質譜技術在微生物鑒定和生物醫(yī)學中的應用

AssuranceConfidencePerformanceResonance島津（梅里埃）MALDITOF產品系列

LinearonlyMALDI-TOF

Linearand reflectronMALDI-TOFPSDcapability

Linearand reflectronMALDI-TOF/TOFPSD&CID capability

Unique instrumentMALDI-iontrap-TOFreflectrononlyMSncapabilityHighresolutionand highmassaccuracy當前1頁，總共57頁。布魯克各類現(xiàn)代生物質譜：離子阱MALDITOF/TOFESI-Q-TOFFTMS當前2頁，總共57頁。質譜儀的工作原理

質譜儀是利用電磁學原理，使帶電的樣品離子按質荷比進行分離的裝置。離子電離后經加速進入磁場中，其動能與加速電壓及電荷z有關，即m/z=2U/v2

其中z為離子的電荷，U為加速電壓，m為離子的質量，v為離子初加速后的運動速度。具有速度v的帶電粒子進入質譜分析器的電磁場中，根據所選擇的分離方式，最終各種離子按質荷比（m/z）的不同實現(xiàn)分離。當前3頁，總共57頁。電離源質譜儀中產生離子的裝置稱為離子源(ionsource)。電離源的功能是將進樣系統(tǒng)引入的氣態(tài)樣品分子轉化成離子。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對于不同的分子應選擇不同的離解方法。通常稱能給樣品較大能量的電離方法為硬電離方法，而給樣品較小能量的電離方法為軟電離方法。

質譜技術中的幾種離子源基質輔助激光解吸離子化

(MatrixAssistedLaserDesorptionIonization，MALDI)2.電噴霧離子化(Electrosprayionization，ESI)當前4頁，總共57頁。SampletargetIonopticsLineardetectorLaserMALDI-TOFMALDI:線性工作原理Mixmatrix&sampleontargetFirelaseratmatrix/sampleIonizesample(solidtogasphase)Accelerate/extractionsSeparateionsinanalyzerRecordspectrumatdetectorTimeofflight(TOF)massanalyzer(fieldfree)02040608010010000200003000040000m/z+vemode[M+H]+ions當前5頁，總共57頁。MALDI基質輔助激光解析附原理:

Streptococcuspneumoniae:masssignalsmatchingtoribosomalproteins(consideringpossiblemethioninecleavageand/ormethylation)aremarkedinred~50%ofpeaksunambiguouslyrepresentribosomalproteinsproteinmassesobtainedfromtheSwiss-Prot/TrEMBLsequencedatabase當前6頁，總共57頁。質譜儀的基本結構一、真空系統(tǒng)質譜儀的離子產生及經過系統(tǒng)必須處于高真空狀態(tài)(離子源真空度應達1.3×10-4-3×10-5pa，質量分析器中應達1.3×10-6pa)。若真空度過低，則會造成離子源燈絲損壞、本底增高、副反應過多，從而使圖譜復雜化、干擾離子源的調節(jié)、加速極放電等問題。一般質譜儀都采用機械泵預抽真空后，再用高效率擴散泵連續(xù)地運行以保持真空。圖5.1質譜儀的構成當前7頁，總共57頁。微生物鑒定方法感官視覺,嗅覺,味覺免疫單或多克隆抗體分子PCR……生化代謝能力和耐抗生素耗時氣質法（GC-MS）脂肪酸，小分子糖MALDI-TOFMS當前8頁，總共57頁。17/03/20239微生物鑒定新方法（MALDITOF）比現(xiàn)有方法鑒定更多生物多樣性的病原體分析時間僅1-2minutes當前9頁，總共57頁?，F(xiàn)代微生物分類學:蛋白組學&基因組學

ProteinBacterialCellDNAGenomeProteomeDNAFingerprintMassFingerprintSpeciesDefinition&DeterminationMALDI-TOFMS當前10頁，總共57頁。1111

不同細菌代表性指紋圖譜不同

各菌種代表性峰型分布存在顯著差異，有助于鑒定各個菌種！當前11頁，總共57頁。1212腸桿菌（Enterobacteriaceae）MS圖譜示:

科,屬,種特異性峰值部分峰值是多數菌種共有的（如m/z4365:核糖體蛋白L36)峰值有

科,屬,種或

亞種-特異性種間特異性代表峰值用來區(qū)分不同菌種當前12頁，總共57頁。核糖體蛋白不受生長條件影響MassspectraofProteusmirabilisDSM4479atdifferentincubationtimesNomajorqualitativechangesinpeakpatternsdistinguishingfamily,genusandspeciesDecreaseofsignalintensityovertimePresenceandabsenceofpeaksIdentificationwith>99%confidence當前13頁，總共57頁。樣品SARAMIS工作流程轉移細胞到MALDI靶板導入數據至SARAMISLIMS鑒定/比較分析基質當前14頁，總共57頁。微生物鑒定流程生長在固體培養(yǎng)基上的菌落全細胞MALDI-TOF譜圖數據庫中參考譜圖輸出可信鑒定結果找到匹配度最可信的譜圖當前15頁，總共57頁。16鑒定結果界面樣品名稱鑒定結果置信度MS數據日期只需數秒，全自動添加新采集數據至鑒定結果界面！科屬種型數據數量不同顏色代表不同置信水平

深綠:99.9%

淺綠:90-99.9%黃色:85-90%

白色:70-85%低于70%不顯示置信值紅色:提醒復雜的結果匹配2種或以上菌種，置信度>99%:鑒定混合菌當前16頁，總共57頁。SARAMIS鑒定混合菌種AmassspectrumofamixedsamplecontainingPseudomonasaeruginosaandAchromobacterxylosoxidansShowspeaksspecific

tobothspecies300040005000600070008000900010000110001200013000Mass/Charge7291.64331.87319.65237.04973.76320.26692.27575.06618.34433.77097.78562.09086.06345.86045.05735.69402.710029.95209.06674.27487.87201.05014.67763.48880.73161.14700.96306.03787.23645.04543.14353.03344.55266.48745.86714.75676.09588.68403.99959.910123.29427.912565.810534.69215.88584.69724.211401.7當前17頁，總共57頁。

單核增生性李斯特菌Listeriamonocytogenes(Lm)

兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，自然界分布廣泛，是食源性李斯特?。ㄈ诵蠊不疾。┑闹虏≡?，低溫仍具有增殖能力對老年人，嬰兒，孕婦和免疫缺陷者的致死率是

20-30%該菌經常存在于速食食品中Ex.About2,500cases/yearinUSA食品安全

TokyoMarineUniversity,ProfKimuraandDr.TakahashiEatablewithoutheatedandcockedorcockedfood,ex.,ham,dailyproduct,salad,smokedfoodetc現(xiàn)有檢測方法需要2步驟和選擇培養(yǎng)基，耗時6天當前18頁，總共57頁。Yakult(養(yǎng)樂多)乳酸菌生產質量控制品種改良Performance+SARAMIS當前19頁，總共57頁。Classifiedasgenus=>species=>strain“Thickness”ofdatabaseisimportant.From2011Europeansocietyofclinicalmicrobiologyandinfectionsdisease菌種鑒定準確度當前20頁，總共57頁。17/03/202321SARAMIS：SpectralARchiveAndMicrobial

IdentificationSystem數據庫含有超級譜圖（SuperSpectra）和參考譜圖（ReferenceSpectra）使用者可以創(chuàng)建和儲存超級譜圖或參考譜圖軟件包可實現(xiàn)譜圖的存儲，分析和比較使用者可以做聚類分析，創(chuàng)建系統(tǒng)樹圖用于菌株分型當前21頁，總共57頁。SARAMIS菌種特異峰型合成譜圖包含所有在個體譜圖中出現(xiàn)頻率大于閥值的所有峰(如：在各譜圖中出現(xiàn)70%的)在超級譜圖中，所有峰值根據他們對所代表的菌種特異性而賦予權重值具有科、屬特異性的峰值權重低，這些峰值不支持菌種鑒定具有菌種特異性的峰值權重則會加重當前22頁，總共57頁。SARAMIS–比較工具300040005000600070008000900010000110001200013000m/z5263777496388176879299706009481767464086754583398962102194469678837715709788831426260ClusteranalysisofselectedreferenceandsamplemassspectraComparisontomassspectralpatternsofreferencespectrainthedatabase當前23頁，總共57頁。在SARAMIS數據庫中一個菌種的典型代表包含典型和非典型菌株（基于質譜圖譜，基因組學，表型數據）atypicalreferenceisolatesareover-representedinSARAMISphylogeneticdistancephylogeneticdistancefrequencyfrequency自然界菌種多樣性當前24頁，總共57頁。SARAMISSuperSpectraDatabase1.Unambiguousidentificationwith80+%confidenceLIMSSARAMISReferenceSpectraDatabase2.Identification<80%confidenceornoidentificationbySSp:ExaminationofsignificantmatchesandreleaseLIMS

SARAMIS與LIMS系統(tǒng)

當前25頁，總共57頁。CulturefromthestockingricelolCultureinvariousconditionsCollectisolatesfromourlabandotherfacilities(10)MeasureMSspectraandconstructDatabaseApplytouncertainty,whichreducestabilityofidentification

Differenceincolonyinasamemedia2 HWproducttolerance3system Operator12people Culturemediamaximum5kinds Culturelength24,48,72h Culturevender3vendersMax3,240spectra深度透視數據庫當前26頁，總共57頁。MicroIDsystemintrucductionVersion1.0SampleTransferofcellstoMALDItargetExportdatatoMicroIDLIMSIdentification/ComparisonAnalysisMatrix當前27頁，總共57頁。當前28頁，總共57頁。自動鑒定界面比對鑒定界面MicroID當前29頁，總共57頁。MALDI-TOFMS微生物鑒定優(yōu)勢一種對所有微生物都適用的方法無需預選測試與現(xiàn)代分類學結果一致高度配合有特殊需求使用者可擴展新菌種及其應用非常耐用且重復性高樣品準備過程非常簡化可進行高通量分析絕佳成本與效益比當前30頁，總共57頁。31AXIMAMALDI:線性&反射

不只是微生物鑒定當前31頁，總共57頁。MALDITOF全面解決方案當前32頁，總共57頁。布魯克各類現(xiàn)代生物質譜：離子阱MALDITOF/TOFESI-Q-TOFFTMS當前33頁，總共57頁。高分辨質譜儀全方位應用

天然產物分析 藥物研究 蛋白質組學 代謝組學 ............當前34頁，總共57頁。micrOTOFQDryGasHeaterOrthogonalAcceleratorGlassCapillaryCollisionGasSupplyHexapole電噴霧離子源去溶劑系統(tǒng)飛行管檢測器反射鏡離子聚焦系統(tǒng)四級桿Q碰撞池當前35頁，總共57頁。micrOTOFQDryGasHeaterOrthogonalAcceleratorGlassCapillaryCollisionGasSupplyHexapole電噴霧離子源去溶劑系統(tǒng)飛行管檢測器反射鏡離子聚焦系統(tǒng)離子漏斗式傳輸四級桿Q碰撞池當前36頁，總共57頁。布魯克公司獨家專利設計： 離子漏斗式傳輸系統(tǒng)離子流方向>>>離子傳輸率大大提高，從而提高靈敏度。增寬傳輸離子質量范圍

離子流方向>>>傳統(tǒng)的錐式離子傳輸當前37頁，總共57頁。micrOTOFQ適用范圍：電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質譜儀分子式測定和分子結構鑒定：如：化學合成產品，配位化合物，天然產物，代謝物，殘留農藥等大分子研究如：蛋白質/多肽，多糖，多聚物等復雜混合物分析當前38頁，總共57頁。精確質量(<3ppm)micrOTOFQ：獨特的三維信息MS/MS提供結構信息電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質譜儀SigmaFit?參數（同位素峰形匹配）當前39頁，總共57頁。精確質量(<3ppm)micrOTOFQ：獨特的三維信息MS/MS提供結構信息電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質譜儀SigmaFit?參數（同位素峰形匹配）當前40頁，總共57頁。

C254H383N65O75S6,5735.65

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Intens.

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模擬同位素分布峰形SigmaFit?參數——同位素峰形的匹配當前41頁，總共57頁。

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模擬同位素分布峰形實測同位素分布峰形SigmaFit?參數——同位素峰形的匹配SigmaFit參數=0SigmaFit參數>>0當前42頁，總共57頁。437.0425438.0372439.0397440.03690.00.40.81.2437.0427438.0376439.0400440.03590.00.40.81.2437.0396438.0351439.03750.00.40.81.2436.0398Experimental436.0400C12H22NO10S3436.0367C15H18NO10S2024602460246435436437438439440441442m/zsigma=0.0167sigma=0.0231Intensityx104ABC鑒定化合物的有效工具--SigmaFit

兩種可能元素組成的確定當前43頁，總共57頁。分子量>500Da未知物的元素組成預測？當前44頁，總共57頁。人參提取液

（稀釋倍數1:100;HPLC-microTOFQ）0510152025Time[min]02464x10Intens.BPC499.997-1299.991-AllMS1153.598181154.600531155.601441156.598420.000.250.500.751.001.251.504x10Intens.115411561158m/z當前45頁，總共57頁。當設置誤差范圍<5ppm時：171個可能的分子式GenerateMolecularFormula當前46頁，總共57頁。16個可能的分子式當設置誤差范圍<3ppm

時：GenerateMolecularFormula當前47頁，總共57頁。C55H93O25用SigmaTM參數比較同位素峰形匹配，選擇Sigma值最小的分子式，即該化合物的分子式為：GenerateMolecularFormula當前48頁，總共57頁。SigmaTM參數用于比較同位素峰形匹配1153.601141154.604561155.607421156.61021C55H93O25,1153.601153.595271154.598681155.601701156.60459C62H89O20,1153.5905001000150020002500Intens.050010001500200025001153115411551156115711581159m/zC55H93O25C62H89O20SigmaTM=0.0171SigmaTM=0.0540當前49頁，總共57頁。當前50頁，總共57頁。未知多肽測序測定

GluFib:MS/MSofm/z=785.8(+2)333.1898480.2559684.3445813.3868942.42871056.47041171.49911285.5426N+0.0006D+0.0017N-0.0012E-0.0007E-0