反義的原理及其應(yīng)用

反義的原理及其應(yīng)用第一頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日反義RNA反義RNAA(antisenseRNA）：一種本身缺乏編碼能力，但能與特異靶RNA(主要是mRNA)互補(bǔ)的RNA分子，它可通過配對(duì)堿基間氫鍵作用與靶RNA的特定互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合形成雙鏈復(fù)合物，抑制靶RNA的功能，從而調(diào)控基因的正常表達(dá)。第二頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日基本原理反義RNA技術(shù)的基本原理：利用自然存在的或人工合成的反義RNA，通過基因重組技術(shù)反向插入到合適的表達(dá)載體形成重組DNA，然后轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，則這一反插入的序列就會(huì)隨細(xì)胞周期產(chǎn)生大量反義RNA，對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而抑制、封閉或破壞靶基因的表達(dá)。第三頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日一、復(fù)制水平DNA復(fù)制中的作用反義RNA作為DNA復(fù)制的抑制因子，與引物RNA結(jié)合或作用于引物前體而抑制DNA復(fù)制，從而降低DNA的復(fù)制效率。E．coli的cole1質(zhì)粒復(fù)制的前提是合成適當(dāng)?shù)腞NA(RNAⅡ)，它自動(dòng)折疊后與DNA模板結(jié)合形成DNA復(fù)制的引物，從復(fù)制起始點(diǎn)上游一445bp處開始，以另一DNA為模板反向轉(zhuǎn)錄的RNAI正好與RNA1I的結(jié)合，阻止了正常引物的產(chǎn)生，從而干擾復(fù)制的進(jìn)行。第四頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日作用機(jī)制反義RNA的作用機(jī)制主要表現(xiàn)在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯3個(gè)水平上。第五頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日二、轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的作用反義RNA與mRNA5末端互補(bǔ)結(jié)合，阻斷帽子結(jié)構(gòu)形成；作用于外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū)，阻礙前mRNA剪接；作用于polyA形成位點(diǎn)，阻礙mRNA的成熟及其向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)。在crp基因的ticRNA(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)負(fù)向自我調(diào)控中，ticRNA與erpmRNA的5端結(jié)合，形成類似于RNA聚合酶識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以反式作用對(duì)轉(zhuǎn)錄過程本身進(jìn)行調(diào)控J第六頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日三、翻譯水平翻譯水平的作用反義RNA可直接與mRNA的SD序列(含RBS)或編碼區(qū)(主要是AUG)結(jié)合，從空間上直接阻止核糖體的正常結(jié)合或可直接降解靶mRNA。反義RNA與mRNA在SD序列配對(duì)形成吻觸復(fù)合體或在互補(bǔ)區(qū)段結(jié)合形成RNA—RNA雙鏈結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控翻譯的進(jìn)行。在真核生物細(xì)胞中有許多RNA在翻譯水平上表現(xiàn)反義RNA的功能。如雞胚胎肌漿中存在的富含U的小分子RNA稱為tcRNA，它們可以與肌球蛋白重鏈的RNA的polyA尾雜交而抑制正常的翻譯過程。Audrey等J的研究表明FGF—ASRNA在翻譯過程能有效地抑制FGF一2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。

第七頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日反義RNA的重組DNA中只有啟動(dòng)子及終止子，當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，重組DNA能自動(dòng)表達(dá)反義RNA，并且重組DNA自身可以整合到宿主的基因組DNA中，或作為“附加體”長(zhǎng)期存在。在原核細(xì)胞中，反義RNA以針對(duì)SD序列效果最好，而在真核細(xì)胞中以5端非編碼區(qū)為標(biāo)靶最有效。第八頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日反義RNA的應(yīng)用隨著基因組草圖的完成,人們研究的重點(diǎn)已轉(zhuǎn)向?qū)蚬δ艿难芯?反義核酸技術(shù)無(wú)疑為這項(xiàng)宏偉的工程提供了一種有力的工具。第九頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日抗病毒作用病毒是對(duì)人和動(dòng)植物危害極大的病原體,然而對(duì)病毒引起的疾病的治療,目前尚無(wú)特效藥物與方法。反義RNA卻能特異性阻斷病毒基因表達(dá)和抑制病毒的復(fù)制,從而激起許多科學(xué)工作者去探索反義RNA治療病毒性疾病的有效方法。抗病毒反義RNA技術(shù)是將特定的病毒基因反向插人到表達(dá)險(xiǎn)載體中,以構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體,再將重組體導(dǎo)人真核細(xì)胞(病毒宿主細(xì)胞)中表達(dá)特異性反義RNA,從而抑制特異有害基因的表達(dá)或抑制病毒復(fù)制。文獻(xiàn)報(bào)道,運(yùn)用反義RNA技術(shù)己經(jīng)成功地抑制疤病毒、流感病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)等對(duì)培養(yǎng)的組織細(xì)胞的侵襲。用針對(duì)植物病毒的反義RNA已培育出具有抗病毒能力的植物。第十頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日姚志強(qiáng)等針對(duì)不同靶位設(shè)計(jì)了10段互補(bǔ)反義核酸(DNA片段)，經(jīng)模型篩選發(fā)現(xiàn)針對(duì)S基因起始區(qū)、SP2增強(qiáng)子帽區(qū)和polyA信號(hào)編碼區(qū)的asONs作用最強(qiáng)，揭示反調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄/翻譯起始區(qū)的反義核酸具有明顯的抗病毒作用。Gabor等(1998)使用內(nèi)源性表達(dá)抗HIV一1po1．vif和enr基因，以及3LTR序列的反義RNA方案，構(gòu)建了MuLVLTR啟動(dòng)子逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)錄CD4淋巴細(xì)胞系，結(jié)果表明反義RNA能高效地穩(wěn)定表達(dá)，反義envRNA能夠最有效地抑制HIV一1的復(fù)制，并且反義polRNA使P24抗原減少了100—1000倍。另外，國(guó)內(nèi)外在應(yīng)用反義RNA技術(shù)培育抗病(如豬瘟、抗雞馬立克氏病等)動(dòng)物品系方面也取得比較明顯的進(jìn)展。第十一頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日反義RNA的抗腫瘤作用腫瘤的發(fā)生是多因素引起的,其中細(xì)胞癌基因或/和某些病毒癌基因的異常激活和過度表達(dá)是導(dǎo)致細(xì)胞惡變的原因之一。如何控制細(xì)胞有害基因的表達(dá)而在基因水平上治療惡性腫瘤呢?在目前基因治療的眾多方案中,反義RNA技術(shù)是最具吸引力的手段之一?？梢栽O(shè)計(jì)出針對(duì)腫瘤細(xì)胞的癌基因、突變基因、非正常表達(dá)基因及某些腫瘤相關(guān)病毒的癌基因反義RNA,以阻斷這些有害基因的表達(dá),達(dá)到治療腫瘤的目的。許多證據(jù)表明,反義RNA可使腫瘤細(xì)胞的表型逆轉(zhuǎn),形態(tài)變化,增殖速度減慢,生存期縮短,軟瓊脂中克隆能力下降及體內(nèi)成瘤能力減弱等,而不影響細(xì)胞生存所必需的其它基因的表達(dá)。第十二頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日Trojan等利用EB病毒游離體表達(dá)載體克隆胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)反義基因,將此重組體轉(zhuǎn)染大鼠C6細(xì)胞系,在大鼠模型上實(shí)現(xiàn)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因治療和預(yù)防。我國(guó)學(xué)者趙曉航等報(bào)道互補(bǔ)于Grnyc基因第二外顯子及其兩側(cè)序列的反義RNA能特異性誘發(fā)人食管癌細(xì)胞程序性死亡。黃賢明等[利用Gets一2、Gmyc和N一ras三個(gè)癌基因聯(lián)合反義RNA能使人肝癌細(xì)胞株SMMC7721生長(zhǎng)速率下降約70%,軟瓊脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力顯著下降,提示針對(duì)多個(gè)癌基因的聯(lián)合反義RNA可能給腫瘤基因治療提供新的途徑。第十三頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日反義RNA技術(shù)還可用于腸道疾病(Rotbarteta1．，1988)、心血管疾病、B一地中海貧血、調(diào)節(jié)衰弱心臟中肌細(xì)胞的Ca2泵體內(nèi)平衡u、G蛋白防止高血壓、肝纖維化等多種疾病的研究。第十四頁(yè)，共十六頁(yè)，2022年，8月28日參考文獻(xiàn)[1]張西鋒，沈偉,潘慶杰,白丁平，耿社民．反義RNA技術(shù)原理及其在疾病治療中的應(yīng)用[J].萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,21(1)：20,21,22[2].孟博綜述