng)成熟,靈敏度、重現(xiàn)性均很好。對(duì)于像EGb761那樣的標(biāo)準(zhǔn)制劑,由于經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的藥效學(xué)和毒理學(xué)試驗(yàn),且在臨床上應(yīng)用多年,在銀杏葉中有效成分不完全清楚的情況下,作為經(jīng)歷性的定量方法是不同的。但黃酮苷是中草藥中的一般成分,能在多大程度代表銀杏的治療作用,一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索的課題。由于不能直接測(cè)定苷的含量,而是通過(guò)以對(duì)羥基桂皮酰衍生物除以槲皮素、山萘素、異鼠李素三種苷元得出換算系數(shù),來(lái)計(jì)算總黃酮苷的量,而本身對(duì)羥基桂皮酰衍生物它們的總含量在銀杏總黃酮苷中并不高,因而利用換算系數(shù)來(lái)計(jì)算總黃酮的含量顯然是不合理的。EGb761等標(biāo)準(zhǔn)制劑本身是不含雙黃酮或黃酮苷元的(低于01%),但如果在銀杏提取物中有人人為地添加如槲皮素等黃酮苷元,則測(cè)得的銀杏總黃酮含量結(jié)果明顯增高,外表上看來(lái)似乎符合質(zhì)量要求,但實(shí)際上影響銀杏提取物的內(nèi)在質(zhì)量。銀杏總黃酮的HPLC測(cè)定方法有許多,但由于進(jìn)樣方式、水解方法、測(cè)定波長(zhǎng)、對(duì)照品的選擇、計(jì)算方式不同測(cè)定的結(jié)果也就有差異,從目前收集到的四十余份關(guān)于銀杏黃酮含量測(cè)定方法報(bào)道來(lái)看似乎以采用鹽酸水解,對(duì)照品采用槲皮素、山萘素、異鼠李素三種的混合液,在370nm處測(cè)定,總黃酮含量的計(jì)算,以3種苷元含量之和乘以平均換算系數(shù)2.51報(bào)道最多。但總而言之國(guó)內(nèi)外尚無(wú)完全統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法,隨著近年來(lái)對(duì)銀杏的進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn),銀杏內(nèi)酯似乎才是銀杏葉中起關(guān)鍵作用的成分,因而今后黃酮作為主要質(zhì)量指標(biāo)的地位將會(huì)下降。4.5超臨界CO2萃取色譜法(SFC色譜法)［3］該法主要是利用超臨界CO2萃取技術(shù)的高效別離特點(diǎn),先將樣品中各種黃酮類化合物別離,然后用各種色譜分析儀器檢測(cè)出來(lái)。采用超臨界流體色譜法別離測(cè)定銀杏葉提取物水解后的三個(gè)苷元一槲皮素、山萘酚、異鼠李素的含量，以苯基柱為固定相，二氧化碳乙醇磷酸(90∶9.98∶0.02)為流動(dòng)相,三個(gè)苷元獲得良好別離，并計(jì)算了總黃酮含量,證明本法定量結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。該法是目前比擬先進(jìn)的測(cè)定方法,但需要超臨界萃取設(shè)備,所需費(fèi)用較高,儀器設(shè)備目前無(wú)法普及,且超臨界萃取技術(shù)用于中草藥中成分的提取、別離尚處于探索過(guò)程。4.6膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法(MECC法)［28］它是利用流動(dòng)相中參加離子型洗滌劑,形成膠束體系的快速新方法。這種方法較HPLC法靈敏度高,進(jìn)樣量小,別離速度更快,且能得到清晰的基線別離。4.7高速逆流色譜法(HSCCC法)［29］高速逆流色譜法是一種高效快速的無(wú)載體液-液分配層析新技術(shù),它消除了載體的不可逆吸附,其別離不是淋洗層析載體過(guò)程,超載制備能力大,且別離純化同步完成,溶劑耗量小,既可用于含量測(cè)定,又可用于中草藥化學(xué)對(duì)照品的制備。蔡定**用GS10A型HSCCC色譜系統(tǒng)及其別離試驗(yàn)程序,用HSCCC法從銀杏葉浸膏酸水解物30mg/mL的樣品中別離得到異鼠李素、山萘酚、槲皮素,經(jīng)HPLC分析,純度到達(dá)98%以上,符合化學(xué)對(duì)照品的要求。4.8熱噴霧HPLCMS法［30-31］GobbatoS等將熱噴霧接口與HPLC與MS聯(lián)用,進(jìn)展雙黃酮?jiǎng)e離鑒定,既可克制紫外吸收檢測(cè)沒(méi)有選擇性的缺陷,又可防止二極管陣列檢測(cè)器對(duì)構(gòu)造類似的雙黃酮分辨不清的困難。采用外標(biāo)法對(duì)提純后的銀杏雙黃酮定量,色譜峰形對(duì)稱、無(wú)拖尾、重現(xiàn)性好;該法簡(jiǎn)單可靠,可適用于雙黃酮的定性定量分析。熱噴霧HPLCMS法可廣泛用于植物成分的在線鑒定及定量。但目前國(guó)內(nèi)報(bào)道卻很少,主要是儀器價(jià)格昂貴,不便于推廣。-.z.討論14討論取對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液分別進(jìn)展紫外掃描，在200

～

300

nm兩者均有較強(qiáng)吸收，在300～400nm陰性對(duì)照溶液吸收較小，應(yīng)選擇在360nm作為槲皮素、山柰素、異鼠李素的測(cè)定波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇了甲醇和水，甲醇、0.4%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，并對(duì)流動(dòng)相組成比例進(jìn)展了選擇，結(jié)果說(shuō)明以"2.2〞項(xiàng)下系統(tǒng)較佳，各色譜峰別離度良好，峰型鋒利，保存時(shí)間適中。供試品的制備采用鹽酸水解30min，對(duì)照品溶液采用槲皮素、山奈素、異鼠李素混合溶液，總黃酮醇苷含量的計(jì)算采用3種苷元含量之和乘以平均換算系數(shù)2.51。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，采用上述HPLC法對(duì)復(fù)方銀杏葉片中主要活性成分槲皮素、山奈素、異鼠李素等黃酮化合物的含量進(jìn)展測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，精細(xì)度、重復(fù)性良好，處方中其它組分對(duì)銀杏葉總黃酮測(cè)定無(wú)干擾，方法專屬性較強(qiáng)，可用于復(fù)方銀杏葉片的質(zhì)量控制。-.z.參考文獻(xiàn)15參考文獻(xiàn)[1]俞曼雷，謝德隆，胡馨等.高效液相色譜法測(cè)定銀杏葉制劑中黃酮苷含量［J］.中藥新藥與臨床藥理,1998,9(1):46.[2]陳仲良.銀杏提取物的化學(xué)成分和質(zhì)量［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志,1996,31(6):328[3]潘洪平．銀杏葉制劑藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30〔2〕：93.[4]莊向平，虞杏英，楊更生等.銀杏葉中黃酮含量的測(cè)定和提取方法［J］.中藥，1992，23(3):122.[5]國(guó)家藥典委員會(huì)．中國(guó)藥典，2021版Ⅰ部［S］.：化學(xué)工業(yè)，2021：392[6]錢(qián)天秀，楊世林，*麗珍等.銀杏研究現(xiàn)況［J］.國(guó)外醫(yī)藥植物藥冊(cè)1997,12(4):157.[7]KlossP，JaggyH，VerfahrenzurgewinnungeinesvasoaktivenarzneimittelausdenblattenvonginkgobilobaandArzneiparapate［J］.DE,2117429.1972.[8]楊天鳴，陸儉潔，*士筠等.示波滴定法測(cè)定銀杏葉提取物中總黃酮的含量［J］.中草藥，1998，29(增刊):54.[9]王建華，衣海青，雙波長(zhǎng)紫外分光光度法測(cè)定銀杏葉制品中黃酮類化合物含量[J].中草[10]李吉來(lái)，于留榮，曾宇珠.薄層掃描法測(cè)定銀杏葉中總黃酮醇苷的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，1996,21(2):106.[11]WagnerH,BladtSHartmannU,etal.GinkgobilobaDCTLCandHPLCanalysevonginkgoe*traktenandginkgotrakteenthaltendenphytopraparaten［J］.DtschApothZtg,1989,129:2421.[12]HaslerA,Sticher,MeierB.Highperformanceliquidchromatographicgetermiantionofgivewidespreadflavonoidaglycones［J］.JChromatogr,1990,508:236.[13]錢(qián)之玉，傅建，胡梅.銀杏黃酮的HPLC法測(cè)定及其探討［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1996,27(2):253.[14]陶巧鳳，黃宗玉，范秀林.高效液相色譜法測(cè)定銀杏葉制劑中黃酮含量［J］.中成藥,1993,15(12):14.[15]俞曼雷，謝德隆，胡馨等.高效液相色譜法測(cè)定銀杏葉制劑中黃酮苷含量［J］.中藥新藥與臨床藥理,1998,9(1):46.[16]*曉琦，陳穎怡.高效液相色譜法測(cè)定銀杏葉提取物中槲皮素的含量［J］.色譜,1994,12(4):302.[17]*松青，唐先哲，馬文秀.高效液相色譜法測(cè)定銀杏葉制品中總黃酮［J］.中草藥,1995,26(9):461.[18]謝大年，郭兆貴.銀杏葉提取物中黃酮類成分的高效液相色譜分析［J］.色譜,1994,12(5):384.[19]王新宏，王智華，范廣平等.HPLC法測(cè)定銀杏制劑成分［J］.中藥,1996,18(9):36.[20]HaslerA,Sticher,MeierB.Identificatioonanddeterminationoftheflavonoidsfromginkgobilobabyhighperformanceliquidchromatography［J］.JChromatogr,1992,605:41[21]**省標(biāo)準(zhǔn)［S］.蘇衛(wèi)藥準(zhǔn)字(92)28063號(hào)[22]**省標(biāo)準(zhǔn)［S］.1978年[23]**省標(biāo)準(zhǔn)［J］.粵Q/WS252794[24]曾建國(guó)，杜方麓.銀杏葉及其提取物中黃酮苷測(cè)定法再探［J］.中草藥,1997,28(3):61.[2