理論3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及引物設(shè)計

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的技術(shù)原理及實驗操作PCR引物設(shè)計軟件的使用（PrimerPremier5.0）Contents當(dāng)前1頁，總共58頁。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實驗?zāi)康?實驗原理（PCR及引物設(shè)計）2實驗儀器、試劑及耗材3實驗步驟4實驗結(jié)果及討論5當(dāng)前2頁，總共58頁。實驗?zāi)康牧私釶CR的基本原理掌握PCR的基本操作技術(shù)學(xué)習(xí)引物設(shè)計的原則及引物設(shè)計軟件Primer5的使用當(dāng)前3頁，總共58頁。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實驗?zāi)康?

實驗原理（PCR及引物設(shè)計）2實驗儀器、試劑及耗材3實驗步驟4實驗結(jié)果及討論5當(dāng)前4頁，總共58頁。實驗原理PCR技術(shù)原理引物設(shè)計的原則PCR的成分和作用PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)條件優(yōu)化PCR的應(yīng)用當(dāng)前5頁，總共58頁。PCR技術(shù)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。PCR不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。當(dāng)前6頁，總共58頁。PCR技術(shù)原理

以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5′末端和3′末端互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。當(dāng)前7頁，總共58頁。PCR技術(shù)原理模板與引物的復(fù)性,引物是與模板某區(qū)序列互補的一小段DNA片段。Tm-5?C在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA94?C從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點，按5’→3’的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈72?C變性退火延伸當(dāng)前8頁，總共58頁。PCR技術(shù)原理當(dāng)前9頁，總共58頁。

PCR出現(xiàn)的問題：

PCR擴增未得到目的條帶？擴增出目的條帶之外的多條帶（非特異性）？擴增的目的條帶很弱？引物是否合適?引物設(shè)計是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)當(dāng)前10頁，總共58頁。實驗原理PCR技術(shù)原理引物設(shè)計的原則PCR的成分和作用PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)條件優(yōu)化PCR的應(yīng)用當(dāng)前11頁，總共58頁。引物設(shè)計的原則引物與模板的序列要緊密互補引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配)?；驹瓌t：當(dāng)前12頁，總共58頁。引物設(shè)計的原則一般原則：1.引物的長度：配對引物的長度一般在15-30bp之間比較合適。盡可能使用兩條引物的Tm值相同（最好相差不要超過5℃）Tm值的計算：一般的公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)

2.引物的GC%含量：一般為40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。當(dāng)前13頁，總共58頁。引物設(shè)計的原則3.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。4.引物3’端的末位堿基避開密碼子的第3位，且最好不選擇A5.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。當(dāng)前14頁，總共58頁。引物設(shè)計的原則6.引物無回文對稱結(jié)構(gòu)，否則會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物自身不能配對，否則易形成約兩個引物長度的引物二聚體；當(dāng)前15頁，總共58頁。實驗原理PCR技術(shù)原理引物設(shè)計的原則PCR的成分和作用PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)條件優(yōu)化PCR的應(yīng)用當(dāng)前16頁，總共58頁。1.緩沖液：

10～50mMTris-Cl(pH8.4)維持Taq酶作用環(huán)境25～50mMKCl促進引物退火

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)

對酶有一定的保護性

0.5～2.5mMMgCl2

Taq酶具有Mg2+依賴性2.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物

0.5～2.5μMPCR的成分和作用當(dāng)前17頁，總共58頁。

3.引物(Primer-P)：預(yù)擴增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。

0.1～1μM4.模板DNA(Template):

最低102

～105DNA片段，實際用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過此量，用量需在實驗中摸索。1～5μlPCR的成分和作用當(dāng)前18頁，總共58頁。5.TaqDNA聚合酶耐高熱

0.5～5U/100μl1U/25～50μl6.水：去離子水，補足整個反應(yīng)體積。PCR的成分和作用當(dāng)前19頁，總共58頁。實驗原理PCR技術(shù)原理引物設(shè)計的原則PCR的成分和作用PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)條件優(yōu)化PCR的應(yīng)用當(dāng)前20頁，總共58頁。常用30μl

各種成分的實際用量應(yīng)根據(jù)實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲備液濃度進行核算。PCR反應(yīng)體系當(dāng)前21頁，總共58頁。操作：

5份標(biāo)本總體積30μl×6=180μl1.取一0.5mlEp管，加入下列試劑：

10×buffer：3μl×6=18μldNTPs:1.0μl×6=6.0μl

引物P1：1.0μl×6=6.0μl

引物P2：1.0μl×6=6.0μlTaq酶(5U/μl)：0.2μl×6=1.2μl

水：22.8μl×6=136.8μl

共174μl，先用移液器/指彈混勻，后用離心機瞬時混勻（管壁上液體沉至管底）。PCR反應(yīng)體系冰上操作！當(dāng)前22頁，總共58頁。2.另取5支0.2mlPCR管，分別加入上述液體29μl。3.分別取標(biāo)本模板各1μl，加入上述5支PCR管中，混勻，離心機瞬時離心，備用。4.反應(yīng)條件：PCR擴增儀PCR反應(yīng)體系

94℃5′

94℃30″55℃30″72℃45″30個循環(huán)

72℃5′當(dāng)前23頁，總共58頁。實驗原理PCR技術(shù)原理引物設(shè)計的原則PCR的成分和作用PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)條件優(yōu)化PCR的應(yīng)用當(dāng)前24頁，總共58頁。⑴變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈完全是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90～95℃，30～60s，再復(fù)雜的DNA分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時間。一般情況下選擇94℃30″，可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。PCR反應(yīng)條件優(yōu)化當(dāng)前25頁，總共58頁。⑵退火溫度和時間：

PCR擴增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。退火溫度的選擇，可根據(jù)引物的長度和G+C含量確定，一般位于40～60℃，30～60s。

退火溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。退火溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。

設(shè)置退火溫度梯度，摸索最佳退火溫度！

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化當(dāng)前26頁，總共58頁。

⑶延伸溫度和時間：延伸溫度一般位于Taq酶最適作用溫度70～75℃之間，常用72℃

延伸時間，可根據(jù)待擴增片段的長度和使用的Taq酶而定，一般taq酶的擴增效率是1kb/1min

延伸時間過長可出現(xiàn)非特異擴增。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化當(dāng)前27頁，總共58頁。⑷循環(huán)數(shù)：其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20～25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20～30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。PCR反應(yīng)條件優(yōu)化當(dāng)前28頁，總共58頁。實驗原理PCR技術(shù)原理引物設(shè)計的原則PCR的成分和作用PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)條件優(yōu)化PCR的應(yīng)用當(dāng)前29頁，總共58頁。1、目的基因的克?。?/p>

PCR技術(shù)為在重組DNA過程中獲得目的基因片段提供了簡便快速的方法。

2、基因的體外突變：可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。PCR的應(yīng)用當(dāng)前30頁，總共58頁。3、DNA和RNA的微量分析：

PCR技術(shù)高度敏感，對模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。實際工作中，一滴血液、一根毛發(fā)或一個細(xì)胞已足以滿足PCR的檢測需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用前景。4、基因轉(zhuǎn)錄水平檢測

RT-PCR可檢測不同組織或細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄水平5、基因突變分析：利用PCR與一些技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。PCR的應(yīng)用當(dāng)前31頁，總共58頁。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實驗?zāi)康?實驗原理（PCR及引物設(shè)計）2

實驗儀器、試劑及耗材3實驗步驟4實驗結(jié)果及討論5當(dāng)前32頁，總共58頁。實驗儀器、試劑及耗材實驗儀器及耗材

PCR儀、移液器、0.2mLPCR管、各種規(guī)格的吸頭。當(dāng)前33頁，總共58頁。實驗儀器、試劑及耗材實驗試劑

10×PCRbuffer(Mg2+Plus)（YRBIO）；

dNTPmix(2.5mMeach)（YRBIO）；

TaqDNAPolymerase(2U/μL)（YRBIO）；引物：Tpm4-F/Tpm4-R，引物溶液濃度為10μM；

Tpm4基因模板質(zhì)粒:

（購自YRBIO基因庫）；無菌超純水；瓊脂糖。當(dāng)前34頁，總共58頁。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實驗?zāi)康?實驗原理（PCR及引物設(shè)計）2實驗儀器、試劑及耗材3

實驗步驟4實驗結(jié)果及討論5當(dāng)前35頁，總共58頁。實驗步驟準(zhǔn)備PCR反應(yīng)溶液，取0.2mLPCR管，按以下順序加入各試劑：

PCR反應(yīng)體系無菌超純水

38μL10×buffer5.0μLdNTPmix2.5μL

引物Tpm4-F1μL

引物Tpm4-R1μL模板（TS-Tpm4）2μLTaq酶0.5μL

合計50μL當(dāng)前36頁，總共58頁。實驗步驟調(diào)整好反應(yīng)程序，將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30sec；55℃30sec；72℃45sec；30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。每人做一管，反應(yīng)完畢后，各取3-5μL進行瓊脂糖凝膠（1.0%）電泳檢測。當(dāng)前37頁，總共58頁。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實驗?zāi)康?實驗原理（PCR及引物設(shè)計）2實驗儀器、試劑及耗材3實驗步驟4

實驗結(jié)果及討論5當(dāng)前38頁，總共58頁。實驗結(jié)果及討論PCR產(chǎn)物瓊脂糖檢測結(jié)果1、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）當(dāng)前39頁，總共58頁。PCR常見問題1.無擴增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降解退火溫度太高當(dāng)前40頁，總共58頁。2.非特異性擴增

PCR常見問題引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多當(dāng)前41頁，總共58頁。PCR常見問題3.拖尾產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)

M12模板不純或降解Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多當(dāng)前42頁，總共58頁。4.假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達(dá)情況)交叉污染PCR常見問題對策操作時防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；除不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑器材均高壓消毒。離心管及槍頭等一次性使用。各種試劑先進行分裝，低溫貯存。設(shè)置陽性和陰性對照，重復(fù)實驗當(dāng)前43頁，總共58頁。Content聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的技術(shù)原理及實驗操作PCR引物設(shè)計軟件的使用（PrimerPremier5.0）當(dāng)前44頁，總共58頁。常用的引物設(shè)計軟件PrimerPremier5.0（自動搜索）*Oligo6（引物評價）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastar當(dāng)前45頁，總共58頁。PrimerPremier5.0簡介主要功能:1、引物設(shè)計2、限制性內(nèi)切酶位點分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析當(dāng)前46頁，總共58頁。PrimerPremier5.0使用介紹PreimerPremier啟動界面Loadsequence當(dāng)前47頁，總共58頁。SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatethe