免疫組化顯色系統(tǒng)

免疫組化顯色系統(tǒng)第一頁，共三十頁，2022年，8月28日免疫組化技術原理用標記物或顯色物標記抗體或抗原通過免疫學中的抗原與已知抗體反應來檢測組織或細胞內(nèi)的抗原成分免疫組化染色是一項綜合性技術組織材料的準備免疫組化染色前處理免疫組化染色(一抗,顯色系統(tǒng))第二頁，共三十頁，2022年，8月28日免疫組化原理圖標注解一抗1一抗2抗兔二抗抗鼠二抗組織抗原1抗原2過氧化物酶堿性磷酸酶雙染阻斷劑顯色劑(棕色)顯色劑(紅色)葡聚糖骨架分子第三頁，共三十頁，2022年，8月28日回顧過去直接法二步間接法三步間接法酶免疫復合物法鏈親和素-生物素法(ABC)第四頁，共三十頁，2022年，8月28日目前常用的顯色系統(tǒng)一步法:EPOS(EnhancedPolymerOne-StepStaining)二步法:EnVisionSystems雙染:GeneralDoublestain

三步法:LSAB(LabeledSstreptavidin-biotin)催化放大系統(tǒng):CSA(CatalyzedSignalAmplicationSystem)動物研究試劑盒:ARK(AnimalResearchKit)第五頁，共三十頁，2022年，8月28日一步法EPOS原理:

在一抗上通過多聚骨架標記過氧化物酶.即一抗上已標記過氧化物酶.這種一抗與抗原結合后即可直接顯色.多聚骨架分子特異性一抗組織抗原過氧化物酶第六頁，共三十頁，2022年，8月28日一步法EPOS主要實驗流程組織片脫蠟,水化阻斷(S2001)TBS沖洗(S1968)一抗/HRP(U…)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(K3467或K0697)水漂洗素木精復染(S3309)第七頁，共三十頁，2022年，8月28日一步法EPOS特點:一抗孵育后直接顯色即用型試劑快速(一步)完成敏感性較差昂貴使用對象:要求快速出結果的免疫組化實驗對象第八頁，共三十頁，2022年，8月28日二步法EnVision原理:

在葡聚糖大分子上標記二抗及酶,將傳統(tǒng)的二抗和三抗(酶)連接在一起,形成一個復合物EnVision.兩步孵育完成免疫組化.第九頁，共三十頁，2022年，8月28日二步法EnVision原理圖一抗與抗原結合EnVision二抗復合物與一抗結合第十頁，共三十頁，2022年，8月28日二步法EnVision主要實驗流程阻斷內(nèi)過氧化酶(S2001)TBS沖洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.)EnVision(Mo.K4001Rb.K4003)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(K3467或K0697)蘇木精復染(S3309)TBS沖洗(S1968)

第十一頁，共三十頁，2022年，8月28日二步法EnVision

特點:

二抗及酶通過葡聚糖連成一個大分子試劑(避開了傳統(tǒng)的生物素與鏈親和素結合),不受內(nèi)源性生物素干擾.即用,方便,快速(兩步).敏感性強.背景低.是目前最理想的免疫組化顯色系統(tǒng)使用對象可向所有做免疫組化的用戶推薦.第十二頁，共三十頁，2022年，8月28日EnVision二步法雙染原理:

與EnVision二步法原理相同,只是為達到在同一組織上標記兩種抗原.必需用兩種動物來源的一抗(常用抗小鼠和兔),分別配相應的EnVision(二抗),再用兩種顏色的顯色劑顯色.第十三頁，共三十頁，2022年，8月28日EnVision二步法雙染原理圖鼠一抗接抗原1鼠EnV/HRP接抗鼠一抗DAB(顯色劑1)雙染阻斷劑兔一抗接抗原2兔EnV/AP接抗兔一抗FastRed(顯色劑2)第十四頁，共三十頁，2022年，8月28日EnVision二步法雙染主要實驗流程阻斷內(nèi)過氧化酶(S2001)TBS沖洗(S1968)一抗(1Mo.)孵育TBS沖洗(S1968)EnVision/HRP(1Mo.)TBS沖洗(S1968)顯色劑1DAB(K3467)蒸餾水沖洗雙染阻斷劑(Kit含)一抗(2Rb.)孵育TBS沖洗(S1968)EnVision/AP(2Rb.)TBS沖洗(S1968)顯色劑2FastRead(K0597)蒸餾水沖洗蘇木精復染(S3309)第十五頁，共三十頁，2022年，8月28日EnVision二步法雙染特點:即用,方便,快速,省時.敏感性強.背景低.在同一組織切片上,用兩種不同標記物標記兩種不同的抗原.使用對象需在同一張切片上標記兩種抗原者主要是形態(tài)學科研人員第十六頁，共三十頁，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)

原理:

應用生物素標記二抗與過氧化物酶或堿性磷酸酶標記鏈親和素(Streptavidin)的親和作用,連接一抗及抗原,形成大分子.再通過相應酶的底物(顯色劑)作用使之顯色.第十七頁，共三十頁，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)原理圖:一抗與抗原結合二抗/Bio與一抗結合STPA/HRP(AP)與二抗/Bio結合第十八頁，共三十頁，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)主要實驗流程阻斷內(nèi)過氧(S2001)TBS沖洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.)TBS沖洗(S1968)

TBS沖洗(S1968)二抗/生物素(Mo.E354Rb.E353)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(K3467或K0697)FastRead(K0597或K0699)蘇木精復染(S3309)鏈親和素/HRP或AP蒸餾水沖洗第十九頁，共三十頁，2022年，8月28日三步法

LSAB

(LabeledStreptavidin-biotin)特點:便宜有現(xiàn)成的兔,鼠,羊通用試劑盒會有內(nèi)源性生物素造成的非特異性背景使用對象可向所有做免疫組化的用戶推薦.第二十頁，共三十頁，2022年，8月28日催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

原理在經(jīng)典三步法免疫組化放大基礎上,通過生物素化酪胺的催化,將又一次加入的酶標記鏈親和素(Streptavidin-enzyme)與二抗中生物素親和,使已放大的分子再一次放大.第二十一頁，共三十頁，2022年，8月28日催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

原理圖一抗與抗原結合二抗/Bio與一抗結合STAV/Bio與二抗/Bio結合放大液催化加入STAV/HRP與Bio再結合第二十二頁，共三十頁，2022年，8月28日催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

主要實驗流程:阻斷內(nèi)過氧(S2001)水洗TBS沖洗(S1968)二抗孵育(Rba-Mo/Bio)TBS沖洗(S1968)

放大液(Kit含)鏈親和素/生物素Strep./Bio(Kit含)TBS沖洗(S1968)顯色劑DAB或AEC(Kit含)蘇木精復染(S3309)鏈親和素/過氧化物酶Strep./HRP(Kit含)蒸餾水沖洗蛋白阻斷劑(Kit含)一抗孵育(Mo)TBS沖洗(S1968)TBS沖洗(S1968)TBS沖洗(S1968)第二十三頁，共三十頁，2022年，8月28日催化放大系統(tǒng)CSA

(CatalyzedSignalAmplicationSystem)

特點:敏感性極強實驗步驟較多較貴使用對象:需做免疫組化實驗者,特別適用于某些石蠟片不易出結果的一抗.第二十四頁，共三十頁，2022年，8月28日動物研究試劑盒

ARK

(AnimalResearchKit)原理在一抗與組織抗原反應之前:小鼠一抗F(c)與生物素化抗小鼠F(ab)片斷結合,再加入小鼠免疫球蛋白,中和未被結合的生物素化抗小鼠F(ab).用該復合物再與小鼠組織中特異抗原反應,可降低非特異性背景.第二十五頁，共三十頁，2022年，8月28日動物研究試劑盒

ARK

(AnimalResearchKit)原理圖小鼠一抗抗小鼠IgF(ab)/Bio免疫復合物/Bio和游離抗小鼠IgF(ab)/Bio免疫復合物/Bio和游離抗小鼠IgF(ab)/Bio小鼠Ig免疫復合物/Bio和被中和的抗小鼠IgF(ab)/Bio與組織抗原結合按LSAB法繼續(xù)免疫組化染色第二十六頁，共三十頁，2022年，8月28日動物研究試劑盒

ARK

(AnimalResearchKit)主要實驗步驟一抗與組織抗原反應之前需做試劑的預處理:小鼠一抗+抗小鼠Ig的F(ab)/Bio復合物1復合物1+小鼠Ig復合物2(已優(yōu)化的一抗)用復合物2作為一抗同LSAB三步法免疫組化染色第二十七頁，共三十頁，2022年，8月28日動物研究試劑盒

ARK

(AnimalResearchKit)特點小鼠一抗在小鼠組織切片上做免疫組化可降低背景.使用對象需用小鼠一抗做小鼠組織的免疫組化實驗者.第二十八頁，共三十頁，2022年，8月28日幾種顯色系統(tǒng)復雜與敏