淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)課件

淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)

前言分子定向進(jìn)化又稱(chēng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化或進(jìn)化生物技術(shù)，它在體外模擬自然進(jìn)化機(jī)制，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展。近年來(lái)，分子定向進(jìn)化技術(shù)研究和應(yīng)用的領(lǐng)域逐漸擴(kuò)大，涉及基因治療、醫(yī)學(xué)診斷、食品和化學(xué)工業(yè)等各方面。隨著各種新型突變技術(shù)和新型檢測(cè)系統(tǒng)的出現(xiàn)，分子定向進(jìn)化技術(shù)研究將向縱深發(fā)展。一.分子定向進(jìn)化技術(shù)1.分子定向進(jìn)化技術(shù)的定義分子定向進(jìn)化(moleculardirectedevolution)是在分子水平研究所需生物的特定基因或蛋白質(zhì)，可以在試管里進(jìn)行無(wú)性繁殖或有性繁殖，其實(shí)質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用，是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進(jìn)化機(jī)制，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展。二.分子定向進(jìn)化的選擇策略1.致錯(cuò)PCR(error—pronePCR，epPCR)技術(shù)是指在利用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變。2..盒式突變(cassettemutagenesis)技術(shù)即寡核苷酸介導(dǎo)的誘變技術(shù)，是用一段人工合成具有突變序列的DNA片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。3.DNA改組(DNAshuffling)技術(shù)，又稱(chēng)有性PCR(sexualPCR)或分子育種(molecularbreeding)，即DNA分子的體外重組。通過(guò)DNAshufling技術(shù)，既可對(duì)單基因或DNA片段進(jìn)行改組，也可對(duì)基因組或染色體等進(jìn)行改組。4.高通量篩選技術(shù)(High-ThroughputScreening，HTS)表面展示技術(shù)是篩選蛋白質(zhì)突變體庫(kù)的高通量篩選方法，特別在抗體的研究當(dāng)中應(yīng)用非常普遍，具有高效、高靈敏度等特點(diǎn)。目前，表面展示技術(shù)有：噬菌體表面展示技術(shù)，細(xì)菌表面展示技術(shù)，酵母表面展示技術(shù)，酵母雙雜交系統(tǒng)，核糖體展示技術(shù)．蛋白質(zhì)片斷互補(bǔ)試驗(yàn).（2）.細(xì)菌細(xì)胞表面展示技術(shù)(BacterialCellSurfaceDisplay)結(jié)合熒光激活細(xì)胞篩選儀(Fluo．rescenceActivatedCellSorting，F(xiàn)ACS)或流式細(xì)胞篩選儀(flowcytometry)是非常有效的高通量篩選方法.該技術(shù)是目前惟一能夠定量檢測(cè)單細(xì)胞水平和大量突變體酶催化活性的方法。它能夠決定突變體庫(kù)中每個(gè)克隆的功能特性。三.分子定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用1.在治理環(huán)境生物污染方面的應(yīng)用有機(jī)磷的降解，Cho等通過(guò)兩輪的DNA改組和篩選，分離得到可提高降解甲基對(duì)硫磷的突變體，其中典型的突變體為22A11，水解甲基對(duì)硫磷的能力較野生型提高了25倍。諸如此類(lèi)還有對(duì)三氯丙烷、三氯乙烯、五氯苯酚的降解.2.分子定向技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用農(nóng)業(yè)飼料酶制劑中的應(yīng)用：通過(guò)易錯(cuò)PCR和DNA改組技術(shù)，獲得高比活和低pH淀粉酶；堿耐受性和在堿性條件下高活性的纖維素酶；耐高溫的纖維素酶；水解二糖的能力較野生型高31％葡聚糖內(nèi)切酶；溫度耐受性超過(guò)90℃，最適pH為酸性的木聚糖酶。四.展望伴隨著分子生物學(xué)新理論和新技術(shù)的發(fā)展，分子