細胞生物學(xué)常用技術(shù)

細胞生物學(xué)常用實驗技術(shù)

當(dāng)前1頁，總共99頁。

cellularlevelSubcellularlevel

Molecularlevel當(dāng)前2頁，總共99頁。當(dāng)前3頁，總共99頁。

顯微技術(shù)細胞分離技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞組分的分級分離細胞示蹤技術(shù)細胞分子生物學(xué)技術(shù)當(dāng)前4頁，總共99頁。一、顯微鏡技術(shù)microscopy

μm

微米

=10-6m

nm

納米

=10-9m

?

埃

=10-10m

(一)光學(xué)顯微鏡技術(shù)

利用光線照明,將微小物體形成放大影像的儀器

當(dāng)前5頁，總共99頁。1.顯微鏡的分辨率顯微鏡或人眼在25cm的明視距離處,能分辨被檢物體微細結(jié)構(gòu)最小間隔的能力。

d=

光學(xué)顯微鏡的分辨極限0.2μm0.61λ

nsinθ

當(dāng)前6頁，總共99頁。100μm0.2μm當(dāng)前7頁，總共99頁。2.光鏡標(biāo)本切片的制備

(1)

固定

定義：將組織浸入化學(xué)試劑中，通過在細胞中大分子間形成交聯(lián)，保持細胞中原有結(jié)構(gòu)的形態(tài)和位置的過程。

固定的目的：

A防止組織自溶或腐敗

B保持細胞原有的形態(tài)

C保持細胞各種成分的原有位置

常用固定劑：乙醇、甲醛、戊二醛

當(dāng)前8頁，總共99頁。(2)脫水

定義：借助某些化學(xué)溶劑置換組織內(nèi)水分的過程。

常用的脫水劑：酒精

(3)包埋

定義：將組織塊包入包埋劑使組織硬化的過程。常用的包埋劑：液體石蠟、樹脂

(4)切片

1-10μm

當(dāng)前9頁，總共99頁。（5）染色采用某些化學(xué)物質(zhì)特異性或選擇性地與細胞內(nèi)的某些成分相互作用，從而原位顯示細胞某種成分或結(jié)構(gòu)的方法

A選擇性染色

考馬斯亮藍–

蛋白質(zhì)Brachet反應(yīng)

當(dāng)前10頁，總共99頁。hematoxylin-eosin當(dāng)前11頁，總共99頁。B特異性染色

酶+底物

抗原+抗體+substrateantigenantibody************酶標(biāo)記：免疫組織化學(xué)技術(shù)熒光標(biāo)記：免疫熒光技術(shù)當(dāng)前12頁，總共99頁。3.熒光顯微鏡技術(shù)

(1)原理熒光分子在受到光照射后，可吸收特定波長的短波光線，并發(fā)射出比原來吸收波長更長的光

可見光紫外光紅外光shortlongλ

當(dāng)前13頁，總共99頁。（2）熒光顯微鏡的基本構(gòu)造

A紫外光光源

B二向色鏡：反射短波光線，透過長波光線

C濾光片

當(dāng)前14頁，總共99頁。（3）常用的熒光染料

A有機染料熒光素羅丹明

FITC當(dāng)前15頁，總共99頁。B量子點quantumdotⅡ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族元素構(gòu)成的半導(dǎo)體納米結(jié)晶良好的光學(xué)穩(wěn)定性抗光漂白性當(dāng)前16頁，總共99頁。當(dāng)前17頁，總共99頁。當(dāng)前18頁，總共99頁。（4）應(yīng)用

A免疫熒光顯微技術(shù)（Immunofluorescencemicroscopy）抗體+熒光染料

當(dāng)前19頁，總共99頁。當(dāng)前20頁，總共99頁。當(dāng)前21頁，總共99頁。B綠色熒光蛋白GFP

當(dāng)前22頁，總共99頁。當(dāng)前23頁，總共99頁。4.相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）

(1)原理

波長顏色振幅

亮度速度

相位

當(dāng)前24頁，總共99頁。(2)應(yīng)用

活體細胞觀察當(dāng)前25頁，總共99頁。5.激光掃描共焦顯微鏡（Laser

Scanning

ConfocalMicroscope）

(1)原理

在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源，掃描裝置，共軛聚焦裝置和檢測系統(tǒng)而形成的顯微鏡。單色激光光源光源后－照明針孔－點光源檢測器前－探測針孔分層掃描三維重建共扼當(dāng)前26頁，總共99頁。當(dāng)前27頁，總共99頁。

（2）應(yīng)用

A細胞的三維重建

B細胞定量熒光檢測

DNARNA蛋白質(zhì)含量

C細胞內(nèi)Ca2+pH動態(tài)檢測

D細胞間通訊當(dāng)前28頁，總共99頁。果蠅胚胎原腸胚當(dāng)前29頁，總共99頁。當(dāng)前30頁，總共99頁。當(dāng)前31頁，總共99頁。當(dāng)前32頁，總共99頁。（二）電子顯微鏡技術(shù)

利用電子與固體樣品作用時所發(fā)出的信息,

對樣品進行微區(qū)觀察和分析的技術(shù)亞顯微結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)

1.電子顯微鏡的特點

高分辨率

理論上

d=0.002nm

實際上

d=0.1nm

生物標(biāo)本

d=2nm

高放大倍率

1,000,000

當(dāng)前33頁，總共99頁。陰極陽極聚光鏡（電磁透鏡）物鏡中間鏡投影鏡電鏡照片照相底片真空、上下顛倒

2.透射電子顯微鏡（Transmissionelectronmicroscope,TEM）

(1)基本構(gòu)造

當(dāng)前34頁，總共99頁。(2)超薄切片的制備

A固定戊二醛:蛋白質(zhì)鋨酸:C=C(膜結(jié)構(gòu))

當(dāng)前35頁，總共99頁。B脫水上升梯度

乙醇：30%50%70%80%90%95%100%C包埋

單體樹脂加溫聚合

D切片

500–700?

E

重金屬染色

U(醋酸雙氧鈾)Pb(檸檬酸鉛)

當(dāng)前36頁，總共99頁。當(dāng)前37頁，總共99頁。NADP酶反應(yīng)嗜鋨反應(yīng)TPP酶反應(yīng)當(dāng)前38頁，總共99頁。2.掃描電子顯微鏡

（Scanningelectronmicroscopy,SEM）當(dāng)前39頁，總共99頁。(1)原理

二次電子(2)分辨率

3-10nm(3)樣品的制備

A固定

B脫水

C干燥臨界點干燥

D染色AuPt當(dāng)前40頁，總共99頁。當(dāng)前41頁，總共99頁。當(dāng)前42頁，總共99頁。透射電鏡利用穿透標(biāo)本的電子進行成像(散射)觀察組織的二維切片掃描電鏡利用標(biāo)本表面發(fā)射的二次電子成像觀察組織的表面三維結(jié)構(gòu)當(dāng)前43頁，總共99頁。（三）掃描探針顯微鏡

（Scanningprobemicroscope,SPM）1.掃描隧道顯微鏡

使用原子尺度的探針在標(biāo)本表面掃描，在探針針尖和樣品之間施加一定電壓，產(chǎn)生隨標(biāo)本表面形貌變化的隧道電流。

分辨率高

可在非真空狀態(tài)下工作

直接觀察大分子的三維結(jié)構(gòu)當(dāng)前44頁，總共99頁。2.原子力顯微鏡

通過分析探針針尖與樣品之間的原子間作用力來獲取所觀察表面的微觀信息。

樣品無需具有導(dǎo)電性

可在三態(tài)下工作

活細胞表面及生物大分子空間伸展及其結(jié)晶體表面觀測當(dāng)前45頁，總共99頁。二、細胞分離技術(shù)（cellseparation）從活體組織獲得相對單一類型的細胞群的方法

1.制備單一細胞懸液

組織

單一細胞消化EDTA

細胞間連接胰酶

細胞外基質(zhì)當(dāng)前46頁，總共99頁。二、細胞分離技術(shù)（cellseparation）從活體組織獲得相對單一類型的細胞群的方法

1.制備單一細胞懸液

組織

單一細胞消化EDTA

細胞間連接胰酶

細胞外基質(zhì)當(dāng)前47頁，總共99頁。2.分離不同類型細胞

(1)

離心（centrifugation）

大小密度形狀

小輕不規(guī)則

大重圓形當(dāng)前48頁，總共99頁。(2)免疫磁珠法

利用帶有特定單抗的免疫磁珠與靶細胞的特異結(jié)合，快速地從多細胞懸液中將目的細胞分離出來。

Fe2O3或Fe3O4顆粒

+

單克隆抗體免疫磁珠當(dāng)前49頁，總共99頁。當(dāng)前50頁，總共99頁。(3)

流式細胞儀(flowcytometry)

能夠快速分選或檢測細胞及其組分的物理或化學(xué)特性的技術(shù)

A原理:

抗原+抗體*熒光標(biāo)記

B樣品制備

細胞懸液制備細胞固定細胞染色當(dāng)前51頁，總共99頁。當(dāng)前52頁，總共99頁。當(dāng)前53頁，總共99頁。

B應(yīng)用*細胞分選

cellin10005000cells/sec*細胞大小測量*DNA含量測定*免疫表型分析*細胞功能分析*細胞凋亡研究當(dāng)前54頁，總共99頁。細胞周期分析當(dāng)前55頁，總共99頁。

藥物處理前后HT29細胞的流式細胞分析結(jié)果

G0/G160.86%S29.14%G210.00%G0/G137.68%S37.56%G224.76%AB當(dāng)前56頁，總共99頁。當(dāng)前57頁，總共99頁。

ND-1-QD605標(biāo)記不同大腸癌細胞的流式細胞定量分析當(dāng)前58頁，總共99頁。(4)激光捕獲顯微切割技術(shù)（Lasercapturemicrodissection，LCM）從組織切片中精確分離獲取單一細胞的方法

當(dāng)前59頁，總共99頁。工作原理及過程:A制備組織切片B鏡下將組織切片覆以薄膜C激光束切割特定細胞或區(qū)域D收集管收集

當(dāng)前60頁，總共99頁。當(dāng)前61頁，總共99頁。當(dāng)前62頁，總共99頁。三、細胞培養(yǎng)技術(shù)（Cellculture）

從活體組織中分離出特定的細胞，在一定的條件下進行培養(yǎng)，使之能夠繼續(xù)生存、生長以至增殖的方法

invitro用培養(yǎng)細胞做實驗

invivo用動物做實驗當(dāng)前63頁，總共99頁。1.細胞培養(yǎng)的條件

(1)

固體表面：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿

(2)培養(yǎng)基常見培養(yǎng)基：1640DMEM

當(dāng)前64頁，總共99頁。

(3)無菌無菌操作：超凈工作臺、火焰消毒等培養(yǎng)液中加入抗菌素器械、溶液消毒（烤箱、高壓滅菌、過濾）

(4)其他溫度37℃

濕度100%CO2濃度5%當(dāng)前65頁，總共99頁。2.細胞培養(yǎng)的傳代

原代培養(yǎng):直接取材于有機體的細胞培養(yǎng)取材切割消化培養(yǎng)

傳代培養(yǎng):將原代培養(yǎng)存活的細胞從培養(yǎng)瓶中取出，以1:2以上的比例擴大培養(yǎng)

原代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)(保持分化特性)

傳代當(dāng)前66頁，總共99頁。當(dāng)前67頁，總共99頁。3.細胞系（Cellline）

在細胞培養(yǎng)中，偶然情況下產(chǎn)生的具有無限繁殖能力，能夠無限傳代的細胞群。

變異細胞

細胞系

HeLa人宮頸癌上皮細胞

3T3小鼠成纖維細胞無限繁殖當(dāng)前68頁，總共99頁。相差顯微鏡觀察培養(yǎng)中的HeLa細胞當(dāng)前69頁，總共99頁。4.細胞融合（Cellfusion）

（1）定義在自然或人工條件下，使二個或二個以上細胞合并形成一個細胞的過程。異核體雜交細胞分裂當(dāng)前70頁，總共99頁。（2）促融方法生物學(xué)方法：仙臺病毒化學(xué)方法：PEG

物理方法：電脈沖打孔儀（3）應(yīng)用

A細胞核和細胞質(zhì)間的相互作用

B膜蛋白的流動性當(dāng)前71頁，總共99頁。C

基因定位D

單克隆抗體制備

B淋巴細胞腫瘤細胞MousecellHumancelldivision當(dāng)前72頁，總共99頁。當(dāng)前73頁，總共99頁。當(dāng)前74頁，總共99頁。E細胞周期相關(guān)因子的發(fā)現(xiàn)當(dāng)前75頁，總共99頁。四、細胞組分的分級分離通過逐級分離對細胞內(nèi)細胞器和各種成分的化學(xué)性質(zhì)和功能進行研究的方法。勻漿分級分離分析

當(dāng)前76頁，總共99頁。勻漿液膜細胞器大分子

低滲超聲去污劑強制過濾研磨

細胞破壞當(dāng)前77頁，總共99頁。（一）離心法用于分離細胞器和大分子

配平低溫當(dāng)前78頁，總共99頁。

1.差速離心法

分離對象:不同大小和形狀的組分

（細胞核、細胞器）

具體方法:由低速到高速逐級沉降(repeat)當(dāng)前79頁，總共99頁。當(dāng)前80頁，總共99頁。2.速度沉降法

分離對象:不同大小、形狀的組分(沉降系數(shù)S)

比差速離心方法更精細

具體方法:

在離心管中予裝5%-20%蔗糖梯度的離心介質(zhì)

當(dāng)前81頁，總共99頁。3.平衡沉降法

分離對象:密度不同的組分（與大小、形狀無關(guān)）

具體方法：在離心管中予裝一定密度梯度的離心介質(zhì)（20%-70%蔗糖、CsCl）通常采用超速離心

當(dāng)前82頁，總共99頁。

（二）層析法（柱層析）主要用于分離、純化蛋白質(zhì)

填充柱填料（固定相）流動相當(dāng)前83頁，總共99頁。

1.離子交換層析

層析介質(zhì):陰離子或陽離子樹脂

分離原理:電荷

當(dāng)前84頁，總共99頁。

2.凝膠過濾層析層析介質(zhì):凝膠分離原理:分子大小

當(dāng)前85頁，總共99頁。3.親和層析

層析介質(zhì):

基質(zhì)+抗體底物

分離原理:

親和性當(dāng)前86頁，總共99頁。當(dāng)前87頁，總共99頁。4.高壓液相層析HPLC

基質(zhì)粒度小（3-10μm）、分辨率高、分離速度快

當(dāng)前88頁，總共99頁。(三)電泳法

主要用于分離蛋白質(zhì)、核酸

1.瓊脂糖凝膠電泳

分離對象:核酸

支持介質(zhì):瓊脂糖

凝固點40-45℃

不同濃度凝膠具有不同孔徑電泳緩沖液:TAE\TBE

染料:溴化乙錠EB當(dāng)前89頁，總共99頁。(三)電泳法

主要用于分離蛋白質(zhì)、核酸

1.瓊脂糖凝膠電泳

分離對象:核酸

支持介質(zhì):瓊脂糖

凝固點40-45