第十一講蛋白質的分離與純化二

二、簡述題（每題10分共40分）蛋白質一級結構、二級結構、超二級結構、結構域和三級結構及其主要作用力？它們之間的相互關系怎樣？如何理解蛋白質工程的含義（狹義和廣義理解），其主線是什么？什么是基因突變技術，包括哪兩大類技術？舉例說明這兩大類技術包括哪些方法。預測蛋白質三級結構的方法有哪些？描述一種你熟悉的蛋白質高級結構預測方法的操作流程。當前1頁，總共35頁。三、方案設計（10分） 某種微生物合成的蛋白酶與人體消化液中的蛋白酶的結構和功能很相似，但對熱穩(wěn)定性較差，進入人體后容易失效，現(xiàn)要將此酶開發(fā)成一種片劑，臨床治療消化不良，通過蛋白質工程手段能否提高蛋白質的穩(wěn)定性，請您試設計兩套改造方案，簡述改造方案依據(jù)的原理。提示和要求：一套方案采用分子生物學修飾，另一套采用化學修飾。四、論述題（20分）：論述蛋白質一級結構測定的基本程序以及主要方法和原理。當前2頁，總共35頁。概述常見色譜技術介紹第四節(jié)精制分離—液相色譜技術當前3頁，總共35頁。1、液相色譜（Liquidchromatography）？利用不同物質在固定性和流動相中的分配特性不同，對物質的分離的技術。（理解）依據(jù)物質的理化特性（如：分子大小、形狀、分子極性、電荷等）不同，在固定性和流動相中的分配系數(shù)不同流動相為平推流流動相流過固定相時，兩相之間分配平衡很快不同物質的流動速度不同而實現(xiàn)分離。又稱為層析（平推流）特點（四高）高效率、高純度、高精度、高自動化程度——現(xiàn)代化色譜技術——高效液相色譜一、概述當前4頁，總共35頁。1850年，德國化學家Runge將古羅馬時期分析染料與色素的方法進行改進，發(fā)展成為紙色譜。1903年，俄國植物學家Tsweet在華沙生物學會議上發(fā)表分離植物色素的論文，1906年，Tsweet首次提出“色譜法”和“色譜圖”的概念。 “色譜法”（Chromotography）“色譜圖”（Chromatogram）1941年，英國生物化學家Martin與英國化學家Synge（獲諾貝爾獎）創(chuàng)立液液分配色譜，以水份飽和硅膠為固定相，含乙醇的氯仿為流動相分離乙酰氨基酸。1970年中期，微處理機技術用于液相色譜，提高了液相色譜的自動化水平和分析精度。80年代，色譜聯(lián)用技術發(fā)展迅速，逐漸出現(xiàn)了色譜—光譜聯(lián)用、色譜—質譜聯(lián)用、二維色譜（色譜—色譜）等技術。1990年以后，生物工程和生命科學的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題，促進了高效液相色譜技術的發(fā)展。2、液相色譜法的發(fā)展當前5頁，總共35頁。在色譜技術中，液相色譜（Liquidchromatography）是最早（1903年）發(fā)明的，但其初期發(fā)展比較慢。液相色譜普及之前，紙色譜、氣相色譜和薄層色譜是色譜分析的主流。20th60S’，將較為成熟的氣相色譜理論與技術應用于液相色譜，使液相色譜迅速發(fā)展。特別是填料（色譜柱）制備技術、檢測技術和高壓輸液泵性能的不斷改進，使液相色譜分析實現(xiàn)了高效化和高速化。1969年，液相色譜儀商品化。從此，這種分離效率高、分析速度快的液相色譜被稱為高效液相色譜法（HPLC）更加微量、快速、高效、廣泛。新進展：微柱—HPLC、無孔色譜短柱—HPLC、毛細管—HPLC2、液相色譜的發(fā)展當前6頁，總共35頁。吸附層析adsorptionchromatography分子篩層析molecularsievechromatography離子交換層析ionexchangechromatography親和層析affinitychromatography分配色譜—液-液色譜疏水色譜—疏水作用等電點聚焦色譜—pI高效液相色譜—高度自動化的液相色譜3、液相色譜的類型當前7頁，總共35頁。1、吸附分離色譜？（1）概念：利用固相吸附劑對不同物質的吸附力不同，進行物質分離的液相色譜技術。（2）原理：通過范德華力，流動相中的分子與固定相（吸附劑）吸附、再解吸附進入流動相（洗脫劑）。不同物質在固相和液相之間分配系數(shù)或解離平衡不同。通過連續(xù)的吸附—解吸附—再吸附過程將物質分離。

二、常見色譜介紹當前8頁，總共35頁。（3）影響因素？吸附劑、溶劑、被分離物質的性質“三方面”吸附劑：凡能對其它物質具有吸附作用的固體物質。吸附劑選擇原則：根據(jù)：吸附劑性質、溶劑的性質、被分離對象的性質——選擇。表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強、成本低廉。如何理解——選擇原則？（三者之間相互影響關系）：極性強的吸附劑易吸附極性強的物質，非極性強的吸附劑易吸附非極性強的物質。為了便于解吸附，對于極性大的分離物，選擇極性較小的吸附劑，反之亦然。極性吸附劑、分離弱極性物質、弱極性溶劑洗脫；分離強極性物質、用強極性溶劑理想吸附劑和溶劑的選擇：依據(jù)原則，依靠經驗和多次試驗。常用吸附劑：硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土、羥基磷灰石等硅膠的硅醇基（分離中性和酸性成分）氧化鋁：多孔Al2O3，分三種：酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁活性炭：非極性吸附劑、常用于脫色和脫臭等吸附過程當前9頁，總共35頁。層析方式（2種）：

柱層析：羥基磷灰石（HA），[Ca3(PO4)3OH2]，酸性蛋白質、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅膠：含硅醇基團（-Si-OH），氨基酸、甾體激素、皂苷類、類脂和色素等等。（分離并洗脫）薄層層析：（只分離不洗脫），例如：硅膠薄層層析和聚酰胺薄膜薄層層析硅膠薄層層析：硅膠板分類（4類），硅膠H（純硅膠），能用腐蝕性強的顯色劑；硅膠G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅膠）；硅膠CMC（含羧甲基纖維素）；硅膠HF254(含熒光劑的硅膠H)。硅膠板的制備：玻璃板，硅膠制備（加溶劑碾磨），鋪板，活化和合格檢查：約1mg蘇丹黃、蘇丹紅和靛酚藍混合物乙酸乙酯溶液點樣，苯：展層劑，Rf：蘇丹黃>蘇丹紅>靛酚藍，蘇丹黃Rf約0.5，蘇丹紅和靛酚藍Rf之差在0.1—0.2。分析程序：點樣，展層，顯色。當前10頁，總共35頁。聚酰胺薄膜薄層層析：如：DNS—氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），靈敏度10-9—10-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定條件下反應。DABTH-氨基酸的薄層層析分析蛋白質序列。Edman降解試劑DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯-4’-異硫氰酸酯）進行微量蛋白質序列分析（2—10nmol肽樣品）。當前11頁，總共35頁。單向紙層析當前12頁，總共35頁。雙向紙層析當前13頁，總共35頁。薄層層析硅膠G板薄層層析當前14頁，總共35頁。2、凝膠色譜：凝膠過濾、排阻色譜或分子篩層析 以具有篩孔的介質為固定相，依據(jù)分子大小進行物質分離的液相色譜技術。原理：分子在固相篩孔中自由擴散、滲透，不同尺寸的分子在篩孔中的分配系數(shù)不同，導致分子流動速度不同。流動相流動過程中，物質在凝膠內和凝膠外很快達到分配平衡。分子量大，排阻大，分子量小，排阻小，物質按分子量的大小流出分離柱。分子排阻范圍為：0~100%。（排阻率為0和100的物質不能分離。Why？）如何理解？當前15頁，總共35頁。凝膠色譜示意圖分配系數(shù)（Kav）：分離組分在凝膠內水和外水體積中的比例關系。Kav=(Ve-V0)/ViVt=Vo+Vi+Vg，Vt、Vo、Vi和Vg分別為：床體積、外水體積、內水體積和介質的體積。Ve：分離組分流出的體積。分離物質的大小，0<Kav<1，Kav=0或Kav=1，不能分離。當前16頁，總共35頁。凝膠種類和性質：種類：浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等：常用種類和商品名稱（根據(jù)分類對象選擇凝膠材料）交聯(lián)葡聚糖（SephadexG10—G200）；AmershamBiosciences交聯(lián)瓊脂糖（SepharoseCL-4B,CL-6B）SephacrylS系列（聚丙烯酰胺-葡聚糖）Superdes系列（高交聯(lián)瓊脂糖-葡聚糖）Bio-BeadsS-X系列（苯乙烯-二乙烯苯）Bio-GelP系列（聚丙烯酰胺）Bio-RadBio-GelA系列（瓊脂糖）TSKgelSW系列（硅膠）TSKgelToyopearlHW系列，親水性聚乙烯醇ToyoSodaTSKgelPW系列親水性聚乙烯TSKgelCW-35纖維素Cellulofine纖維素Chisso當前17頁，總共35頁。操作程序：凝膠選擇和處理（型號和粒度、凝膠用量、凝膠處理）凝膠柱的制備（柱選擇：徑長比約為：1:25—1:100，裝柱、柱鑒定）平衡層析柱加樣和洗脫（加樣、洗脫、樣品收集，檢測）凝膠柱的再生和保存應用：分離純化、脫鹽和濃縮、去熱源物質分析檢測（定性、定量、分子量）。Kav=-blgMr+c當前18頁，總共35頁。（3）離子交換色譜：理解：依據(jù)電荷大小進行物質分離的液相色譜技術。原理：固相介質上結合有一定的離子基團。結合陽離子基團，稱陰離子交換劑，其反離子為陰離子（如：Cl-）。在適當?shù)臈l件下，反離子與分離物中的陰離子交換。在不同鹽濃度或pH值下，將帶不同電荷的物質洗脫下來。洗脫方式：洗脫劑分類：鹽梯度洗脫；pH梯度洗脫。洗脫梯度分類：連續(xù)梯度；不連續(xù)梯度。當前19頁，總共35頁。離子交換劑分類（2種）交換劑分類I（根據(jù)交換劑所帶電荷：2大類）陽離子交換劑：交聯(lián)陰離子基團，與陽離子交換。如：羧甲基（-O-CH2-COO-）陰離子交換劑：交聯(lián)陽離子基團，與陰離子交換。如：氨基乙基（-O(CH2)2-NH3+）交換劑分類II（根據(jù)基質的組成和性質：2大類）疏水性離子交換劑（親水性較小的合成樹脂，如苯乙烯與二乙烯苯的聚合物）陽離子交換劑—帶負電荷，電荷強弱（強酸型、中強型和弱酸型），反離子為正電荷離子陰離子交換劑—帶正電荷，電荷強弱（強陰性、中陰性和弱陰性），反離子為負電荷離子螯合離子交換劑—具有絡合一些金屬離子、排斥另外一些離子的能力，選擇性更高親水性離子交換劑（親水性較大的合成物質，纖維素、葡聚糖、交聯(lián)瓊脂糖等）陽離子交換劑陰離子交換劑當前20頁，總共35頁。常用固定相介質DEAE（二乙基胺基乙基）—CelluloseDE-32DEAE—CelluloseDE-52DEAE-SephadexA-50（25）DEAE-SepharosCL-6bDEAE-Bio-GelACM（羧甲基）-CelluloseDE-52CM-CelluloseCM-SephadexC-25(50)離子交換劑的選擇依據(jù)物質在溶液中的電荷性質物質的吸附特性（疏水、親水）實踐和經驗蛋白質分離當前21頁，總共35頁。離子交換色譜操作程序洗脫方式：梯度洗脫——連續(xù)梯度和非連續(xù)梯度洗脫應用：物質分離、測定等電點（PI）凝膠預處理裝住平衡上樣洗脫再生當前22頁，總共35頁。（4）親和層析 利用分子間特異性可逆結合對物質進行特異性分離的液相色譜技術。原理：具有特異性親和力的兩個分子中，一個固定在不溶性的基質上，對另一個分子進行分離。（次級作用力相互作用的分子）固定在基質上的分子稱配體，共價鍵與基質相連，構成固定相。流動相中的分子被特異性地與固定相吸附，使物質彼此分離。如：酶—抑制劑、抗原—抗體、A蛋白—Ag、配體—配基、過渡金屬離子（Cu、Ni、Zn、Co等）與O、S、N等供電子基團形成配位鍵，可與蛋白質表面組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基、色氨酸的吲哚基發(fā)生親和作用。如Ni柱分離帶有組氨酸標簽的工程蛋白。操作程序：制備固相吸附劑（選擇凝膠、專一性合成、分析鑒定）→裝柱→平衡→上樣吸附→清洗→解析分離→柱再生→平衡解析劑：低pH、高鹽、競爭性洗脫劑、鹽酸胍、尿素等變性劑等。（次級鍵）柱再生：高濃度鹽、尿素等溶液等應用：物質分離、測定活性當前23頁，總共35頁。親和層析原理和程序——理解當前24頁，總共35頁。（5）疏水性相互作用色譜

利用疏水作用將不同物質分離的液相色譜技術。原理：利用表面偶聯(lián)疏水性基團的基質作為固相疏水吸附劑，流動相中蛋白質等大分子組分與疏水固定相發(fā)生疏水作用，依據(jù)分離物組分與固相吸附劑疏水作用的差異。分離物質按疏水作用由小到大的順序分離開來。特點：疏水吸附劑：含有苯基、辛基、丁基、醚基等疏水基團。高鹽溶液中，蛋白吸附能力強，高鹽上樣，降低鹽度將蛋白洗脫分離。成本高，僅用于實驗室小規(guī)模分離。當前25頁，總共35頁。（6）反向色譜：利用表面非極性的基質為固定相，極性有機溶劑（包括水）為流動相，進行物質分離的色譜技術。特點：固定相表面完全被非極性基團覆蓋，具有強的疏水性。固定相吸附劑：如：以硅膠為載體，硅烷化連接C4、C8、C18烷基或苯基。 典型代表：反相C18柱—常用C18硅烷化的硅膠為吸附劑，極性很小。極性流動相：其典型代表：甲醇和乙腈。類別：制備型色譜和分析型色譜應用：物質的分離和檢測（定性和定量分析）當今液相色譜最主流的分離模式適于所有能夠溶于極性或弱極性溶劑中的有機物質的分離。當前26頁，總共35頁。（7）分配色譜（也稱液—液色譜） 利用分離組分在固定相與流動相之間溶解度的差異來實現(xiàn)分離的色譜技術。原理：分配色譜的固定相是液相溶劑，依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者載體表面。本質上是組分分子在固定相和流動相之間不斷達到溶解平衡的過程。依據(jù)溶解度的不同，將組分分離。分類：正相色譜（normalphase）：是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的液相色譜體系。吸附色譜也屬正相色譜。

極性鍵合固定相：鍵合具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團分子的載體。反相色譜（reversedphase）：由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相體系的極性正好相反。非極性鍵合固定相：鍵合烷基、苯基等非極性有機分子。當前27頁，總共35頁。（8）高效液相色譜

高效液相色譜是色譜的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑或緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在層析柱內各組分彼此分離，依次進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣進行分析和制備的色譜技術。特點：高柱效、高精度、高靈敏度（微量）、高分辨率 ——快速全自動分析當前28頁，總共35頁。主要由4部分組成：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)（主體）和檢測系統(tǒng)。其它輔助裝置：如梯度洗脫，脫氣、自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。根據(jù)色譜柱和分離的原理不同，高效液相色譜分為多種類型（8.1）液相色譜儀組成高效液相色譜儀的結構示意圖排阻色譜離子交換色譜吸附層析親和層析分配色譜疏水色譜反向色譜聚焦色譜1234當前29頁，總共35頁。

工作流程：高壓泵將貯液器中流動相溶劑經過進樣器送入色譜柱，通過檢測器的出口流出，注入欲分離樣品，流動相將樣品貯液器（上樣環(huán)）的樣品帶入色譜柱進行分離，分離組分依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。

8.2液相色譜儀工作流程光合細菌色素HPLC分析HPLC（USA，Angilent1100）上樣操作流程當前30頁，總共35頁。小結：要求掌握液相色譜概念、原理和基本操作流程高效液相色譜的原理和操作流程排阻色譜離子交換色譜吸附層析親和層析分配色譜疏水色譜反向色譜聚焦色譜當前31頁，總共35頁。1、純化方案的設計（1）目的：從混合組分中提取純化目的組分，設計方案，指導分離過程進行。（2）依據(jù)：分離物質的性質和特點，結合分離純化方法的特點，對分離方法進行比較分析，選擇出一種或幾種方法的組合。（3）原則：各種分離方法各有特色，操作程序簡繁不一；考慮分離對象的特性和結構，以及取材的特點；分離方案不是僵化的，在實驗中，對方案進行不斷修正、調節(jié)、完善；設計分離純化方案表格—并進行試驗驗證，