基因工程期末復(fù)習(xí)題及答案

基因工程期末復(fù)習(xí)題及答案

名詞解釋:基因工程:是以分子遺傳學(xué)理論為基礎(chǔ),以分子生物學(xué)和微生

物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因(即DNA分子)，按照人們預(yù)先設(shè)

計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建重組DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，有目的改造生物原

有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品，或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能.同裂

酶(isoschizomers)(同切點(diǎn)酶):有一些來源不同的限制酶識(shí)別的是同樣的核

甘酸靶序列，這類酶特稱為同裂酶.同尾酶(isocaudamer):與同裂酶對(duì)應(yīng)的一

類限制性內(nèi)切酶，它們雖然來源不同，識(shí)別的靶序列也各不相同，但都能產(chǎn)生

相同的粘性末端，特稱為同尾酶.星號(hào)活性(staractivity):在“非最適的”反

應(yīng)條件下(包括高濃度的核酸內(nèi)切限制酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、用

Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的特異

性便會(huì)發(fā)生“松動(dòng)”，從其“正確”識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割DNA分

子.這種特殊的識(shí)別能力，通常叫做星號(hào)活性，以EcoRI*表示.測序酶是經(jīng)修飾

過的T7噬菌體DNA聚合酶，是采用缺失的方法，從外切核酸酶結(jié)構(gòu)域中除去

28個(gè)氨基酸，這樣使得T7DNA聚合酶完全失去了3'-5'外切酶活性，只有5'

-3'聚合酶活性,而且聚合能力提高了3-9倍，測序時(shí)常用此酶.限制性內(nèi)切

酶也是一種水解酶，主要從細(xì)菌中分離得到.在細(xì)菌體內(nèi)的作用是水解“入

侵

”的外源DNA序列而保護(hù)自身DNA.水解后產(chǎn)生的DNA產(chǎn)物是帶有5'

-P和3'-0H的.限制性核酸內(nèi)切酶:是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子中

特定堿基順序的核酸水解酶.限制-修飾系統(tǒng):指一定類型的細(xì)菌可以通過限

制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對(duì)生

物細(xì)胞的入侵受到限制；而生物細(xì)胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通過

修飾酶的作用，在堿基中特定的位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾,可免遭

自身限制性酶的破壞，這樣形成的就是限制-修飾系統(tǒng).限制性片段長度多態(tài)

性(RFLP)當(dāng)DNA序列的差異發(fā)生在限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，或當(dāng)DNA

片段的插入、缺失或重復(fù)導(dǎo)致基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶解后,其片段

長度的改變可以經(jīng)過凝膠電泳區(qū)分，出現(xiàn)的這種DNA多態(tài)性稱RFLP.載體

(vector):在基因操作中攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的工具.克隆載體:主要

用于擴(kuò)增或保存DNA片段，是最簡單的載體.穿梭載體:能在兩類不同宿主中

復(fù)制、增值和選擇的載體.表達(dá)載體是可攜帶外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)

制并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯的載體.YAC人工染色體載體是利用釀酒酵母的染色體

的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中.YAC基本特點(diǎn):YAC

載體為能夠滿足自主復(fù)制、染色體在子代細(xì)胞間的分離及保持染色體穩(wěn)定

的需要泌須含有以下元件:端粒重復(fù)序列(telomericrepeat,TEL):定位于染色

體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定

的結(jié)構(gòu).著絲粒(centromere,CEN):有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染

色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中.在YAC中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)

只有一個(gè)人工染色體的作用.自主復(fù)制序歹^(autonomouslyreplication

sequences,ARS):一段特殊的序歹U,含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須

的信號(hào).細(xì)菌人工染色體載體(Bacterialartificialchromosom

es,BACs):是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的、高通量底拷貝的質(zhì)粒載體.

卸甲載體:將Ti質(zhì)粒上的T-DNA的致瘤基因全部去掉，僅保留其兩邊界即與

T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的25bp序列而構(gòu)建成的載體.一元載體:含目的DNA的中

間表達(dá)載體與改造后的受體(Ti質(zhì)粒)通過同源重組所產(chǎn)生的一種復(fù)合型載

體.雙元載體:是指由兩個(gè)分別含有T-DNA和vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成

的系統(tǒng).Ti質(zhì)粒(tumo門inducingplasmid)是根癌農(nóng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的可引起植物

產(chǎn)生冠瘦瘤的質(zhì)粒.T-DNA區(qū)：即轉(zhuǎn)移DNA,能轉(zhuǎn)移并整合在植物細(xì)胞核基因

組上的、決定植物形成冠瘦瘤的一段DNA.LTS和RTS對(duì)于T-DNA的轉(zhuǎn)移和

整合是不可缺少的.a-互補(bǔ);指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體

與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的B-半乳糖普酶(8-galactosidase,由1024

個(gè)氨基酸組成)陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ).探針(probe):指用于檢測特定基

因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在或表達(dá)的DNA、RNA或瓜核酸序列.這些序列在使用之前

需標(biāo)記.基因探針:指用于檢測特定基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在或表達(dá)的DNA、RNA

或寡核甘酸序列，這寫序列在使用之前,需要進(jìn)行標(biāo)記.COS位點(diǎn):當(dāng)XDNA進(jìn)

入細(xì)菌細(xì)胞后，便迅速粘性末端配對(duì)形成雙鏈環(huán)狀DNA分子,這種粘性末端

結(jié)合形成的雙鏈區(qū)域叫做COS位點(diǎn).凝膠阻滯試驗(yàn)Xgelretardationassay):又

叫DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(EMSA),是用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的

一種特殊的凝膠電泳技術(shù).盒式誘變(cassettemutagenesis):就是用一段人工

合成具有突變序列的DNA片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列.這就好象用

各種不同的盒式磁帶插入收錄機(jī)中一樣,故而稱合成的片段為“盒”，這種

誘變方式為盒式誘變.酵母雙雜交體系(Yeasttwo-hybridsystem):也叫相

互作用陷阱(interactiontrap),是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的分離新基因的

新方法，可用于分離能與靶蛋白相互作用的基因，也是直接在細(xì)胞內(nèi)檢測蛋

白一蛋白交互作用的靈敏度很高的遺傳學(xué)新工具.酵母單雜交體系(yeast

one-hybridsystem)常用于研究DNA-蛋白質(zhì)間的相互作用.酵母單雜交體系

可識(shí)別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，可在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核DNA-蛋白質(zhì)

間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼

基因.也可用于分析鑒定細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與順式作用元件相互作

用.cDNA末端的快速擴(kuò)增/RACE(rapidamplificationofcDNAends)是用于

從已知cDNA片段擴(kuò)增全長基因的方法,它根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)基因片段內(nèi)部

特異引物,由該片段向外側(cè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的序列用于擴(kuò)增5?端的方

法稱為5?RACE,用于擴(kuò)增3?端的稱為3?RACE.基因文庫:是指利用重組DNA

技術(shù)將生物細(xì)胞的染色體DNA所有片段隨機(jī)地連接在基因載體上，然后轉(zhuǎn)

移到適當(dāng)?shù)募闹髦校ㄟ^細(xì)胞增殖而構(gòu)成各種片段的無性繁殖系.這種包含

某種生物全部基因的一系列無性繁殖系稱為該種生物的基因文庫.(分為:基

因組文庫和cDNA文庫JcDNA文庫:將一種生物mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA,

以cDNA構(gòu)建的克隆群體叫做該種生物的cDNA文庫.cDNA差示分析法

(representationaldifferenceanalysis,RDA)是利用PCR能以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈

DNA模板，而僅以線

性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA

兩端接頭等方法,特異性的擴(kuò)增目的基因片斷.融合基因:是指應(yīng)用DNA體

外重組技術(shù)構(gòu)建的一類具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同基因核昔酸序列

的新型基因.

抑制性消減雜交(SuppressionSubtractivehybddization,SSH):是一種比較

和分離不同細(xì)胞或同一細(xì)胞在不同狀態(tài)下差異表達(dá)基因的方法.轉(zhuǎn)化

(transformation):把重組質(zhì)粒DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞(大腸桿菌、酵母、動(dòng)植物

細(xì)胞等),使其遺傳性狀改變的過程.感受態(tài)(competence):作為受體細(xì)胞的

細(xì)菌經(jīng)一定處理(如冰冷的CaCI2溶液)后處于易于接受外源DNA的狀態(tài).

銜接物是指人工合成的由10~12nt組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)在其要連接到

的DNA上并不存在的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核甘酸短

片段.DNA接頭(人工接頭)是指人工合成的含有限制酶識(shí)別順序的核昔酸

片段.轉(zhuǎn)化子(transformant):經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)/DNA的細(xì)胞:是向有

功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功轉(zhuǎn)染(transfection)把重組的噬菌體或病毒導(dǎo)入

受體細(xì)胞的過程.選擇(selection)是指通過某種外來附加壓力(或因素)的辨

別作用，呈現(xiàn)具有重組DNA分子的特定克隆類型的一種方法.篩選(screening)

是指通過某種特定的方法,從被分析的細(xì)胞群體或基因文庫中，鑒定出真正

具有所需要重組DNA分子的特定克隆的過程.沉默子(silencer):是參與基因

表達(dá)負(fù)調(diào)控的一種元件(降低轉(zhuǎn)錄效率的一段DNA)絕緣子(insulator):既是

基因表達(dá)的調(diào)控元件也是一種邊界元件.絕緣子本身對(duì)基因的表達(dá)既沒有

正效應(yīng)，也沒有負(fù)效應(yīng)，其作用只是不讓其他調(diào)控元件對(duì)基因的活化效應(yīng)或

失活效應(yīng)發(fā)生作用.衰減子(attenuator):衰減發(fā)生處的一種內(nèi)部終止子序列.

衰減子結(jié)構(gòu)本身不能實(shí)現(xiàn)衰減作用，必須借助核糖體與前導(dǎo)序列的結(jié)合來

發(fā)揮其作用.終止子(terminator):為轉(zhuǎn)錄提供終止信號(hào)的一段DNA序列，是

基因表達(dá)的順式負(fù)調(diào)控元件.電轉(zhuǎn)化法(electroporatiorO也叫電穿孔法或電

擊法,是一種將極性分子穿過細(xì)胞膜導(dǎo)入細(xì)胞的一種物理方法，在這個(gè)過程

中一個(gè)較大的電脈沖短暫破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，從而允許DNA等分

子進(jìn)入細(xì)胞.菌落原位雜交:將菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)到固相膜上，原位裂解細(xì)胞后

使核酸固定在膜上，然后與探針雜交.目的基因:指那些已被或者準(zhǔn)備要被分

離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或DNA片段.報(bào)告基因:是指編碼產(chǎn)物能

夠被快速測定、常用于判斷外源基因是否成功地導(dǎo)入受體細(xì)胞（器官或組

織）,是否表達(dá)的一類特殊用途的基因.

報(bào)告基因與選擇基因的區(qū)別:選擇基因往往要與外界存在的篩選壓力

如抗生素等相互作用，以篩選出被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞;而報(bào)告基因是提供一種快速

測定外源基因是否成功導(dǎo)入的檢測手段，它的應(yīng)用不依賴于外界選擇壓力

的存在.原位PCR:是指對(duì)組織、細(xì)胞中特異DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增,然后再

用原位雜交對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析的一種方法.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物:指用人工的

方法將外源基因?qū)雱?dòng)物受精卵或早期胚胎細(xì)胞，使外源基因與動(dòng)物本身

的基因組整合，并隨細(xì)胞的分裂而增殖,從而將外源基因穩(wěn)定地遺傳給下一

代的工程化動(dòng)物.基因工程疫苗:疫苗一般是由滅活或減毒的病原體做成的

可預(yù)防相應(yīng)病原物引起疾病的藥物，通過接種人或動(dòng)物在其體內(nèi)建立抗感

染免疫反應(yīng)而產(chǎn)生保護(hù)作用.將基因工程技術(shù)應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)所得的疫苗

即為基因工程疫苗.亞克隆:對(duì)已經(jīng)獲得的目的DNA片段進(jìn)行重新克隆，即將

已克隆的DNA片段從一載體向另一載體的轉(zhuǎn)移的過程.目的在于對(duì)目的

DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析,或者進(jìn)行重組改照等.核酸疫苗:核酸疫苗又稱基因疫

苗或DNA疫苗,是利用基因重組技術(shù)將編碼抗原的基因裝入載體，然后直接

導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，通過機(jī)體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成蛋白，產(chǎn)生的蛋白作為抗原誘

導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，即通過細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，從而達(dá)到

預(yù)防和治療疾病的目的.動(dòng)物生物反應(yīng)器:從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體液或血液中收獲

基因產(chǎn)物即是所謂的動(dòng)物生物反應(yīng)器質(zhì)粒的不相容性:兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿

主中不能共存的現(xiàn)象.他們常常共用同一個(gè)復(fù)制系統(tǒng).轉(zhuǎn)化:指將質(zhì)粒DNA或

以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過程.轉(zhuǎn)染把重組的噬菌體

或病毒導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程.基因治療能基因，以糾正或補(bǔ)償其基因缺陷，達(dá)

到治療目的的方法.轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)/T-DNA標(biāo)簽技術(shù):當(dāng)轉(zhuǎn)座子或T-DNA轉(zhuǎn)

入生物基因組，整合到染色體上的時(shí)候,有可能是插入到染色體上的某個(gè)基

因中，這時(shí)會(huì)破壞該基因的結(jié)構(gòu)，從而引起表型變異，把變異個(gè)體的DNA提取

出來，構(gòu)建成基因組文庫，再用轉(zhuǎn)座子或T-DNA為模板制備探針，克隆出該突

第一章1.基因克隆?基因操作.基因重組.基因工程的概念及其相互關(guān)系?

基因克隆:在一定程度上等同于基因分離.基因工程:通過基因操作來定向改

變或修飾生物體或人類自身，并具有明確應(yīng)用目的活動(dòng)稱為基因工程.基因

操作:對(duì)基因進(jìn)行分離.分析.改造.檢測.表達(dá).重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱.基因

重組:不同來源DNA分子通過共價(jià)連接（磷酸二酯鍵）而組合成新的DNA分

子的過程.關(guān)系:基因工程是通過基因重組實(shí)現(xiàn)的，但基因重組并不都是嚴(yán)格

意義上的基因工程，基因重組是基因操作范疇的概念，包括實(shí)驗(yàn)研究和生物

技術(shù)的基因重組事件，而基因工程則專指為實(shí)踐應(yīng)用而進(jìn)行的重組事件2

試述基因工程技術(shù)的發(fā)展給人類帶來的影響?①.在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用（第四

次工業(yè)大革命）②.在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用③.在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用（第二次醫(yī)學(xué)大

革命）3.試述基因工程技術(shù)的發(fā)展方向?生物的遺傳改良，生物反應(yīng)器.基因

治療和基因疫苗等4簡述基因工程的基本過程?①.提取目的基因②.目的

基因與運(yùn)載體結(jié)合③.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④.目的基因的檢測和表達(dá)

第二章1,切口平移標(biāo)記DNA前，用DNasel處理DNA時(shí)應(yīng)注意什么?應(yīng)

注意Mg2+離子濃度和處理時(shí)間及溫度2DNA聚合酶有哪些類型，各有什么

活性?①.E.coliDNApoll5'-3'DNA聚合酶活性.5'-3,DNA外切酶活性.3'

-5'DNA外切酶活性②.E.coliDNApoll大片段（Klenow酶）5'-3,DNA聚合

酶活性.3'-5'外切酶活性③.T4噬菌體DNApol5'-3,DNA聚合酶活性

（與Klenow酶相似）3'一5'外切酶活性（Klenow酶X200）:在無dNTP時(shí)只

有該活性.常用于填平dsDNA的3'縮進(jìn)末端及水解dsDNA的3'突出末端

④.T7噬菌DNApol及測序酶5'-3'DNA聚合酶活性

.3'-5'外切酶活性（Klenow酶X1000）⑤.耐熱DNA聚合酶在高溫下

仍具活性的DNA聚合酶⑥.反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNApol）5,-3'DNA

聚合酶活性（需Mg2+）RNaseH活性（5'一3'及3'-5'RNA外切核酸酶活

性）⑦沫端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）不依賴于模板的DNA聚合酶，在二價(jià)

陽離子存在下，催化dNTP加在DNA分子的3'-OH端.

3.生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶的細(xì)菌如何保護(hù)自己的DNA不被降解?通過限制

與修飾系統(tǒng)保護(hù)自己的DNA不被降解.不同種的細(xì)菌或不同的細(xì)菌菌株具

有的限制酶和修飾酶組成的限制與修飾系統(tǒng).修飾的本質(zhì)是通過甲基化酶

將DNA中某些堿基進(jìn)行甲基化修飾，由于宿主自身DNA上的這些位點(diǎn)進(jìn)行

了修飾，限制酶就不能進(jìn)行切割.由于外來的DNA在相應(yīng)的堿基上沒有被甲

基化，宿主的限制酶通過對(duì)該位點(diǎn)的識(shí)別來分辨敵我，并將入侵的外來DNA

分子降解掉.所以DNA限制作用和修飾作用為細(xì)胞提供了保護(hù).4.按適當(dāng)?shù)?/p>

順序，列出將一種mRNA的cDNA克隆到表達(dá)載體所用到的酶有哪些?①反

轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板復(fù)制出單鏈cDNA;②DNA聚合酶以單鏈cDNA為模

板合成雙鏈DNA;③S1核酸酶切割雙鏈DNA形成平末端;④用限制性內(nèi)切酶

切割載體;⑤用DNA連接酶將cDNA插入載體.5.某學(xué)生在用EcoRI切割外源

DNA片段時(shí)出現(xiàn)了星號(hào)活性，分析可能的原因?（1）高甘油含量

(>5%,v/v);⑵限制性內(nèi)切核酸酶用量過高(>100U

/ugDNA);⑶低離子強(qiáng)度(<25mmol/

L);⑷高pH(8.0以上);(5)含有有機(jī)溶劑，如DMSO,乙醇等;⑹有非Mg2+

的二價(jià)陽離子存在(如Mn2+,

Cu2+,CO2+,Zn2+等).6.為什么反轉(zhuǎn)錄酶在聚合反應(yīng)中會(huì)出錯(cuò)?因?yàn)榉崔D(zhuǎn)

錄酶無3'-5'外切酶校正作用，在高濃度的dNTP和Mn2+存在時(shí)錯(cuò)誤率

為l/500b;7.Mn2+.Mg2+對(duì)DNasel的活性有什么影響？

DNasel在基因工程中有什么作用？在Mg2+存在下，獨(dú)立作用于每條

DNA鏈，且切割位點(diǎn)隨機(jī);在Mn2+存在下，可在兩條鏈大致同一位置切割

dsDNA,產(chǎn)生平末端或l~2nt突出的DNA片段.切口平移標(biāo)記時(shí)在dsDNA上

產(chǎn)生隨機(jī)切口;在閉環(huán)DNA上引入單切口;在DNA酶足跡法中分析蛋白/DNA

復(fù)合物;去除RNA樣品中的DNA.8.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的影響因素:1.酶的純

度:不應(yīng)存在其他的酶污染2.DNA的純度:限制性核酸內(nèi)切酶消化DNA底物

的反應(yīng)效率，在很大程度上是取決于所使用的DNA本身的純度.污染在DNA

制劑中的某些物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、

SDS(十二烷基硫酸鈉)、以及高濃度的鹽離子等,都有可能抑制限制性核酸內(nèi)

切酶的活性.3.DNA的甲基化程度:限制性核酸內(nèi)切酶是原核生物限制一修

飾體系的組成部分,因此識(shí)別序列中特定核甘酸的甲基化作用，便會(huì)強(qiáng)烈地

影響酶的活性.為避免產(chǎn)生這樣的問題在基因克隆中使用的是失去甲基化

酶/M-的E.coli菌株制備質(zhì)粒DNA.9.克服星號(hào)活性的方法:維持反應(yīng)體系

適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度、較低的溫度或酶濃度，盡可能縮短反應(yīng)時(shí)間或DNA樣品

的重新處理等.

10.DNA連接酶:作用:催化dsDNA分子中相鄰堿基的5?-P與3?-OH間

連接成磷酸二酯鍵1)大腸桿菌DNA連接酶:作用:只能催化黏性末端間的連

接，需NAD+提供能量.

2)T4噬菌體DNA連接酶:作用:催化黏性末端或平末端間的連接，連接反

應(yīng)需ATP.1L脫氧核糖核酸酶(DNaseI):為內(nèi)切核酸酶，可優(yōu)先從喀碇核甘酸

的位置水解dsDNA或ssDNA.在Mg2+存在下，獨(dú)立作用于每條DNA鏈，且

切割位點(diǎn)隨機(jī);在Mn2+存在下，可在兩條鏈大致同一位置切割dsDNA,產(chǎn)生

平末端或1?2nt突出的DNA片段.作用:切口平移標(biāo)記時(shí)在dsDNA上產(chǎn)生

隨機(jī)切口;在閉環(huán)DNA上引入單切口;在DNA酶足跡法中分析蛋白/DNA復(fù)

合物;去除RNA樣品中的DNA.12.如何制備平末端？(工具酶:T4聚合

酶,Klenow片段)當(dāng)3?端突出,5?端凹時(shí)，不加dNTP,用T4聚合酶的3,一5,

外切酶活性，切去3?端;當(dāng)5?端突出,3?凹時(shí)，加T4聚合酶或Klenow片段和

dNTP,補(bǔ)平5?端對(duì)應(yīng)的3?端.13.如何利用T4DNA聚合酶進(jìn)行雙鏈DNA的3?

末端標(biāo)記:利用T4DNApol的3?-5?外切核酸酶活性在無dNTP的條件下

切割dsDNA,產(chǎn)生5?突出端，然后加入放射性標(biāo)記的dNTP,利用其聚合酶活性

進(jìn)行填補(bǔ)合成，得到兩端的3?端都是帶標(biāo)記的dsDNA.14.Sl核酸酶:是一種

單鏈核酸酶，降解DNA或RNA.作用:主要用于去除DNA片段粘末端而產(chǎn)生

平端;打開dscDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾結(jié)構(gòu).S1核酸酶作圖法，在測定雜交核

酸分子(DNA:DNA或DNA:

RNA)的雜交程度、RNA分子定位，確定真核基因中內(nèi)含子的位置、內(nèi)含

子與外顯子剪切位點(diǎn)的定位、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與終止位點(diǎn)的測定中,S1核酸

酶都是十分有效的工具.

15.反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNApol）l）5?-3?DNA聚合酶活性（需

Mg2+）:底物為RNA或DNA模板及帶有3?-0H的RNA引物或DNA引

物.2）RNaseH活性（5?-3'及3?-5'RNA外切核酸酶活性）：能持續(xù)地特

異地降解RNA/DNA雜交體中的RNA.3）主要用途:將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

注：無3'-5'外切酶校正作用，在高濃度的dNTP和Mn2+存在時(shí)錯(cuò)誤率

為l/500b;為防新合成的DNA提前終止，反應(yīng)需高濃度的dNTP;該酶可用于

單鏈復(fù)制也可合成雙鏈（自身序列為引物但效率低）.16.分子雜交時(shí)探針的

標(biāo)記法答:A末端標(biāo)記:①3?末端標(biāo)記:利用末端轉(zhuǎn)移酶，不依賴于模板的DNA

聚合酶，在二價(jià)陽離子存在下，催化dNTP加在DNA分子的3'-0H端.即用

標(biāo)記的NTP、dNTP或ddNTP來標(biāo)記DNA片段的3'末端.②5?末端標(biāo)記:T4

多核昔酸激酶催化ATP的Y-磷酸基轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5?-0H末端，使已

經(jīng)脫磷酸化的5?末端重新磷酸化.當(dāng)過量ADP存在時(shí),DNA分子的5?-P轉(zhuǎn)移

給ADP,而脫磷酸化的DNA分子再從Y-32P的ATP中獲得Y-32P基團(tuán)，重新

磷酸化的DNA分子即獲得了32P同位素標(biāo)記,此反應(yīng)過程需Mg2+.B均勻標(biāo)

記:①切口平移法:用DNA酶I對(duì)DNA分子產(chǎn)生隨意的切口，利用4種dNTP

中的一種標(biāo)記，加入DNA聚合酶I,利用5?-3?外切酶活性從斷裂處的5?端

除去一個(gè)核甘酸，再利用它的5?-3?聚合酶活性講帶標(biāo)記的dNTP連接到斷

裂處的3?端.由于DNA聚合酶I不能使斷裂處的5?-P和3?-0H形成磷酸二

酯鍵重新連接，隨著反應(yīng)進(jìn)行形成帶標(biāo)記的探針.②隨機(jī)引物法:利用隨機(jī)的

寡核昔酸引物

與變性的dsDNA模板隨機(jī)退化，在存在標(biāo)記的dNTP的情況下用Klenow

酶進(jìn)行延伸，產(chǎn)生均勻標(biāo)記探針.第三章1.質(zhì)粒的基本特性:1）質(zhì)粒的復(fù)制：

只能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制2）質(zhì)粒的拷貝數(shù):拷貝數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，分為嚴(yán)謹(jǐn)型

與松馳型3）質(zhì)粒的不相容性:兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)

粒的不相容性（incompatibility）,源于共用同一復(fù)制系統(tǒng).4）轉(zhuǎn)移性:質(zhì)粒具轉(zhuǎn)

移性是指在自然條件下,很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新

宿主內(nèi).不含tra基因的質(zhì)粒則不具備轉(zhuǎn)移性.2.質(zhì)粒載體的構(gòu)建:1）選擇合適

的復(fù)制起始位點(diǎn)（松散型質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)）;2）縮短長度:切去不必要片段,

提高轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的效率，提高外源DNA片段的裝載量;3）增加或減少酶切

位點(diǎn):單一酶切位點(diǎn)數(shù)量越多越便于多種類型末端的DNA插入;或在特定部

位組裝MCS;4）加入合適的選擇標(biāo)記.3.野生型X噬菌體必須經(jīng)過改造才適

用于基因克隆的載體：（5個(gè)EcoRI和7個(gè)HindIII酶切位點(diǎn);1/2為非必需基

因，該區(qū)段缺少或在此段插入外源DNA片段將不影響X噬菌體的增殖:作為

基因工程載體的一個(gè)重要依據(jù)）X噬菌體只有進(jìn)入裂解循環(huán)，才能大量擴(kuò)增.

因此,人噬菌體只有在特定的E.coli中烈性生長,才能用作載體.這就決定了

入噬菌體載體必須含有裂解生長所必需的基因或DNA片段.去掉一部分對(duì)

裂解生長非必需的DNA片段后，可用來裝載外源DNA片段.4.用SalI切割從

噬菌體J2分離的DNA時(shí)，得到8個(gè)片段，分別是

1.3.2.8.3.6.5.3.7.

4.7.6.8.1和11.4kb.但是，用SalI切割從被感染的寄主細(xì)胞中分離到的

J2噬菌體DNA時(shí),只得到7個(gè)片段，分別是:1.328.7.4.7.

6.8.1.8.9和11.4kb.根據(jù)這些結(jié)果，你得到哪些信息?⑴J2噬菌體是一種

雙鏈線性的DNA分子;（2）基因組全長是47.5kb;⑶進(jìn)入宿主后成環(huán)狀;⑷5.3

和3.6kb的片段分別位于線性DNA的兩端.5.從噬菌體MS2中提取出來的

裸露染色體可以感染大腸桿菌的原生質(zhì)球(去除胞壁的細(xì)菌)，這會(huì)產(chǎn)生和具

感染能力的噬菌體一樣的噬菌體顆粒.如果染色體先用RNA酶處理，就失去

感染能力;如果標(biāo)記感染的RNA,在子代中不出現(xiàn)標(biāo)記.解釋這些現(xiàn)象.MS2噬

菌體的染色體為單鏈(+)RNA,它的復(fù)制過程如下:(1)以(+)鏈作為模板合成一

個(gè)堿基互補(bǔ)的(-)鏈;(2)以這條(-)鏈作為模板合成大量的(+)病毒鏈.原始的(+)

鏈被完全保留.相應(yīng)的酶是RNA復(fù)制酶，它是MS2一個(gè)基因的產(chǎn)物6以置換

型人噬菌體作為載體進(jìn)行克隆時(shí)，為什么說能夠形成噬菌斑的就一定是重

組體?改造的置換型噬菌體載體,重組人外源片段之后，總體積不能超過人

基因組的105%,不能少于人基因組的75%.以置換型人噬菌體DNA作為載

體,首先要分離左.右兩臂同外源DNA重組.如果沒有外源片段，僅是兩臂連

接，長度短于入基因組的75%,不能被包入噬菌體顆粒，就不能感染寄主，也

就不能形成噬菌斑.如果插入了外源片段后,總長度超過丸基因組105%后，

也不能包入噬菌體顆粒,自然不能形成噬菌斑.

7.某同學(xué)計(jì)劃以細(xì)菌質(zhì)粒DNA為載體克隆一個(gè)編碼大鼠生長激素的基

因，并轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá).運(yùn)用所學(xué)知識(shí)，請幫該同學(xué)分析一下在實(shí)驗(yàn)中

可能遇到哪些問題?要使動(dòng)物中編碼激素的基因在大腸桿菌中表達(dá),通常遇

到的問題有：(1)細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子.(2)大多數(shù)真

核基因有內(nèi)含子,這些內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄后從前體mRNA中被切除而形成成熟

mRNA.細(xì)菌細(xì)胞沒有這樣的機(jī)制來去除內(nèi)含子.⑶有些真核生物的蛋白質(zhì)

是通過前體分于加工而來的，例如胰島素就是通過加工去除前體分子內(nèi)部

的33個(gè)氨基酸殘基而來,剩下的兩段肽鏈分別形成胰島素的a.b鏈.⑷產(chǎn)生

的真核生物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以被細(xì)菌的蛋白酶所識(shí)別和降解.

8.以Ecoli為例，表達(dá)載體比克隆載體多了哪些功能原件，各有什么生物

學(xué)功能?(1)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶在啟動(dòng)子部位啟動(dòng)RNA轉(zhuǎn)錄的過

程.(2)終止子轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)以后的轉(zhuǎn)錄過程并不是永無止境的，會(huì)受到模板DNA

序列結(jié)構(gòu)的影響，當(dāng)遇到經(jīng)環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)轉(zhuǎn)錄便會(huì)終止，或遇到P因子介導(dǎo)的終

止信號(hào)轉(zhuǎn)錄也會(huì)終止.⑶核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄出來的mRNA可在宿主細(xì)胞

的翻譯機(jī)器作用下翻譯出目的蛋白.9.簡述利用YAC克隆載體構(gòu)建基因文庫

的原理.當(dāng)用BamHI切割成線狀后，就形成了一個(gè)微型酵母染色體,包含染

色體復(fù)制的必要順式元件，如ARS.著絲粒和位于兩端的端粒.當(dāng)再用EcoRI

或SmaI切割抑制基因sup4內(nèi)部的位點(diǎn)后形成染色體的兩條臂，與外源大

片段DNA在該切點(diǎn)相連就形成一個(gè)大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入到

酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中去，達(dá)到克隆

大片段DNA的目的.裝載了外源DNA片段的重組子導(dǎo)致sup4插入失活，從

而形成紅色菌落;而載體自身連接后轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞后形成白色菌落.這些

紅色的裝載了不同外源DNA片段的重組酵母菌菌落的群體就構(gòu)成了YAC

文庫.

10.BAC克隆載體有哪些顯著的優(yōu)點(diǎn)?BAC載體的低拷貝性可以避免嵌

合體的產(chǎn)生，并且還可以減少外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作

用.BAC載體可以通過a-互補(bǔ)的原理篩選含有插入片段的重組子，并設(shè)計(jì)了

用于回收克隆DNA的Notl酶切位點(diǎn)和用于克隆DNA片段體外轉(zhuǎn)錄的SP6

啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子.BAC與YAC和PAC相似,沒有包裝限制，因此可接受基因

組DNA大小也沒有固定的限制.

11.何為a-互補(bǔ)，如何利用a-互補(bǔ)來篩選插入了外源DNA的重組質(zhì)

粒?a-互補(bǔ)是指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近

操縱基因區(qū)段的b-半乳糖甘酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ).a-互補(bǔ)是基于

在兩個(gè)不同的缺陷b-半乳糖昔酶之間可實(shí)現(xiàn)的功能互補(bǔ)而建立的.將缺失

編碼第11-41位氨基酸的8-半乳糖昔酶基因稱為lacZAM15基因而將半乳

糖昔酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和編碼8-半乳糖甘酶N端140個(gè)氨基酸的序

列稱為LacZ'.這兩個(gè)基因的產(chǎn)物單獨(dú)存在時(shí)都無酶學(xué)活性，但混合在一

起時(shí)卻有酶學(xué)活性.所以在載體上加lacZ'/(MSC),并在受體菌中引入

lacZ△M15即可實(shí)現(xiàn)a-互補(bǔ).IPTG是lac操縱子的誘導(dǎo)物，底物X-gal被b-半

乳糖普酶分解后可以產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，使菌落呈現(xiàn)蘭色.如果質(zhì)粒載體中插入

了外源DNA,lacZ'的產(chǎn)物則不能與lacZAM15的產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)a-互補(bǔ)，在

IPTG誘導(dǎo)下不能產(chǎn)生有活性的b-半乳糖甘酶，

菌落便不可能呈現(xiàn)蘭色.白色菌落便是含有插入了外源DNA的重組質(zhì)

粒.因此可利用菌落顏色變化來篩選插入了外源DNA的重組質(zhì)粒以5.Ti質(zhì)粒

為什么可以作為植物的表達(dá)載體:T-DNA區(qū)只存在于植物細(xì)胞核中，占Ti質(zhì)

粒DNA總長度的10%左右，而且已知植物冠瘦瘤細(xì)胞中冠瘦堿的合成和不

依賴于植物激素的生長能力，都是由編碼在T-DNA上的基因控制的.顯而易

見，根瘤土壤桿菌通過Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化作用實(shí)現(xiàn)了植物基因的遺傳轉(zhuǎn)移，所以

Ti質(zhì)粒有可能用作植物基因克隆的載體.

12.核酸分子標(biāo)記的方法，各有何特點(diǎn)1)放射性標(biāo)記.是最早使用的核酸

分子標(biāo)記,檢測靈敏度高，但因?yàn)橛蟹派湫裕瑢?duì)操作人員危害大.2)非放射性標(biāo)

記,包括生物素和地高辛.使用安全、方便，標(biāo)記的探針可保存并可重復(fù)使用、

便于控制顯色反應(yīng)、顯色后的雜交膜可長期保存、雜交信號(hào)的灰度明顯(特

別是菌落雜交中易于辨別真假陽性）.但其檢測靈敏度不夠高,而且雜交膜不

易二次或多次雜交.12.一個(gè)具有卡那霉素（Kan）和氨革青霉素（Amp）抗性基

因的質(zhì)粒,Bglll酶切位點(diǎn)在Ampr基因中.將Bglll酶切質(zhì)粒DNA和Bglll酶切

的果蠅（Drosophil

a）DNA進(jìn)行退火,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，回答下列問題:①在培養(yǎng)基中需

要加入哪種抗生素才能保證篩選出含有質(zhì)粒的克隆?（卡那霉素）②在平板

上生長的菌落是具有哪種抗生素抗性的?（卡那霉素）③DrosophilaDNA具有

哪種表型?如何篩選具有這一表型的克隆?DrosophilaDNA具有卡那霉素抗

性,沒有氨葦青霉素抗性.可以將在卡那霉素培養(yǎng)基平板上的菌落影印到氨

革青霉素培養(yǎng)基平板上.能同時(shí)在兩種培養(yǎng)基中生長的為含有空質(zhì)粒的大

腸桿菌，能在卡那霉素培養(yǎng)基平板上生長而不能在氨葦青霉素培養(yǎng)基平板

上生長的為DrosophilaDNA的克隆.14.酵母表達(dá)載體（均為E.coli和酵母菌的

穿梭載體）:細(xì)菌部分（原核構(gòu)件）:質(zhì)粒Ori、特定的抗生素抗性基因（ampr、

tetr）.酵母部分（真核構(gòu)件）:與宿主互補(bǔ)的營養(yǎng)缺陷型基因（his3、Ieu2、trpl）

或特定的抗生素抗性基因（Zeocinr）、編碼特定蛋白（A0X1）的啟動(dòng)子和終止子

序列16.哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的條件:①具有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)制起始點(diǎn)，使表

達(dá)載體能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，從而增加外源基因表達(dá)拷貝數(shù);②具有可供選擇的

標(biāo)記基因，篩選出轉(zhuǎn)染有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化克隆;③具有外源基因表達(dá)所必需

的全部順式結(jié)構(gòu)，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子剪切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止子，多聚

腺昔酸信號(hào);④在啟動(dòng)子下游有多種單一內(nèi)切酶位點(diǎn),可供插入外源基因;⑤

含有細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)和抗性基因以便能在細(xì)菌中擴(kuò)增和選擇18.pBR322

質(zhì)粒載體:特點(diǎn):人工構(gòu)建;帶有多種抗藥性標(biāo)記;低Mr;高拷貝;外源DNA插

入不影響復(fù)制功能的多種限制性核酸內(nèi)切酶單切割位點(diǎn).組成:PSF2124質(zhì)

粒Tn3的ampr;pSC101質(zhì)粒的tetr;ColEl的派生質(zhì)粒pMBl的質(zhì)粒

oril9.pUC質(zhì)粒載體:組成:pBR質(zhì)粒的ori;ampr基因;lacZ'基因;位于lacZ'

基因靠近5'-端的一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)段.特點(diǎn):更小的相對(duì)分子質(zhì)量和

更高的拷貝數(shù);可用組織化學(xué)方法檢測重組體(a-互補(bǔ)篩選);具有多克隆位

點(diǎn)MCS區(qū)段，可把兩種不同粘性末端的外源DNA片斷直接克隆到上面20.

以pB322質(zhì)粒為載體，從四環(huán)素抗性基因(tetr)區(qū)克隆外源DNA時(shí)，可采用環(huán)

絲氨酸富集法篩選重組體，請說明其基本原理和基本操作過程？答:基本原

理:由于四環(huán)素的作用是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，而不是殺死細(xì)菌;而氨基酸

類似物環(huán)絲氨酸如果摻入蛋白質(zhì)，則是致命的.因此再有四環(huán)素的條件下，環(huán)

絲氨酸能夠殺死tetr而不殺死tets的細(xì)菌.經(jīng)過環(huán)絲氨酸處理后，存活的細(xì)

胞中tets型得到很大的富集，而經(jīng)過若干次連續(xù)處理,既能獲得在基因內(nèi)含

有插入物的質(zhì)粒的細(xì)胞.基本操作:①轉(zhuǎn)化后有三種表型的細(xì)菌，其中只有一

種是重組體AprTcs.②用重組DNA轉(zhuǎn)化受體菌后，將受體菌培養(yǎng)在加有四環(huán)

素和環(huán)絲氨酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，此時(shí)只有非重組的雙抗性菌可以生長，其他

都被抑制.③由于有環(huán)絲氨酸的存在,AprTcs表型的菌生長到一定程度就會(huì)

死亡.④由于四環(huán)素只有抑菌而無殺菌的作用，此時(shí)若解除四環(huán)素(離心洗

滌),加入氨基葦青霉素繼續(xù)培養(yǎng)，則可使重組體大量生長.第四章1.同其他蛋

白酶相比，使用蛋白酶K的優(yōu)點(diǎn)在哪里？蛋白酶K可以水解范圍廣泛的肽鍵,

尤其適合水解竣基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之間的肽鍵.可有效

降解內(nèi)源蛋白，能快速水解細(xì)胞裂解物中的DNase和RNase,常用于去除殘

留的酶類及樣品中的蛋白質(zhì).在SDS和EDTA中仍保持高活性,可以同SDS和

EDTA同時(shí)使用2.在提取過程中應(yīng)如何避免大分子DNA的降解和斷裂？1）

添加酶抑制劑抑制核酸酶活性，如EDTA等,可以同Mg2+螯合,使核酸酶失去

作用的輔助因子,而被抑制活性.2）溫和操作.3）加保護(hù)劑，如蔗糖可增加緩沖

液的黏度，保護(hù)DNA不易斷裂.3.用酚/氯仿抽提DNA時(shí),通常要在氯仿或酚/

氯仿中加入少許異戊醇,原因是什么？異戊醇是一種有機(jī)試劑，可以降低表

面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生.另外，異戊醇有助于分相使離心后的上層含DNA

的水相，中間的性變蛋白質(zhì)相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定.4、酚與氯仿聯(lián)合

使用的好處？原因是酚和水有一定程度的互溶,所以單獨(dú)使用酚抽提DNA,

最終不能除去酚,殘留的酚會(huì)使起切割和連接作用的限制性內(nèi)切核酸酶和

連接酶變性.氯仿也是蛋白質(zhì)變性劑,它不與水互溶，但是能夠同苯酚互溶.

這樣，酚和氯仿聯(lián)合使用，就可以帶走殘留的酚.

1.印跡分子雜交有哪些種類，并說明在什么情況下需要使用這些方法.

答:Southern雜交是以DNA或RNA為探針，檢測DNA鏈，用于外源基因整合

的鑒定及分析.Northern雜交是以DNA或RNA為探針，檢測RNA鏈,用于外

源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異mRNA的檢測.Western雜交是利用抗原與抗體的特異

結(jié)合的原理檢測外源基因表達(dá)產(chǎn)物特異蛋白質(zhì)的生成2.基因定點(diǎn)誘變有哪

些種類，各有何特點(diǎn):基因定點(diǎn)突變（包括:盒式誘變、寡核甘酸引物誘變、PCR

誘變:重疊延伸PCR和大引物PCR）（site-directedmutagenesi

s）是使已克隆基因或DNA片段中任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或

缺失突變的過程.1）盒式誘變:簡單易行，突變效率高，但在靶DNA區(qū)段的兩側(cè)

需存在一對(duì)限制性內(nèi)切核酸酸酶單切點(diǎn)2）寡核甘酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變:寡核

甘酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變可以在任何感興趣的位置加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn);能

夠把一個(gè)自然條件下從未被發(fā)現(xiàn)的突變精確放置在靶基因的特定

位置.3）PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變:優(yōu)點(diǎn):①突變體回收率高;②快速簡便;③高

溫度的利用,可降低模板形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的幾率;④幾乎所有的反應(yīng)可以在同

一只試管中進(jìn)行缺點(diǎn):①PCR會(huì)產(chǎn)生一定程度的錯(cuò)配（非預(yù)定的）②Taq酶常

在末端加一個(gè)A③對(duì)每套引物和模板需優(yōu)化PCR條件④標(biāo)準(zhǔn)PCR不能有

效擴(kuò)增>3kb的DNA片段3.在做Southern印跡分析時(shí)，有同學(xué)為了節(jié)省時(shí)

間,做完凝膠電泳這一步，沒有根據(jù)方案用NaOH溶液浸泡凝膠使DNA變性

為單鏈，而是略過了這一步直接將DNA從凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上，然后用標(biāo)記

探針雜交,最后發(fā)現(xiàn)放射自顯影膠片是空白的.試分析該同學(xué)錯(cuò)在哪里?雜

交探針是雙鏈的,可能因?yàn)樵诩尤穗s交混合物之前忘記將探針變性而得到

空白的放射自顯影結(jié)果.4.建立了一個(gè)文庫后，如何鑒定一個(gè)攜帶目的基因

的克隆?帶有某一細(xì)菌基因的克隆通常可以直接看出來，因?yàn)榛虮磉_(dá)引起

了宿主細(xì)胞表型的可見變化.然而，真核生物的基因不都表達(dá)，則需用相應(yīng)的

方法來找出帶有所需基因特定克隆.一個(gè)常用方法是雜交⑴從不同的克隆

提取DNA,固定于硝酸纖維素濾膜上,然后用NaOH使之變性⑵探針必須能

與所需的基因互補(bǔ)且被32P標(biāo)記.探針可以是來自另一不同生物體的相關(guān)

的基因，或是依據(jù)與基因特異相關(guān)蛋白質(zhì)的氨基酸序列設(shè)計(jì)并經(jīng)化學(xué)合成

的一小段DNA分子⑶探針只會(huì)與特定基因進(jìn)行堿基配對(duì)（雜交），沖洗濾膜

后，未結(jié)合上的標(biāo)記探針會(huì)被除去⑷烘干濾膜后進(jìn)行放射自顯影后,所需的

克隆就以一個(gè)黑點(diǎn)在膠片上顯示出來,這就是菌落或原位雜交分析.5.單核

昔酸置換插入或缺失中，引物設(shè)計(jì)的要求？5?端完全配對(duì)，使得上游（引物）起

始的DNA合成不容易將誘變寡核甘酸取代，約需8-10bp.3?端所形成的雜交

體足以引導(dǎo)DNA合成.如果錯(cuò)配核昔酸太靠近3?端,3?端將不能形成穩(wěn)定的

雜交體，易被外切活性降解.所以3?端需有9bp完全配對(duì).為便于篩選，應(yīng)選用

可形成穩(wěn)定雜交體而長度最短的誘變寡核甘酸.一般17-19bp,錯(cuò)配在中央，

使得完全配對(duì)的雜交體與錯(cuò)配雜交體之間的熱穩(wěn)定性差異足夠大6DNA

誘變有哪些種類洛有何特點(diǎn)?⑴隨機(jī)誘變:目的基因的DNA片段中引入了

大量的序列多樣性,得到的具體突變體可以是單點(diǎn)突變也可能是多點(diǎn)突變.

⑵寡核甘酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變:寡核昔酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變可以在任何感興趣

的位置加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn);能夠把一個(gè)自然條件下從未被發(fā)現(xiàn)的突變

精確放置在靶基因的特定位置.7.DNaseI足跡試驗(yàn)主要步驟:①用32P標(biāo)記

DNA雙鏈末端，并用RE切去一端;②加入細(xì)胞特定周期蛋白質(zhì)提取物，溫育；

③加入適量DNasel或硫酸二甲酯-六氫毗咤，使DNA鏈發(fā)生斷裂.這一反應(yīng)

中,DNasel或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵，要保證一條DNA鏈只發(fā)生一次斷

裂;④沉淀DNA（包括與DNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)）;⑤進(jìn)行DNA凝膠分析.

第五章1.簡述以質(zhì)粒為載體構(gòu)建基因文庫的基本步驟?①總DNA的提

取;②載體的制備.純化;③基因組DNA的不完全消化;④載體與外源DNA片

斷的連接;⑤轉(zhuǎn)化受體菌，然后在有選擇壓力的平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了外源基因

的受體菌;⑥重組子的鑒定;⑦外源DNA進(jìn)行分析2構(gòu)建了基因文庫后，有哪

些方法可以篩選或鑒定出哪一個(gè)克隆可能含有目的基因?①表型篩選法:是

在宿主菌（大腸桿菌）中表達(dá)目的基因，使宿主產(chǎn)生新的表型或使宿主恢復(fù)其

突變基因的表型來篩選目的基因.

②用核酸探針篩選目的cDNA（基因）:對(duì)欲克隆的基因序列了解時(shí)，以目

的基因的部分序列（DNA片段）制備探針，對(duì)文庫進(jìn)行篩選.③免疫篩選（抗體

篩選)目的基因:如果能夠得到目的基因產(chǎn)物的抗體，就可以通過免疫學(xué)的方

法來篩選目的基因.其使用的探針不是核酸，而是特異性抗體.④利用數(shù)據(jù)庫

鑒定基因:將DNA序列輸入GenBank與已知的基因序列進(jìn)行比較.⑤酵母雙

雜交系統(tǒng)鑒定基因:是根據(jù)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控特點(diǎn)創(chuàng)建的一種體內(nèi)鑒定基

因的方法，其篩選的基因不是“探針”的直接編碼產(chǎn)物，而是能夠與其相互

作用的蛋白質(zhì)的編碼基因，即篩選與已知基因產(chǎn)物發(fā)生相互作用的蛋白的

編碼基因.3.在基因工程中，為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因產(chǎn)物，為

什么通常要用cDNA而不用基因組DNA?為什么要在cDNA前加上細(xì)菌的啟

動(dòng)子?cDNA是mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，與基因組DNA相比，沒有了啟動(dòng)子和內(nèi)

含子.因?yàn)榧?xì)菌沒有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)，并且不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子，所以

要使用CDNA.有因?yàn)閏DNA上沒用啟動(dòng)子，所以要加上細(xì)菌的啟動(dòng)子，保證其

能正確轉(zhuǎn)錄.5.扣除雜交?其基本原理是?概念:將含目標(biāo)基因的組織或器官

的mRNA群體作為待測樣本(Tester),將基因表達(dá)譜相似或相近但不含目標(biāo)

基因的組織或器官的mRNA群體作為對(duì)照樣本(Driver),將Tester和Driver

的cDNA進(jìn)行多次雜交，去掉在二者之間都表達(dá)的基因，而保留二者之間差

異表達(dá)的基因.原理:一種細(xì)胞的總mRNA反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA與另一細(xì)

胞的總mRNA混合形成cDNA-RNA雜交分子通過羥基磷灰石柱被扣除，

未雜交的單鏈cDNA流出柱子外，其對(duì)應(yīng)的低豐度mRNA得以克隆.11.如

何以E.coli質(zhì)粒DNA為載體克隆一個(gè)編碼動(dòng)物激素的基因并使之在E.coli

中進(jìn)行表達(dá)?簡要說明實(shí)驗(yàn)中可能遇到的問題及可能的解決辦法?要使動(dòng)物

中編碼激素的基因在大腸桿菌中表達(dá)，通常遇到的問題有:⑴細(xì)菌的RNA聚

合酶不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子.(2)大多數(shù)真核基因有內(nèi)含子，這些內(nèi)含子

在轉(zhuǎn)錄后從前體mRNA中被切除而形成成熟mRNA.細(xì)菌細(xì)胞沒有這樣的機(jī)

制來去除內(nèi)含子.⑶有些真核生物的蛋白質(zhì)是通過前體分于加工而來的，例

如胰島素就是通過加工去除前體分子內(nèi)部的33個(gè)氨基酸殘基而來,剩下的

兩段肽鏈分別形成胰島素的a.b鏈.(4)產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以被

細(xì)菌的蛋白酶所識(shí)別和降解.

針對(duì)上述可能出現(xiàn)的問題，建議在克隆的過程中采取以下措施:①應(yīng)將

激素的編碼序列置于含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子ATG的細(xì)菌強(qiáng)啟動(dòng)

子的附近②可以以激素的mRNA為模板用反轉(zhuǎn)錄酶合成激素的基因.這種

DNA不含內(nèi)含子可插入到載體中進(jìn)行克隆.此外，如果蛋白質(zhì)序列短則可通

過化學(xué)合成得到該基因.合成的基因應(yīng)含起始密碼ATG.通過該激素蛋白的

氨基酸序列推測而來的編碼序列，以及1-2個(gè)終止密碼:ATG——編碼序列

——TGATAG.現(xiàn)在，這個(gè)合成基因可被插入載體中.③有時(shí)加工過程可以在

離體條件下進(jìn)行.如果加工有困難，可以用合成基因，從而免除加工過程.④

選用合適

的突變型宿主從而防止蛋白酶水解.如果用酵母作為宿主上述許多問

題都可以較容易地解決,尤其是現(xiàn)在有既能在大腸桿菌中又能在酵母中復(fù)

制的穿梭質(zhì)粒載體.基因組文庫，構(gòu)建文庫的要求：(1)DNA的純度要比較高.

如果DNA含雜質(zhì)多，會(huì)嚴(yán)重影響后面的內(nèi)切酶消化.(2)要求制備的DNA片段

要達(dá)到50?lOOkb,然后用內(nèi)切酶切成10?20kb的片段，以保證基因的完整

和基因兩端有內(nèi)切酶位點(diǎn),切割后出現(xiàn)粘性末端，便于連接.(3)要求有較大數(shù)

量的克隆，才能保證每一個(gè)基因都包含在文庫中,25.建立CDNA文庫的步驟

答:細(xì)胞總RNA的制備及mRNA的分離、cDNA第一條鏈的合成、雙鏈cDNA

的合成、雙鏈CDNA與載體的連接和噬菌體顆粒的包裝及感染宿主細(xì)胞.通

過一系列酶催化作用,Poly(A)

mRNA轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，轉(zhuǎn)化大腸桿

菌寄主細(xì)胞，構(gòu)成包含所有基因編碼序列的cDNA基因文庫.

第六章1.重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞1)重組DNA導(dǎo)入酵母菌細(xì)胞⑴原生

質(zhì)體轉(zhuǎn)化法:早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)

化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%.但該程序

操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

的一個(gè)顯著特點(diǎn)是，一個(gè)受體細(xì)胞可同時(shí)接納多個(gè)質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)

化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25-33%(2)堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)

胞的轉(zhuǎn)化:釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子(如Li+等)、PEG、熱休克處理

后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA,而且具有下面的特性:吸收線性DNA的能力明顯

大于環(huán)狀DNA,兩者相差80倍;共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見

(3)酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法:酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下

吸收質(zhì)粒DNA,但在此過程中應(yīng)避免使用PEG,它對(duì)受電擊的細(xì)胞具有較很

大的負(fù)作用.電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件

適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105/mgDNA.2、如何將一平末端的DNA片

段與EcoRI形成的黏性末端連接？答:平末端可調(diào)整反應(yīng)條件用DNA連接酶

實(shí)現(xiàn)片段之間的連接.非互補(bǔ)的粘性末端的連接須修飾成平端，再按平端連

接法連接1.同聚物加尾法:利用末端轉(zhuǎn)移酶可催化dNTP力口到ssDNA或

dsDNA3'-0H,在外源DNA和載體3'-末端加上互補(bǔ)的同聚物尾巴2銜接

物連接法.3.接頭分子連接法:將具有平末端的外源DNA片段與人工接頭分

子在T4DNA連接酶的作用下連接起來;然后與具有同樣粘性末端的載體

DNA分子在T4DNA連接酶作用下連接成重組體（我以為以上方法皆可，也可

將粘性末端平移成平末端）3、通過插入失活可以初步篩選重組子，但篩選到

的克隆是否插入了正確的片段，還需要進(jìn)一步的鑒定,鑒定的方法主要有哪

幾種？答：1限制性內(nèi)切酶法:外源片段通過特定的酶切位點(diǎn)插入到載體上,

因此，可以通過這些限制性酶酶切重組質(zhì)粒，電泳分析插入片段長度是否正

確.2PCR法:如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通過PCR的方法進(jìn)

行鑒定.3菌落原位雜交法.4基因產(chǎn)物檢測法:如果使用的是表達(dá)載體，那

么就可以通過鑒定基因產(chǎn)物的方法鑒定正確的克隆.4、在重組DNA操作中

為了提高連接效率常常將非互補(bǔ)的黏性末端修飾成平末端之后再進(jìn)行連

接.請問將黏性末端變?yōu)槠蕉说姆椒ㄓ心男?？答：?）5'-突出粘性末端的補(bǔ)

平，一般選擇大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow大片段聚合酶進(jìn)行填補(bǔ)乂2）3'

-突出粘性末端的切平，一般使用T4噬菌體DNA聚合酶或單鏈DNA的S1核

酸酶切平.變成平末端之后，同樣可用DNA連接酶進(jìn)行有效的連接.27.重組

DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞（大腸桿菌）的方法①CaCI2法制備感受態(tài)細(xì)胞②電轉(zhuǎn)

化法③PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法④結(jié)合轉(zhuǎn)化法28.重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)

胞（酵母菌細(xì)胞）的方法與特點(diǎn)⑴重組DNA導(dǎo)入酵母菌細(xì)胞:特點(diǎn)是,一個(gè)受

體細(xì)胞可同時(shí)接納多個(gè)質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總

數(shù)的25-33%.⑵堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化:特點(diǎn):吸收線性

DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA,兩者相差80倍;共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見⑶酵母

菌電擊轉(zhuǎn)化法:優(yōu)點(diǎn)是不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍

廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105/mgDNA.29.重組DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法⑴原

生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法（聚乙二醇（PEG）法）:宿主細(xì)胞為原生質(zhì)體比較適宜⑵電擊穿

孔法:操作簡便，導(dǎo)入效率較高⑶基因槍法:優(yōu)點(diǎn)可用于愈傷組織、葉片、莖

尖等組織的轉(zhuǎn)化,而不必是原生質(zhì)體;缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率不高.⑷花粉管通道法：

可避免植物組織培養(yǎng)步驟.⑸超聲波法⑹農(nóng)桿菌介導(dǎo)法:利用農(nóng)桿菌T-DNA

可自動(dòng)轉(zhuǎn)移并整合到植物細(xì)胞基因組中的特性，將外源目的基因?qū)胫参?/p>

細(xì)胞的方法.30.重組DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法1）顯微注射法2）逆轉(zhuǎn)錄病毒

法3）胚胎干細(xì)胞法:優(yōu)點(diǎn)是通過同源重組構(gòu)建的轉(zhuǎn)染能夠進(jìn)行打靶即在體

外就能確定整合的位點(diǎn),克服了顯微注射無法解決的隨機(jī)整合問題.第七章

（一）真核生物基因表達(dá)載體的組成特征①原核DNA序列:包括能在大腸桿

菌中復(fù)制的Ori以及便于篩選的細(xì)菌抗生素抗性基因和便于目的基因插入

的多克隆位點(diǎn)MCS.②啟動(dòng)子與增強(qiáng)子:啟動(dòng)子分為組成型啟動(dòng)子

、組織特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子.增強(qiáng)子對(duì)于異源啟動(dòng)子控制下

的外源基因也具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用，因此，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的聯(lián)合使用可大

大提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平.大多數(shù)增強(qiáng)子具有組織特異性,在構(gòu)建表達(dá)載

體時(shí)使用宿主細(xì)胞相應(yīng)組織部位的增強(qiáng)子以激活外源基因的表達(dá),提高表

達(dá)效率.③終止子:不同來源的終止子對(duì)外源基因的表達(dá)有很大影

響，它不僅決定外源基因轉(zhuǎn)錄活性也決定mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性,從而影

響mRNA的翻譯.④內(nèi)含子剪接信號(hào):雖然許多基因的的cDNA轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物

細(xì)胞后，其表達(dá)不受有無內(nèi)含子的影響，有些基因的表達(dá)需要內(nèi)含子的存在.

一般來說,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體中最好有一段內(nèi)含子序列包括剪接

信號(hào)以提供外源基因cDNA表達(dá)的需要.⑤polyA加尾信號(hào):polyA可防止核

酸酶對(duì)mRNA3?末端的降解,增力口mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性.RNA聚合酶II

穿過polyA位點(diǎn)，直到成熟mRNA3?端的下游才終止轉(zhuǎn)錄.當(dāng)表達(dá)載體缺少

polyA位點(diǎn)的序列時(shí)，外源基因的表達(dá)下降10倍以上.⑥選擇標(biāo)記基因與報(bào)

告基因:在選擇壓力下，選擇標(biāo)記基因可以使少量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞從未轉(zhuǎn)化的細(xì)

胞中分離出來.但選擇標(biāo)記基因的

應(yīng)用也有其自身無法克服的缺陷2啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的異同點(diǎn):啟動(dòng)子：

是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的一段DNA序列，位于基因的上游.是基因表達(dá)調(diào)

控的重要順式元件，具有以下特征:①序列特異性;②方向性;③位置特異性；

④種屬特異性增強(qiáng)子（enhancer）:是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的一段DNA序

列，由多個(gè)元件組成,每一個(gè)元件可以與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合.特點(diǎn):

雙向作用,無位置效應(yīng);提高轉(zhuǎn)錄效率;遠(yuǎn)距離起作用;組織特異性（可能特定

組織才有識(shí)別并結(jié)合的反式作用因子）無基因特異性（同源基因異源基因均

可）3、影響外源基因表達(dá)的因素有哪些？它們是如何影響外源基因表達(dá)

的：（一）閱讀框架對(duì)轉(zhuǎn)化基因的影響:閱讀框架是基因的編碼區(qū)，包含從ATG

到TAA之間的CDNA序列.外源基因的編碼區(qū)只有與表達(dá)載體DNA的起始密

碼子相吻合時(shí)才能正確的翻譯出蛋白質(zhì).（二）基因表達(dá)的調(diào)控元件:包括啟

動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、終止子和衰減子.（三）翻譯過程對(duì)基因表達(dá)的影響：

影響因素包括翻譯起始區(qū)、密碼子（起始和終止）、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（四）表

達(dá)系統(tǒng)對(duì)基因表達(dá)的影響:外源基因表達(dá)系統(tǒng)泛指目的基因與表達(dá)載體重

組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞并能在其中表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物（目的蛋白）.

因此表達(dá)載體和受體細(xì)胞共同組成了外源基因的表達(dá)系統(tǒng).外源基因的表

達(dá)除受到表達(dá)載體的影響外，還受到受體細(xì)胞生長特性、表達(dá)水平、翻譯后

修飾及生物活性物質(zhì)形成等影響.4.大腸桿菌作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)有哪

些優(yōu)缺點(diǎn)？答:優(yōu)勢:遺傳背景清楚:全基因組測序，共有4405個(gè)開放型閱讀

框架;繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定;基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟

完善;目標(biāo)基因表達(dá)水平高;代謝途徑和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚.缺點(diǎn)：

缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能;缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系

統(tǒng);內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白;細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁

多的內(nèi)毒素5、真核生物表達(dá)載體通常需要哪些構(gòu)件？各構(gòu)件的作用是什

么？答：1.原核DNA序列:包括能在大腸桿菌中復(fù)制的Ori以及便于篩選的細(xì)

菌抗生素抗性基因和便于目的基因插入的多克隆位點(diǎn)MCS.2.啟動(dòng)子與增

強(qiáng)子:增強(qiáng)子對(duì)于異源啟動(dòng)子控制下的外源基因也具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用，因

此，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的聯(lián)合使用可大大提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平.3.終止子：

不同來源的終止子對(duì)外源基因的表達(dá)有很大影響，它不僅決定外源基因轉(zhuǎn)

錄活性也決定mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性，從而影響mRNA的翻譯4內(nèi)含子剪

接信號(hào):雖然許多基因的的CDNA轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，其表達(dá)不受有無內(nèi)

含子的影響,有些基因的表達(dá)需要內(nèi)含子的存在.一般來說，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞

的表達(dá)載體中最好有一段內(nèi)含子序列包括剪接信號(hào)以提供外源基因cDNA

表達(dá)的需要.5.polyA加尾信號(hào):polyA可防止核酸酶對(duì)mRNA3?末端的降解,

增加mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性6選擇標(biāo)記基因:只有采取有效的篩選方法,

才能高效準(zhǔn)確地將少量的轉(zhuǎn)化子從大量未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離出來.一般情況

下，載體上攜帶的選擇基因可供細(xì)胞篩選使用.第九章1.植物/動(dòng)物轉(zhuǎn)基因

的方法及其各自的特點(diǎn):動(dòng)物轉(zhuǎn)基因有：1）顯微注射法2）逆轉(zhuǎn)錄病毒法3）胚

胎干細(xì)胞法4）體細(xì)胞核移植法2.構(gòu)建了基因文庫后，有哪些方法可以篩選

或鑒定出哪一個(gè)克隆可能含有目的基因？答：1）表型篩選法:是在宿主菌（大

腸桿菌）中表達(dá)目的基因,使宿主產(chǎn)生新的表型或使宿主恢復(fù)其突變基因的

表型來篩選目的基因.2）用核酸探針篩選目的cDNA（基因）:對(duì)欲克隆的基因

序列了解時(shí)，以目的基因的部分序列（DNA片段）制備探針，對(duì)文庫進(jìn)行篩選.3）

免疫篩選（抗體篩選）目的基因:如果能夠得到目的基因產(chǎn)物的抗體,就可以

通過免疫學(xué)的方法來篩選目的基因.其使用的探針不是核酸,而是特異性抗

體.4）利用數(shù)據(jù)庫鑒定基因:將DNA序列輸入GenBank與已知的基因序列進(jìn)

行比較.5）酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定基因:是根據(jù)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控特點(diǎn)創(chuàng)建的

一種體內(nèi)鑒定基因的方法，其篩選的基因不是“探針”的直接編碼產(chǎn)物，而

是能夠與其相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因，即篩選與已知基因產(chǎn)物發(fā)生相

互作用的蛋白的編碼基因.3.在構(gòu)建cDNA克隆之前,可以用（差示雜交）來富

集一特殊的核昔酸序列等.做法是:用來自能夠產(chǎn)生目的蛋白的細(xì)胞mRNA

分子同來自于另一類型細(xì)胞（不產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)但親緣關(guān)系密切）的過量

mRNA分子雜交.4.在基因工程中，為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因

產(chǎn)物，為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA?為什么要在cDNA前加上

細(xì)菌的啟動(dòng)子？答:原核生物一般不含內(nèi)含子,在原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞

的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng).當(dāng)克隆的含有內(nèi)含子的真核基因在原核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成

mRNA前提后，其中內(nèi)含子部分不能被切除，所以在原核細(xì)胞中表達(dá)真核基

因時(shí)不能用基因組DNA,而用cDNA.原核生物只有一種RNA聚合酶，識(shí)別原

核生物的啟動(dòng)子，催化所有RNA的合成，不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子.5.外源

基因在大腸桿菌（原核細(xì)胞）中高效表達(dá)的策略1.有效的轉(zhuǎn)錄起始2.mRNA

的有效延伸和轉(zhuǎn)錄終止3.翻譯水平的優(yōu)化4.提高表達(dá)質(zhì)粒（或載體）的拷貝

數(shù)及穩(wěn)定性5.提高外源蛋白的穩(wěn)定性6.外源基因在酵母菌（真核細(xì)胞）中的

表達(dá)優(yōu)勢答:①完成全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚;②大規(guī)模發(fā)

酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉;③能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分

泌至培養(yǎng)基中;④具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng);⑤不

含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素,被認(rèn)定為是安全的;酵母菌是最簡單的真

核模式生物7.天然的Ti質(zhì)粒不能作為表達(dá)載體使用的原因:答a.植物轉(zhuǎn)化

細(xì)胞產(chǎn)生大量的生長素和分裂素，阻止了生長在培養(yǎng)基上的細(xì)胞再生長為

整株植物，因此，必須除去生長素和分裂素基因.b.有機(jī)堿的合成與T-DNA

的轉(zhuǎn)化無關(guān)，而且會(huì)影響植物細(xì)胞生長，因?yàn)橛袡C(jī)堿合成大量消耗精氨酸和

谷氨酸，因此必須去除有機(jī)堿合成基因(tmt).c.Ti質(zhì)粒過大，重組操作非常困

難，也很難找到單一的酶切位點(diǎn).d.Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制.8.運(yùn)用

所學(xué)知識(shí)制備胰島素:答:選定具有免疫原型的胰島素基因片段，將其插入表

達(dá)載體，并引入到與表達(dá)載體相應(yīng)的宿主細(xì)胞，構(gòu)成重組體.重組體在合適的

環(huán)境下培養(yǎng),就可以表達(dá)、加工、生產(chǎn)出胰島素.⑴大腸桿菌制備胰島素:胰

島素A、B鏈的基因序列分開導(dǎo)入大腸桿菌，發(fā)酵后收集A、B鏈，通過體外

將A、B鏈用二硫鍵連