HPV基因分型檢測試劑盒常見問題

HPV基因分型檢測試劑盒常見問題第1頁/共59頁目錄試驗(yàn)開展實(shí)驗(yàn)室要求HPV臨床樣本的采集方法及注意事項(xiàng)臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題第2頁/共59頁HPV基因分型檢測試驗(yàn)項(xiàng)目

——試驗(yàn)開展實(shí)驗(yàn)室要求第3頁/共59頁臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的一般原則各區(qū)獨(dú)立注意風(fēng)向因地制宜方便工作“十六字方針”第4頁/共59頁基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作流程進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)必須遵循嚴(yán)格的單一方向順序!第5頁/共59頁最佳的HPV基因分型實(shí)驗(yàn)室布局

出口

入口工作流向臨床樣本收集與儲(chǔ)存PCR前區(qū)域PCR后區(qū)域第6頁/共59頁最佳的HPV基因分型實(shí)驗(yàn)室布局每間房間必須有其專用的工作服及一次性手套；每個(gè)工作區(qū)都應(yīng)有獨(dú)立的一套儀器設(shè)備及耗材；不同區(qū)域的儀器設(shè)備及耗材不能混用;臨床樣本(原始容器中)樣本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)超凈工作臺(tái)DNA提取PCR擴(kuò)增區(qū)導(dǎo)流雜交區(qū)結(jié)果通知患者第7頁/共59頁基礎(chǔ)HPV基因分型實(shí)驗(yàn)室布局（1）

臨床樣本(原始容器中)樣本制備區(qū)超凈工作臺(tái)DNA提取導(dǎo)流雜交區(qū)結(jié)果通知患者PCR區(qū)域第8頁/共59頁基礎(chǔ)HPV基因分型實(shí)驗(yàn)室布局（2）

每個(gè)區(qū)域必須有其專用的工作服及一次性手套；每次操作必須更換；涉及到公用儀器使用，必須注意防止交叉污染，定時(shí)使用次氯酸鈉溶液擦洗；第9頁/共59頁實(shí)驗(yàn)室環(huán)境注意事項(xiàng)

工作區(qū)域必須始終保持清潔整齊；所有實(shí)驗(yàn)臺(tái)面及地面均應(yīng)保持清潔；所有實(shí)驗(yàn)廢料及垃圾使用專用垃圾帶裝好后，封口處理；在每次工作前后對(duì)工作臺(tái)面進(jìn)行消毒液（次氯酸溶液）擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后開啟紫外燈進(jìn)行滅菌；第10頁/共59頁實(shí)驗(yàn)室制度及人員配備

有效的臨床結(jié)果嚴(yán)格規(guī)章制度并遵守操作人員具有專業(yè)技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)強(qiáng)烈責(zé)任感工作態(tài)度認(rèn)真細(xì)心嚴(yán)格遵守HPV基因分型各項(xiàng)工作的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程第11頁/共59頁實(shí)驗(yàn)所需儀器HybirMax?醫(yī)用核酸分子快速雜交儀PCR擴(kuò)增儀超凈工作臺(tái)水浴鍋離心機(jī)旋渦混合儀微量移液器第12頁/共59頁HPV基因分型檢測試驗(yàn)項(xiàng)目

——HPV臨床樣本的采集方法及注意事項(xiàng)第13頁/共59頁HPV臨床樣本的采集方法及注意事項(xiàng)標(biāo)本收集

標(biāo)本保存第14頁/共59頁標(biāo)本收集檢查前告知病人注意事項(xiàng)：月經(jīng)正常婦女，在月經(jīng)來潮后10～18天為最佳檢查時(shí)間。檢查前48小時(shí)內(nèi)不要作陰道沖洗，不要用避孕藥膏等陰道內(nèi)用藥物。檢查前48小時(shí)最好不要行性生活。檢查前不進(jìn)行醋酸或碘液涂抹。

第15頁/共59頁標(biāo)本收集

步驟－

先脫掉褲子，然后按醫(yī)生指示仰臥于一張檢查床上。

步驟二由醫(yī)生以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸。然后使用專用的HPV采樣刷置于宮頸口采集標(biāo)本。（最好在取樣前先用棉簽擦去宮頸分泌物）第16頁/共59頁標(biāo)本收集步驟四慢慢取出宮頸刷，將其放入標(biāo)有病人編號(hào)的取樣管中，取樣管內(nèi)已加有專用細(xì)胞保存液，折斷其刷頭入管中，擰緊瓶蓋。步驟三將專用宮頸刷置于宮頸口，輕輕搓動(dòng)宮頸刷使其順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5圈。

第17頁/共59頁標(biāo)本保存樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測實(shí)驗(yàn)室。如若不能馬上送檢樣本，請于4℃保存，請?jiān)?個(gè)星期之內(nèi)進(jìn)行檢測。第18頁/共59頁標(biāo)本收集標(biāo)準(zhǔn)收集中注意事項(xiàng)：使用凱普專用取樣器及保存液，可抑制細(xì)菌生長，保持DNA完整性。樣本收集中為保留足夠的宮頸細(xì)胞標(biāo)本，注意切勿將宮頸刷頭丟棄。宮頸保存系統(tǒng)包裝打開后，必須立即進(jìn)行采樣，并連同刷頭置于取樣管中。如果同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查，應(yīng)先采細(xì)胞學(xué)樣品。宮頸刷頭折斷、試驗(yàn)取樣時(shí)，請小心操作，切忌大力震蕩取樣管，造成試劑及樣本濺出影響檢測結(jié)果或造成污染。取樣管上標(biāo)示的名稱須與患者一一對(duì)應(yīng)。取樣后，切記擰緊取樣管管蓋。第19頁/共59頁HPV基因分型檢測試驗(yàn)項(xiàng)目

——臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)第20頁/共59頁因操作欠規(guī)范導(dǎo)致的問題分析第21頁/共59頁移液器：①嚴(yán)禁大力來回?cái)Q動(dòng)；②嚴(yán)禁調(diào)至容量之外使用；③第二檔為排空檔，不得作吸取之用；④吸頭應(yīng)浸入液面2—3mm處吸??；⑤嚴(yán)禁將有液體的移液器平放或倒置；⑥混勻沉淀時(shí)，將吸頭緊貼于沉淀上方管壁，反復(fù)吸取液體，將沉淀反復(fù)混勻，溶解；⑦每周用75%乙醇清洗一次，若有污染隨時(shí)清洗。第22頁/共59頁（二）實(shí)驗(yàn)室布局不合理引起的污染問題1、樣品處理不進(jìn)行隔離，樣品中各種核酸片段均會(huì)通過空氣進(jìn)行傳播。2、PCR結(jié)果檢測實(shí)驗(yàn)室和其它實(shí)驗(yàn)室在一起，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的擴(kuò)增子污染。3、儀器設(shè)備及工作服等（尤其是加樣器）公用，也會(huì)造成嚴(yán)重污染。4、實(shí)驗(yàn)室操作垃圾（吸頭、離心管、樣品杯等）亂放，飄散在空氣中的核酸片段、病原微生物可造成實(shí)驗(yàn)室污染。

第23頁/共59頁（三）PCR操作中存在問題分析1.陽性變陰性2.陰性變陽性3.PCR結(jié)果不穩(wěn)定第24頁/共59頁1.陽性變陰性

(1)有些陽性病人，經(jīng)過PCR檢測后為陰性，可能有兩種情況：一是采集標(biāo)本方法或部位不正確，二是如果病人取樣部位病原體消失，需根據(jù)病人的病理情況采樣。第25頁/共59頁(2)標(biāo)本保存不當(dāng)，可引起PCR失敗。收集的標(biāo)本亂放（未放冰箱），病原體的破裂，檢測的核酸降解，失去了PCR檢測的模板或造成標(biāo)本污染。第26頁/共59頁2.陰性變陽性

常見的原因有以下5點(diǎn)：

第27頁/共59頁①加樣器通道易形成氣溶膠，造成加樣器通道污染，可通過使用有濾篩的吸頭避免污染

（將模板DNA加入PCR系統(tǒng)時(shí)，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別的反應(yīng)，所有并非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)）。

第28頁/共59頁②打開標(biāo)本管蓋引起樣品飛濺

（打開前須瞬間離心）③操作時(shí)手套引起的交叉污染

（拿過模板DNA管后應(yīng)更換手套）第29頁/共59頁④不明原因引起公用試劑污染

（必須設(shè)置一個(gè)不含模板DNA但含PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對(duì)照反應(yīng)。這一對(duì)照管須在準(zhǔn)備好所有其他PCR以后才進(jìn)行吸加）。⑤實(shí)驗(yàn)室污染

第30頁/共59頁

臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)室建設(shè)方面HPV分型檢測試驗(yàn)操作方面

DNA提取

PCR擴(kuò)增導(dǎo)流雜交(詳見各項(xiàng)操作的SOP）第31頁/共59頁臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

——實(shí)驗(yàn)室建設(shè)方面一、實(shí)驗(yàn)室分獨(dú)立房間操作:

樣本儲(chǔ)存區(qū)（與試劑儲(chǔ)存分開）PCR前區(qū)域(試劑貯存及準(zhǔn)備區(qū),樣本處理區(qū)) PCR后區(qū)域(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū))

儀器及耗材獨(dú)立使用，切忌前后區(qū)域交叉！試驗(yàn)工作服及手套獨(dú)立二、單一工作流程:PCR前區(qū)域PCR后區(qū)域三、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境（防止污染、保持清潔整齊、嚴(yán)格制定及執(zhí)行各項(xiàng)規(guī)章）四、試劑管理及標(biāo)本管理試劑按要求溫度貯存、注意有效期，使用過的試劑擰緊歸類放好；樣本清楚標(biāo)記好樣本號(hào)、與試劑分開貯存，使用過的樣本歸類放好五、以謹(jǐn)慎的態(tài)度對(duì)待，并清楚記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果及一些突發(fā)性問題；第32頁/共59頁臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

——DNA提取

使用移液器吸取臨床樣本時(shí)，避免移液槍頭碰到樣本管壁。所用移液槍頭均為一次性用品，切忌重復(fù)使用；防止造成樣本交叉污染防止造成試劑被污染

正確使用移液器第33頁/共59頁臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

——DNA提取盡可能使用帶有濾心的移液器槍頭防止形成氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境防止樣本DNA污染移液器槍管第34頁/共59頁臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

——DNA提取DNA提取操作步驟注意事項(xiàng)：加入溶液Ⅰ之前,應(yīng)確保溶液中沒有沉淀出現(xiàn)!

以免影響提取效率.加入臨床樣本時(shí),最好在超凈工作臺(tái)前操作,且將用過的槍頭打入到盛有10％次氯酸鈉的廢液瓶中,以免樣品交叉污染,影響以后的PCR檢測.在煮沸樣品時(shí),切記不要讓沸水濺入到樣品管中!建議水沸騰后調(diào)低火力.每次去上清時(shí),盡量去干凈,特別是第3步驟,以免影響提取效果.在做PCR之前,最好將提取的樣品離心5分鐘,取樣時(shí)盡量不要將槍尖碰到管底的沉淀。第35頁/共59頁臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

——PCR擴(kuò)增正確使用移液槍防止造成樣本交叉污染防止造成試劑被污染第36頁/共59頁臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

——PCR擴(kuò)增盡可能使用帶有濾心的長頭移液器槍頭防止形成氣溶膠防止樣本DNA交叉污染防止樣本污染試劑第37頁/共59頁臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

——PCR擴(kuò)增防止造成試劑被污染移液槍頭均為一次性用品,切忌重復(fù)使用移液槍頭盡可能為帶有濾芯每個(gè)區(qū)域必須用專用儀器、耗材。進(jìn)入不同房間必須穿專用工作服及帶手套，離開時(shí)必須先脫去工作服及手套。PCR后操作區(qū)域房間內(nèi)的所有耗材及儀器均不能與PCR前區(qū)域混合使用。使用前后均以次氯酸消毒液清理。第38頁/共59頁臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

——PCR擴(kuò)增HPV58HPV18HPV16PCR操作不當(dāng)造成污染：第39頁/共59頁臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

——導(dǎo)流雜交雜交及雜交后清洗溫度（45C

）。每次清洗膜后，抽液干凈。確保PCR產(chǎn)物變性成功。遵守封阻反應(yīng)溫度及時(shí)間、酶標(biāo)反應(yīng)時(shí)間及顯色反應(yīng)時(shí)間，確保雜交結(jié)果背景正常。正確使用移液器，移液槍及槍頭專用。第40頁/共59頁HPV基因分型檢測試驗(yàn)項(xiàng)目

——臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題

第41頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題HPV陽性正常結(jié)果HPV陰性正常結(jié)果第42頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題一、雜交結(jié)果中IC點(diǎn)不清楚，同時(shí)陽性點(diǎn)也不清楚或比較淡；可能原因：①雜交溫度控制不當(dāng)，出現(xiàn)非特異性雜交點(diǎn)；

②DNA樣本中有對(duì)PCR反應(yīng)的抑制物質(zhì)，影響了PCR擴(kuò)增的效率；

③確保PCR產(chǎn)物完全變性成單鏈，如有必要，在使用前再次變性PCR產(chǎn)物。④病人樣本是否取樣前是否違反了取樣要求？將DNA樣本稀釋10倍后，重新PCR擴(kuò)增及雜交反應(yīng)可解決。第43頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題二、雜交結(jié)果中，在雜交膜上既無IC點(diǎn)，也沒有HPV分型陽性點(diǎn)顯色；可能原因：①可能是因?yàn)镈NA模板中存在抑制PCR反應(yīng)的抑制物質(zhì)，首先,通過抽提得到的DNA的純度對(duì)PCR反應(yīng)會(huì)有很大影響,所以必須在做PCR模板的時(shí)候?qū)⑵湎♂審亩档虳NA溶液中抑制劑的濃度,使得PCR反應(yīng)能正常進(jìn)行，在一家新的醫(yī)院開始試驗(yàn)的時(shí)候均需要摸索本院樣本自身的特點(diǎn)。②或者所取樣本，不符合凱普HPV分型檢測說明書中對(duì)樣本的要求，樣本之前經(jīng)過碘染色或者病人使用了陰道沖洗藥物，均會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制。③確保PCR產(chǎn)物完全變性成單鏈，如有必要，在使用前再次變性PCR產(chǎn)物。如果這些情況的時(shí)候，建議對(duì)樣本稀釋10倍重新PCR，然后雜交，結(jié)果仍然不成功的情況下，建議按照凱普說明書要求重新取樣檢測。第44頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題402721403022403040403078稀釋

1:10DNA模板重復(fù)PCRHPV58HPV18IC(+)HPV51弱

IC,HPV52第45頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題三、雜交結(jié)果中IC點(diǎn)沒有，同時(shí)陽性點(diǎn)淡或不清楚；可能原因：①樣本中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)；②樣本中HPVDNA濃度較低，同樣本中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)；③病人樣本不符合凱普分型試驗(yàn)要求，樣本本身為陰性結(jié)果，但因?yàn)闃颖局杏幸种芇CR反應(yīng)的物質(zhì)，同時(shí)操作人員對(duì)雜交溫度又控制不當(dāng)，出現(xiàn)非特異性雜交點(diǎn)；

建議增加用于擴(kuò)增DNA濃度，重新PCR擴(kuò)增及雜交反應(yīng)。第46頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題四、IC點(diǎn)弱或者沒有，但HPV分型陽性點(diǎn)顯色正?？赡茉颍孩儆捎贗C和HPVDNA之間存在競爭，高濃度的HPVDNA可能會(huì)對(duì)IC點(diǎn)的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生競爭性抑制，此現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí)如HPV分型點(diǎn)顯色正常，則認(rèn)為分型結(jié)果正確。第47頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題六、Biotin（生物素）點(diǎn)不顯色可能原因：①請確認(rèn)所使用試劑是否仍在有效期內(nèi)。尤其是酶標(biāo)液及顯色液是否按要求使用及儲(chǔ)存。②確定實(shí)驗(yàn)操作是否嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行、且試劑是否按要求保存使用。第48頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題七、陰性對(duì)照顯現(xiàn)HPV分型陽性點(diǎn)可能原因：①PCR試劑可能被污染，取5lPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。②重復(fù)進(jìn)行PCR及雜交試驗(yàn)。第49頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題八、雜交膜有很高的背景可能原因：①可能由于封閉不足，使未結(jié)合的酶標(biāo)殘留在膜上。確保封閉液完全覆蓋整個(gè)雜交膜。②也可能因?yàn)闆]有完全將未結(jié)合的試劑清洗干凈，請確保在顯色過程中雜交膜充分清洗，無剩余殘留液體。第50頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題九、封阻液抽不動(dòng)可能原因：①仔細(xì)觀察封阻液是否有絮狀微生物或澄淀，如果有則證明封阻液有發(fā)霉跡象，是由于操作中沒有使用滅菌槍頭而造成的。

重新購買封阻液，同時(shí)確保試驗(yàn)中使用已滅菌的移液槍頭第51頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題十、什么時(shí)候需要做陽性及陰性對(duì)照①當(dāng)一個(gè)新的醫(yī)院，一個(gè)新的地方開展試驗(yàn)的時(shí)候，或更換試驗(yàn)地點(diǎn)的時(shí)候，需要進(jìn)行陰陽性對(duì)照試驗(yàn)；②當(dāng)使用的檢測試劑批次改變的時(shí)候需要做1次陰陽性對(duì)照；③當(dāng)雜交結(jié)果出現(xiàn)令人疑惑，比如多個(gè)樣本的雜交結(jié)果一樣，或者雜交結(jié)果出現(xiàn)過多的多重感染，以及雜交試驗(yàn)后出現(xiàn)許多無IC點(diǎn)及陽性雜交點(diǎn)的結(jié)果等情況下，需要使用同批試劑進(jìn)行陰陽性對(duì)照試驗(yàn)以驗(yàn)證問題所在；第52頁/共59頁臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題十一、導(dǎo)流雜交試驗(yàn)中的污染主要會(huì)出現(xiàn)在那一步中，應(yīng)該怎樣防范？①首先，污染情況主要由PCR操作中樣本DNA的交叉而產(chǎn)生；對(duì)于此種情況，應(yīng)嚴(yán)格按照SOP操作，確保PCR加樣的試驗(yàn)器材均為專用，特別是移液槍和槍頭。②其次，雜交結(jié)果中出現(xiàn)的比較弱的雜交點(diǎn)不是污染造成，而是雜交溫度不符合要求而造成的非特異