微生物的遺傳變異與育種

第八章微生物遺傳變異與菌種保藏當(dāng)前1頁，總共102頁。遺傳：親代與子代相似變異：親代與子代、子代間不同個體不完全相同遺傳型：表型（表現(xiàn)型）：生物的全部遺傳因子及基因具有一定遺傳型的個體，在特定環(huán)境條件下通過生長發(fā)育所表現(xiàn)出來的形態(tài)等生物學(xué)特征的總和。表型是由遺傳型所決定，但也和環(huán)境有關(guān)。遺傳（heredity）和變異（variation）是生命的最本質(zhì)特性之一當(dāng)前2頁，總共102頁。表型飾變：表型的差異只與環(huán)境有關(guān)特點(diǎn)：暫時性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個體的行為橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳。遺傳型變異（基因變異、基因突變）：遺傳物質(zhì)改變，導(dǎo)致表型改變特點(diǎn)：遺傳性、群體中極少數(shù)個體的行為（自發(fā)突變頻率通常為10-6-10-9）當(dāng)前3頁，總共102頁。微生物是遺傳學(xué)研究中的明星：微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。很多常見微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長繁殖。對環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強(qiáng)。當(dāng)前4頁，總共102頁。第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)一、DNA作為遺傳物質(zhì)二、RNA作為遺傳物質(zhì)當(dāng)前5頁，總共102頁。一、DNA作為遺傳物質(zhì)只有DNA被酶降解破壞的抽提物無轉(zhuǎn)化活性DNA是轉(zhuǎn)化所必需的轉(zhuǎn)化因子當(dāng)前6頁，總共102頁。當(dāng)前7頁，總共102頁。當(dāng)前8頁，總共102頁。二、RNA作為遺傳物質(zhì)生化提取分別獲得含RNA的煙草花葉病毒蛋白質(zhì)外殼（病毒1）和核酸（病毒2）抗血清處理，證明雜種病毒的蛋白質(zhì)外殼來自病毒1，而非病毒2雜種病毒的后代的蛋白質(zhì)外殼表現(xiàn)為病毒2，而非病毒1遺傳物質(zhì)是核酸（RNA）而非蛋白質(zhì)當(dāng)前9頁，總共102頁。第二節(jié)遺傳物質(zhì)在微生物中的存在形式一、核物質(zhì)－－染色體染色體：是細(xì)胞分裂期間顯微鏡下可見的，由染色質(zhì)構(gòu)成的具有特殊形態(tài)和數(shù)目的物質(zhì)1）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；例外：布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)的染色體是線狀的1、原核微生物（細(xì)菌、古生菌）染色體的特點(diǎn)當(dāng)前10頁，總共102頁。1）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；2）基因組上遺傳信息具有連續(xù)性；基因數(shù)基本接近由它的基因組大小所估計(jì)的基因數(shù)一般不含內(nèi)含子，遺傳信息是連續(xù)的而不是中斷的。真核生物基因組的一個重要特點(diǎn)就是含有內(nèi)含子1、原核微生物（細(xì)菌、古生菌）染色體特點(diǎn)當(dāng)前11頁，總共102頁。1）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；2）基因組上遺傳信息具有連續(xù)性；3）功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu)；4）結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及rRNA基因的多拷貝；5）基因組的重復(fù)序列少而短；古生菌的基因組在結(jié)構(gòu)上類似于細(xì)菌。但是信息傳遞系統(tǒng)(復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯)則與細(xì)菌不同而類似于真核生物。操縱子（operon）：功能相關(guān)的幾個基因前后相連，再加上一個共同的調(diào)節(jié)基因和一組共同的控制位點(diǎn)（啟動子、操作子等）在基因轉(zhuǎn)錄時協(xié)同動作。1、原核微生物（細(xì)菌、古生菌）染色體特點(diǎn)當(dāng)前12頁，總共102頁。1）典型的真核染色體結(jié)構(gòu)（大、核內(nèi)、和蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合成多條染色體）2）沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)；但有基因簇存在。啤酒酵母基因組大小為13.5×106bp，分布在16條染色體中。3）有間隔區(qū)（即非編碼區(qū)）和內(nèi)含子序列；4）重復(fù)序列多；2、真核微生物染色體特點(diǎn)5）假基因的存在。當(dāng)前13頁，總共102頁。DNA或RNA雙鏈、單鏈，環(huán)狀、鏈狀，完整的核酸分子、多個節(jié)段3、病毒遺傳物質(zhì)特點(diǎn)當(dāng)前14頁，總共102頁。

核外物質(zhì)－－質(zhì)粒（plasmid）：一種獨(dú)立于染色體外，能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細(xì)胞中。轉(zhuǎn)座子（transposableelement）：位于染色體或質(zhì)粒上的一段能改變自身位置的DNA序列，廣泛分布于原核和真核細(xì)胞中。是細(xì)胞中除染色體以外的另外二類遺傳因子二、核外物質(zhì)－－質(zhì)粒（plasmid）

轉(zhuǎn)座子（transposableelement）當(dāng)前15頁，總共102頁。

(一)、質(zhì)粒的基本特性質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb；（細(xì)菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi)）1.共價、閉合、環(huán)狀、雙鏈DNA分子當(dāng)前16頁，總共102頁。

獨(dú)立于宿主染色體外自主復(fù)制

細(xì)胞分裂時隨染色體一起分配至子細(xì)胞，并保持固有的拷貝數(shù)2、能自主復(fù)制當(dāng)前17頁，總共102頁。

兩種不同類型的質(zhì)粒若能穩(wěn)定地共存于一個宿主細(xì)胞

內(nèi)，稱微質(zhì)粒的相容性，反之，稱為不相容性

質(zhì)粒的相容性和它們的親緣關(guān)系相關(guān)

質(zhì)粒所帶的基因只決定宿主細(xì)胞的某些特性，如抗藥性3、不相容性（incompatibility）4、質(zhì)粒所攜帶的基因不是細(xì)胞生長所必需的當(dāng)前18頁，總共102頁。

可利用某些理化因素（如高溫、UV）提高質(zhì)粒的消除頻率接合型質(zhì)?！苯咏雍现鲃愚D(zhuǎn)移，如F因子非接合型質(zhì)?！ㄟ^噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)，如青霉素酶質(zhì)粒5、質(zhì)粒能從宿主細(xì)胞自發(fā)消除6、質(zhì)粒能從一個細(xì)菌轉(zhuǎn)移給另一個細(xì)菌當(dāng)前19頁，總共102頁。質(zhì)粒的檢測當(dāng)前20頁，總共102頁。

（二）、醫(yī)藥方面的重要質(zhì)粒（了解）在某些特殊條件下，質(zhì)粒有時能賦予宿主細(xì)胞以特殊的機(jī)能，從而使宿主得到生長優(yōu)勢。質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷?xì)胞一般是非必需的；當(dāng)前21頁，總共102頁。

質(zhì)粒的主要類型質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)致育因子（Fertilityfactor，F(xiàn)因子）抗性因子（Resistancefactor，R因子）產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性質(zhì)粒（virulenceplasmid）代謝質(zhì)粒（Metabolicplasmid）隱秘質(zhì)粒（crypticplasmid）當(dāng)前22頁，總共102頁。

1、致育因子(Fertilityfactor，F(xiàn)因子)又稱F質(zhì)粒，其大小約100kb，最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象（接合作用）有關(guān)的質(zhì)粒。F因子能以游離狀態(tài)(F+)和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細(xì)胞中，所以又稱之為附加體(episome)。攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株（相當(dāng)于雄性），無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株（相當(dāng)于雌性）。當(dāng)前23頁，總共102頁。

二、質(zhì)粒的主要類型2、抗性因子（Resistancefactor，R因子）包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡稱R質(zhì)粒。R100質(zhì)粒(89kb)可使宿主對下列藥物及重金屬具有抗性：汞（mercuricion，mer）、四環(huán)素（tetracycline，tet）、鏈霉素(Streptomycin,Str)、磺胺(Sulfonamide,Su)、氯霉素(Chlorampenicol,Cm)、夫西地酸（fusidicacid，fus）負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質(zhì)粒上?？剐再|(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。當(dāng)前24頁，總共102頁。

3、產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）一般都位于質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上，因此，細(xì)菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株。細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因、涉及細(xì)菌素運(yùn)輸及發(fā)揮作用（processing）的蛋白質(zhì)的基因、賦予宿主對該細(xì)菌素具有“免疫力”的相關(guān)產(chǎn)物的基因當(dāng)前25頁，總共102頁。

3、產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）細(xì)菌素一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名：大腸桿菌（E.coli）產(chǎn)生的細(xì)菌素為colicins（大腸桿菌素），而質(zhì)粒被稱為Col質(zhì)粒。由G+細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素或與細(xì)菌素類似的因子與colicins有所不同，但通常也是由質(zhì)?；蚓幋a，有些甚至有商業(yè)價值，例如一種乳酸細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素NisinA能強(qiáng)烈抑制某些G+細(xì)菌的生長，而被用于食品工業(yè)的保藏。當(dāng)前26頁，總共102頁。

4、毒性質(zhì)粒（virulenceplasmid）許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的，這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因，其產(chǎn)物對宿主（動物、植物）造成傷害。蘇云金桿菌含有編碼δ內(nèi)毒素(伴孢晶體中)的質(zhì)粒根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動物腹瀉的主要病原菌之一，其中許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質(zhì)粒。當(dāng)前27頁，總共102頁。

5、代謝質(zhì)粒（Metabolicplasmid）質(zhì)粒上攜帶有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基質(zhì)的酶，進(jìn)行共生固氮，或產(chǎn)生抗生素（某些放線菌）等。將復(fù)雜的有機(jī)化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單形式，環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。假單胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、農(nóng)藥(2,4-dichlorophenoxyaceticacid)、辛烷和樟腦等的能力。降解質(zhì)粒：當(dāng)前28頁，總共102頁。

6、隱秘質(zhì)粒（crypticplasmid）隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng)，它們的存在只有通過物理的方法，例如用凝膠電泳檢測細(xì)胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn)。它們存在的生物學(xué)意義，目前幾乎不了解。在應(yīng)用上，很多隱秘質(zhì)粒被加以改造作為基因工程的載體（一般加上抗性基因）當(dāng)前29頁，總共102頁。

高拷貝數(shù)(highcopynumber)質(zhì)粒（每個宿主細(xì)胞中可以有10-100個拷貝）———————松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)低拷貝數(shù)(lowcopynumber)質(zhì)粒（每個宿主細(xì)胞中可以有1-4個拷貝）———————嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringentplasmid)窄宿主范圍質(zhì)粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制）廣宿主范圍質(zhì)粒(broadhostrangeplasmid)（可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制）質(zhì)粒其他的分類方式當(dāng)前30頁，總共102頁。

（三）轉(zhuǎn)座因子細(xì)胞中能改變自身位置的一段DNA序列跳躍基因，指的是細(xì)胞基因組中能夠從一個位置轉(zhuǎn)移到另一位置的一段DNA序列（插入序列、轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)座噬菌體）遺傳學(xué)效應(yīng)：插入突變，產(chǎn)生染色體畸變，基因的移動和重排當(dāng)前31頁，總共102頁。第三節(jié)基因突變及修復(fù)指遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）中的核苷酸序列發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的變化，從而導(dǎo)致了生物性狀的改變?；蛲蛔儯寒?dāng)前32頁，總共102頁。一個基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變基因突變：基因突變是重要的生物學(xué)現(xiàn)象，它是一切生物變化的根源，連同基因轉(zhuǎn)移、重組一起提供了推動生物進(jìn)化的遺傳多變性。基因突變突變自發(fā)突變?nèi)斯ふT變環(huán)境因素的影響，DNA復(fù)制過程的偶然錯誤等而導(dǎo)致，一般頻率較低，通常為10-6-10-9。某些物理、化學(xué)因素對生物體的DNA進(jìn)行直接作用，突變以較高的頻率產(chǎn)生。突變可以通過DNA復(fù)制而成為真正的突變，也可以重新變?yōu)樵瓉淼慕Y(jié)構(gòu)，這取決于修復(fù)作用和其它多種因素。DNA損傷修復(fù)機(jī)制當(dāng)前33頁，總共102頁。一、基因突變的類型表型基因型這里主要介紹幾種常用的由于基因突變而造成微生物表型變化的突變型及其分離1.基因型－－堿基變化與遺傳信息的改變1）同義突變2）錯義突變3）無義突變4）移碼突變當(dāng)前34頁，總共102頁。1）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）一種缺乏合成其生存所必須的營養(yǎng)物（包括氨基酸、維生素、堿基等）的突變型，只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營養(yǎng)或其前體物（precursor）才能生長。表型判斷的標(biāo)準(zhǔn)：在基本培養(yǎng)基上能否生長營養(yǎng)缺陷型是微生物遺傳學(xué)研究中重要的選擇標(biāo)記和育種的重要手段2.表型－－可觀察或可檢測的個體性狀或特征當(dāng)前35頁，總共102頁。營養(yǎng)缺陷型特點(diǎn)：在選擇培養(yǎng)基（一般為基本培養(yǎng)基）上不生長負(fù)選擇標(biāo)記突變株不能通過選擇平板直接獲得營養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營養(yǎng)物的前三個英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個字母大寫，且不用斜體：HisC在具體使用時多用hisC-和hisC+，分別表示缺陷型和野生型。當(dāng)前36頁，總共102頁。2）抗藥性突變型（resistantmutant）基因突變使菌株對某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性。特點(diǎn)：正選擇標(biāo)記（突變株可直接從抗性平板上獲得-----在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。）表示方法：所抗藥物的前三個小寫斜體英文字母加上“r”表示strr和strs分別表示對鏈霉素的抗性和敏感性當(dāng)前37頁，總共102頁。3）形態(tài)突變型（morphologicalmutant）造成形態(tài)改變的突變型特點(diǎn)：非選擇性突變突變株和野生型菌株均可生長，但可從形態(tài)特征上進(jìn)行區(qū)分。舉例：產(chǎn)蛋白酶缺陷突變株的篩選菌落顏色變化β半乳糖苷酶基因的插入失活，使重組子菌落為白色而與蘭色的非重組子分開。形成芽孢缺陷菌株細(xì)胞水平上的形態(tài)突變，突變株的檢出更加困難。當(dāng)前38頁，總共102頁。4）條件致死突變型（conditionallethalmutant）在某一條件下具有致死效應(yīng)，而在另一條件下沒有致死效應(yīng)的突變型。特點(diǎn)：負(fù)選擇標(biāo)記這類突變型常被用來分離生長繁殖必需的突變基因常用的條件致死突變是溫度敏感突變，用ts（temperaturesensitive）表示，這類突變在高溫下（如42℃）是致死的，但可以在低溫如25-30℃）下得到這種突變。當(dāng)前39頁，總共102頁。5）其它突變類型毒力、生產(chǎn)某種代謝產(chǎn)物的發(fā)酵能力的變化等在實(shí)際應(yīng)用中具有重要意義突變類型一般都不具有很明顯或可直接檢測到的表型。其突變株的獲得往往需要較大的工作量。當(dāng)前40頁，總共102頁。1.不對應(yīng)性自發(fā)性稀有性獨(dú)立性誘變性6.穩(wěn)定性7.可逆性二、基因突變的規(guī)律-----自發(fā)突變當(dāng)前41頁，總共102頁。誘發(fā)突變當(dāng)前42頁，總共102頁。證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應(yīng)關(guān)系！三個經(jīng)典實(shí)驗(yàn)變量實(shí)驗(yàn)、涂布試驗(yàn)、影印實(shí)驗(yàn)三、證明突變自發(fā)性和不對應(yīng)性的經(jīng)典試驗(yàn)如何證明基因突變的非對應(yīng)性？當(dāng)前43頁，總共102頁。變量實(shí)驗(yàn)（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969當(dāng)前44頁，總共102頁。四、誘變劑與致癌物質(zhì)——Ames試驗(yàn)（了解）a）利用各種誘變劑獲得各類遺傳突變，進(jìn)行誘變育種；c）危害人類自身的健康b）對有害微生物進(jìn)行控制；很多種化學(xué)物質(zhì)，能以各種機(jī)制導(dǎo)致DNA的突變當(dāng)前45頁，總共102頁?！吧锘瘜W(xué)統(tǒng)一性”法則：人和細(xì)菌在DNA的結(jié)構(gòu)及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會作用于人的DNA，使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良的后果。誘變劑的共性原則：化學(xué)藥劑對細(xì)菌的誘變率與其對動物的致癌性成正比超過95%的致癌物質(zhì)對微生物有誘變作用90%以上的非致癌物質(zhì)對微生物沒有誘變作用當(dāng)前46頁，總共102頁?；貜?fù)突變(reversemutation或backmutation)：突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到恢復(fù)，這種第二次突變稱為回復(fù)突變。美國加利福尼亞大學(xué)的BruceAmes教授于1966年發(fā)明，因此稱為Ames試驗(yàn)具體操作：檢測鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphmurium)組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復(fù)突變率當(dāng)前47頁，總共102頁。當(dāng)前48頁，總共102頁。證明Ames試驗(yàn)重要性的應(yīng)用實(shí)例：國外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物“反應(yīng)?！?，由于其藥效顯著，在60-70年代十分流行，但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用“反應(yīng)?！?，后來采用Ames試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具有很強(qiáng)的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用但如果能在這種藥物上市之前就進(jìn)行Ames試驗(yàn)檢測，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免，當(dāng)前49頁，總共102頁。DNA修復(fù)機(jī)制當(dāng)前50頁，總共102頁。第四節(jié)基因轉(zhuǎn)移和重組細(xì)菌的四種水平基因轉(zhuǎn)移形式：接合轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體融合當(dāng)前51頁，總共102頁。一、轉(zhuǎn)化定義：同源或異源的游離DNA分子(質(zhì)粒和染色體DNA)被自然或人工感受態(tài)細(xì)胞攝取，并和受體細(xì)胞的基因組發(fā)生重組的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過程自然遺傳轉(zhuǎn)化（naturalgenetictransformation）人工轉(zhuǎn)化（artificialtransformation）感受態(tài)細(xì)胞：具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞當(dāng)前52頁，總共102頁。自然感受態(tài)與人工感受態(tài)的不同？自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長階段的生理特性，受細(xì)菌自身的基因控制；人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。

（該過程與細(xì)菌自身的遺傳控制無關(guān)?。┊?dāng)前53頁，總共102頁。1、自然遺傳轉(zhuǎn)化（簡稱自然轉(zhuǎn)化）1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，目前已知有二十多個種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力。自然轉(zhuǎn)化過程的特點(diǎn)：a）對核酸酶敏感；c）轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化（DNA）

給體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系；d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多；b）不需要活的DNA給體細(xì)胞；當(dāng)前54頁，總共102頁。提高質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率的兩種方法：1）使質(zhì)粒形成多聚體，這樣進(jìn)入細(xì)胞后重新組合成有活性的質(zhì)粒的幾率大大提高；2）在質(zhì)粒上插入受體菌染色體的部分片段，或?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)含有與該質(zhì)粒具有同源區(qū)段的質(zhì)粒的受體菌-------重組獲救當(dāng)前55頁，總共102頁。2、人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細(xì)胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段。在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。不是由細(xì)菌自身的基因所控制；用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高；當(dāng)前56頁，總共102頁。噬菌體DNA被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒3、轉(zhuǎn)染(transfection)：現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動物細(xì)胞的過程也稱轉(zhuǎn)染特點(diǎn)：提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。當(dāng)前57頁，總共102頁。二、接合(conjugation)通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程。1.實(shí)驗(yàn)證據(jù)1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm的細(xì)菌多重營養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn)。中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！當(dāng)前58頁，總共102頁。證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的“U”型管實(shí)驗(yàn)（BernardDavis，1950）當(dāng)前59頁，總共102頁。2.機(jī)制(大腸桿菌的接合機(jī)制)接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo)F因子的分子量通常為5×107，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛（sexpili）及控制接合過程進(jìn)行的20多個基因。含有F因子的細(xì)胞：“雄性”菌株（F+），其細(xì)胞表面有性菌毛不含F(xiàn)因子的細(xì)胞：“雌性”菌株（F-），細(xì)胞表面沒有性菌毛當(dāng)前60頁，總共102頁。F因子為附加體質(zhì)粒既可以脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可插入（整合）到染色體上當(dāng)前61頁，總共102頁。F因子的四種細(xì)胞形式：a）F-菌株，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收

F因子而變成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F(xiàn)因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細(xì)胞表面同樣有性菌毛。當(dāng)前62頁，總共102頁。1）F+×F-雜交F+菌株的F因子向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞的染色體DNA一般不被轉(zhuǎn)移。雜交的結(jié)果：給體細(xì)胞和受體細(xì)胞均成為F+細(xì)胞理化因子的處理可將F因子消除而使F+菌株變成F-菌株當(dāng)前63頁，總共102頁。Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移過程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F-細(xì)胞并發(fā)生重組，由此而得名為高頻重組菌株。2）Hfr×F-雜交當(dāng)前64頁，總共102頁。3）F′×F-雜交Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。F′×F-與F+×F-的不同：給體的部分染色體基因隨F′一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞a）與染色體發(fā)生重組；b）繼續(xù)存在于F′因子上，形成一種部分二倍體；當(dāng)前65頁，總共102頁。三、細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）由噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行遺傳交換的一種方式：一個細(xì)胞的DNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞中能將一個細(xì)菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個細(xì)菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)前66頁，總共102頁。1、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)給體染色體的任何部分到受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程(1)意外的發(fā)現(xiàn)1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder為了證實(shí)大腸桿菌以外的其它菌種是否也存在接合作用，用二株具不同的多重營養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)：用“U”型管進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)時，在給體和受體細(xì)胞不接觸的情況下，同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細(xì)菌！當(dāng)前67頁，總共102頁。形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的噬菌體可以是溫和的也可以是烈性的，但必須具有能偶爾識別宿主DNA的包裝機(jī)制并在宿主基因組完全降解以前進(jìn)行包裝。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本要求：當(dāng)前68頁，總共102頁。2、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializedtransduction）溫和噬菌體感染整合到細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時，在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中當(dāng)前69頁，總共102頁。a）被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因共價地與噬菌體DNA連接，與噬菌體DNA一起進(jìn)行復(fù)制、包裝以及被導(dǎo)入受體細(xì)胞中。

而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝的可能全部是宿主菌的基因。b）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個別基因?qū)胧荏w，故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。

而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶的宿主基因具有隨機(jī)性。局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別：當(dāng)前70頁，總共102頁。接合(conjugation)：細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸（由F因子介導(dǎo)）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：由噬菌體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(transformation)：游離DNA分子+感受態(tài)細(xì)胞當(dāng)前71頁，總共102頁?！敖雍稀薄稗D(zhuǎn)導(dǎo)”及“轉(zhuǎn)化”這三種在自然界中存在的細(xì)菌遺傳重組過程各自的特點(diǎn)：a）外源DNA的來源及進(jìn)入途徑有差異；b）決定因素也各有不同；當(dāng)前72頁，總共102頁。四、原生質(zhì)體融合當(dāng)前73頁，總共102頁。當(dāng)前74頁，總共102頁。當(dāng)前75頁，總共102頁。基因工程當(dāng)前76頁，總共102頁。當(dāng)前77頁，總共102頁。微生物與基因工程的關(guān)系：當(dāng)前78頁，總共102頁。第五節(jié)菌種選育三、雜交育種二、誘變育種一、自然選育四、基因工程當(dāng)前79頁，總共102頁。一、自然選育利用菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種選育的過程。要經(jīng)常進(jìn)行自然選育原因：微生物易變異，導(dǎo)致菌種衰退自然選育方法----------單菌落分離法當(dāng)前80頁，總共102頁。二、誘變選育通過誘變劑處理提高菌種的突變幾率，擴(kuò)大變異幅度，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株優(yōu)點(diǎn)：速度快、收效大、方法簡便步驟：突變的誘發(fā)、突變株的篩選、突變基因的表達(dá)當(dāng)前81頁，總共102頁。1、突變的誘發(fā)A、出發(fā)菌株的選擇純種、遺傳特性好、對誘變劑敏感的菌株B、誘變劑的選擇具體境況具體對待，不妨多試試C、影響誘變效果的因素菌種的遺傳特性、誘變劑的性質(zhì)、菌種的生理狀況、培養(yǎng)條件溫度、氧氣、光、酸堿性等當(dāng)前82頁，總共102頁。2、突變株的篩選A、隨機(jī)篩選a、搖瓶篩選法單菌落斜面搖瓶發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果較可靠缺點(diǎn)：工作量大、耗時、操作復(fù)雜當(dāng)前83頁，總共102頁。b、瓊脂塊篩選法含單菌落的瓊脂塊鑒定平板優(yōu)點(diǎn)：便捷缺點(diǎn)：結(jié)果不太可靠，需復(fù)篩c、篩選自動化和篩選工具微型化當(dāng)前84頁，總共102頁。B、理性化篩選篩選抗反饋突變菌株降低終產(chǎn)物濃度初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選當(dāng)前85頁，總共102頁。次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選利用營養(yǎng)缺陷型篩選篩選負(fù)變株的回復(fù)突變株篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選二價金屬離子抗性突變株篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株當(dāng)前86頁，總共102頁。3、突變基因的表達(dá)培養(yǎng)條件培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等當(dāng)前87頁，總共102頁。三、雜交育種四、基因工程當(dāng)前88頁，總共102頁。第六節(jié)菌種保藏當(dāng)前89頁，總共102頁。一、菌種的衰退與復(fù)壯1）從衰退的菌種群體中把少數(shù)個體再找出來，重新獲得具有原有典型性狀的菌種。2）有意識地利用微生物會發(fā)生自發(fā)突變的特性，在日常的菌種維護(hù)工作中不斷篩選“正變”個體。大量群體中的自發(fā)突變菌種的復(fù)壯：a）純種分離；b）通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯；菌種衰退的特點(diǎn)：當(dāng)前90頁，總共102頁。二、防止衰退的措施1）減少傳代次數(shù)；2）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件；3）經(jīng)常進(jìn)行純種分離，并對相應(yīng)的性狀指標(biāo)進(jìn)行檢查；4）采用有效的菌種保藏方法；當(dāng)前91頁，總共102頁。

菌連續(xù)在培養(yǎng)基上（內(nèi)）移種種生活態(tài)傳代培養(yǎng)保藏法連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種保固體斜面藏濕法半固體瓊脂柱方休眠態(tài)液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管內(nèi)吸附在合適的載體上三、菌種保藏在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：當(dāng)前92頁，總共102頁。菌種保藏機(jī)構(gòu)的任務(wù)：廣泛收集科研和生產(chǎn)菌種、菌株，并加以妥善保管，使之達(dá)到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。菌種保藏機(jī)構(gòu)：

中國微生物菌種保藏委員會(CCCCM)

美國的典型菌種保藏中心(ATCC)

英國國家典型菌種保藏所（NCTC）法國里昂巴斯德研究所（IPL）國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)：當(dāng)前93頁，總共102頁。由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，迄今為止尚沒有一種方法能被證明對所有的微生物均適宜。因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點(diǎn)及現(xiàn)有條件等進(jìn)行綜合考慮。對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進(jìn)行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。當(dāng)前94頁，總共102頁。(一)菌種保藏的原理

根據(jù)菌種的生理、生化特性，人工創(chuàng)造條件使菌種的代謝活動處于休