檢測(cè)技術(shù)及梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

窗口期HIV感染后的血清學(xué)動(dòng)態(tài)Anti-P24HIVRNA感染1周2周3周4周………………1年2年3年………..10年………..急性期潛伏期Anti-gp41/120(anti-gp36)Ag艾滋病期Ab濃度當(dāng)前1頁，總共39頁。試驗(yàn)室假陰性報(bào)告的原因分析窗口期非典型血清學(xué)轉(zhuǎn)換病毒變異實(shí)驗(yàn)室誤差實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行艾滋病抗體篩查很很多的原因可能造成漏檢,曾經(jīng)有文獻(xiàn)具體分析過造成漏檢的原因,主要原因有因?yàn)榇翱谄诘脑蛟斐陕z,因?yàn)椴《咀儺愐约皩?shí)驗(yàn)室誤差等原因造成的漏檢.其中最主要的原因是因?yàn)榇翱谄诘膯栴}造成的漏檢.占整體比例的93.7%.

當(dāng)前2頁，總共39頁。篩查試驗(yàn)復(fù)核檢測(cè)確證試驗(yàn)檢測(cè)程序及流程圖當(dāng)前3頁，總共39頁。

HIV抗體篩查檢測(cè)流程樣品初篩試驗(yàn)篩查試劑陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)復(fù)檢試驗(yàn)原有試劑+另一不同原理（或廠家）試劑或另外兩種不同原理（或廠家）試劑均陽性反應(yīng)一陰一陽均陰性反應(yīng)確證試驗(yàn)報(bào)告陰性

當(dāng)前4頁，總共39頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）化學(xué)發(fā)光法快速檢測(cè)及其它檢測(cè)

明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）

免疫滲濾試驗(yàn)：斑點(diǎn)ELISA和斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)電化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)其它快速篩查試驗(yàn)方法艾滋病唾液尿液檢測(cè)試劑初篩檢測(cè)方法當(dāng)前5頁，總共39頁。酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)

最早用于檢測(cè)血清中HIV抗體的有效篩檢方法；很高的敏感性和特異性；

HIV抗體檢測(cè)試劑根據(jù)其抗原的來源和檢測(cè)方式可分為四代；根據(jù)檢測(cè)方法，可分成四類間接法、雙抗原夾心法、競爭法和捕獲法。當(dāng)前6頁，總共39頁。（1）膠體金（膠體硒）法（2）明膠凝集法（3）斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)（4）電化學(xué)發(fā)光法快速檢測(cè)方法當(dāng)前7頁，總共39頁。（1）膠體金法原理：采用雙抗原夾心法免疫測(cè)定原理，使用純化HIV-1/2基因重組抗原，分別固定于硝酸纖維膜上，作為檢測(cè)線，并且用這些抗原標(biāo)記膠體金。當(dāng)待檢樣本中存在HIV抗體時(shí)，先和金標(biāo)記抗原結(jié)合，由于層析作用向前移動(dòng)，當(dāng)遇到膜上固定的抗原時(shí)，形成Ag-Ab-Ag-AU復(fù)合物而富集在包被線上，形成一條或二條紅色線，是陽性結(jié)果。反之，若標(biāo)本中不存在HIV抗體，則不會(huì)出現(xiàn)紅線，是陰性結(jié)果。無論樣本中是否含有HIV抗體，在質(zhì)控線區(qū)域都會(huì)形成另一條紅色線。

T-檢測(cè)線C-質(zhì)控線當(dāng)前8頁，總共39頁。1.準(zhǔn)備試劑與相關(guān)耗材2.每個(gè)樣本檢測(cè)用一片試劑，標(biāo)上相應(yīng)樣本編號(hào).

3.加入50μl全血或血清和血漿4.5-20分鐘讀取結(jié)果

5.讀取和記錄檢測(cè)結(jié)果.

當(dāng)前9頁，總共39頁。陽性反應(yīng)：在質(zhì)控窗和反應(yīng)窗均顯示紅線。陰性反應(yīng)：只在質(zhì)控窗出現(xiàn)紅線，反應(yīng)窗沒有紅線。無效：在質(zhì)控窗沒有出現(xiàn)紅線，說明檢測(cè)無效，需要重新檢測(cè)。當(dāng)前10頁，總共39頁。第四代試劑

聯(lián)合檢測(cè)HIVP24抗原和抗HIV抗體電化學(xué)發(fā)光法當(dāng)前11頁，總共39頁。第一代艾滋病抗體檢測(cè)試劑檢測(cè)的是HIV-1的IgG抗體,檢測(cè)的窗口期大約是42天.第二代試劑可以檢測(cè)HIV-1和HIV-2型的IgG抗體窗口期縮短至35天.第三代的試劑可以同時(shí)檢測(cè)IgG和IgM抗體,將檢測(cè)的窗口期又縮短至22天.第四代的可以聯(lián)合檢測(cè)HIV的P24抗原和HIV-1/2型抗體的試劑,大約平均比較第三代試劑縮短6天時(shí)間.

當(dāng)前12頁，總共39頁。ElecsysHIVCombi的檢測(cè)原理羅氏第四代HIVCombi試劑檢測(cè)的是HIVP24抗原和HIV-1/HIV-2抗體.檢測(cè)P24抗原使用的是單克隆的HIV抗體.檢測(cè)HIV-1/2抗體使用的是大量的重組抗原,來捕捉IGg和IGM抗體.

釕生物素辣根過氧化物酶標(biāo)記的磁性珠電化學(xué)發(fā)光當(dāng)前13頁，總共39頁?？焖贆z測(cè)法的優(yōu)先使用

技術(shù)角度需要考慮：需要快速得到結(jié)果、免去試劑和樣本的冷鏈運(yùn)輸環(huán)節(jié)、小空間實(shí)驗(yàn)室的成本效益、檢測(cè)的簡單性等。

優(yōu)先使用包括：應(yīng)急、門診急診，如VCT、母嬰傳播、臨床評(píng)估、農(nóng)村血檢、術(shù)前檢測(cè)、緊急事件等。當(dāng)前14頁，總共39頁。HIV快速檢測(cè)的局限性一般不用于血液篩查有一定的假陽性反應(yīng)窗口期問題：有一定的假陰性反應(yīng)（尤其暴露時(shí)間<3個(gè)月）HIV抗體快速檢測(cè)具有快速優(yōu)勢(shì)，但是“快速”并不意味著對(duì)早期感染者的快速診斷，因?yàn)镠IV感染后產(chǎn)生抗體應(yīng)答需要一段時(shí)間，存在窗口期（即從暴露至最早檢測(cè)出的時(shí)間），即使采用分子生物學(xué)試驗(yàn)，也有1～2周的窗口期。當(dāng)前15頁，總共39頁。陰性－－報(bào)告“HIV抗體陰性”陽性－－出具“HIV抗體待復(fù)查”報(bào)告（1）不能出陽性報(bào)告。（2）同時(shí)盡快進(jìn)行以下處理：

在廣州市疾病預(yù)防控制中心數(shù)字化信息系統(tǒng)填寫送檢病例信息，打印送檢單，重新采血，兩份血和紙質(zhì)版送檢單一并送篩查中心或確證實(shí)驗(yàn)室；做檢測(cè)后咨詢；初篩陽性告知。（注意告知技巧）

篩查檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告和處理當(dāng)前16頁，總共39頁?？贵w篩查試驗(yàn)的局限性陽性結(jié)果需用其他試劑復(fù)查以及確證。陰性結(jié)果有時(shí)不能排除HIV感染:(1)在感染早期，血清陽轉(zhuǎn)前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗體可能檢測(cè)不到（如p24抗體）。

(2)反應(yīng)中抗體過量，抗原抗體比例不合適而不能形成特定結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)凝集抑制。當(dāng)前17頁，總共39頁。艾滋病實(shí)驗(yàn)室生物安全生物安全細(xì)則職業(yè)暴露的防范當(dāng)前18頁，總共39頁。梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院檢驗(yàn)科詹鈾超當(dāng)前19頁，總共39頁。主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)注意事項(xiàng)及臨床意義梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)策略探討當(dāng)前20頁，總共39頁。常用梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法病原學(xué)檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)當(dāng)前21頁，總共39頁。病原學(xué)檢查原理：一期、二期梅毒時(shí)，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結(jié)穿刺術(shù)得到的組織液，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方式進(jìn)行檢測(cè)。方法：（1）暗視顯微鏡檢查（2）鍍銀染色法 （3）核酸檢測(cè)（血液標(biāo)本？）注：梅毒螺旋體目前體外人工培養(yǎng)還沒有獲得成功， 僅能通過接種兔睪丸等部位進(jìn)行有限增殖。當(dāng)前22頁，總共39頁。梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法1)非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn) （非特異性梅毒抗體）(2)梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn) （特異性梅毒抗體）兩類方法。當(dāng)前23頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理梅毒螺旋體一旦感染人體，宿主可對(duì)螺旋體表面的脂質(zhì)作出免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（非特異性抗體）。未經(jīng)治療的病人，其血清內(nèi)的非特異性抗體可長期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，非特異性抗體可以逐漸減少滴度至轉(zhuǎn)為陰性。當(dāng)前24頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)原理方法包括：（1）快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR)（2）甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）（3）性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)(VDRL)等?；境煞质切牧字蚜字湍懝檀伎乖贵w結(jié)合形成復(fù)合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見上述方法的敏感性和特異性都基本相似當(dāng)前25頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理示意圖當(dāng)前26頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)操作要點(diǎn)1、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速100r/min，轉(zhuǎn)幅約18mm2、定性試驗(yàn)加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個(gè)圈內(nèi)加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號(hào)針頭加1滴抗原（60滴/mL，1滴=17ul）反應(yīng)：水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘(23℃-29℃）亮光下觀察結(jié)果。當(dāng)前27頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)操作要點(diǎn)3、定量試驗(yàn)稀釋夜準(zhǔn)備：在反應(yīng)紙板圈內(nèi)加入50uL生理鹽水（根據(jù)需要確定圈數(shù)),勿將鹽水涂開加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個(gè)圈內(nèi)。下同定性實(shí)驗(yàn)。1:11:21:8當(dāng)前28頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)臨床意義早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后一期梅毒1年后轉(zhuǎn)為陰性二期梅毒2年后轉(zhuǎn)為陰性。晚期梅毒治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應(yīng)仍為陽性。非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)方法簡單、快速、敏感性和特異性較好。適用于大量人群的篩查。因治療后血清滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)或再感染的指征。當(dāng)前29頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)特點(diǎn)假陽性反應(yīng)技術(shù)性假陽性反應(yīng)一般是由于操作錯(cuò)誤引起的假陽性反應(yīng)，經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn)即可排除。生物學(xué)假陽性反應(yīng)(一般滴度小1:8），應(yīng)采用梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)如TPPA等進(jìn)行排除。當(dāng)前30頁，總共39頁。梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺旋體重組特異抗原），檢測(cè)梅毒患者血中特異性抗梅毒螺旋體抗原的抗體。感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗(yàn)呈陽性，則患者終身陽性。當(dāng)前31頁，總共39頁。梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)方法梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)(TPHA)梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測(cè)(RT)熒光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗(yàn)（WB）當(dāng)前32頁，總共39頁。TPPATPPA試驗(yàn)用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見的凝集反應(yīng)，具有較高的敏感性和特異性。TPPA是目前WHO公認(rèn)的梅毒抗原血清學(xué)試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，常用于新方法、新試劑的參照標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前33頁，