分離工程第八章

分離工程第八章第一頁，共六十六頁，2022年，8月28日本章主要知識點電泳的概念電泳的基本原理電泳技術的分類常用的凝膠電泳技術有哪些？電泳裝置的基本組成聚丙稀酰胺凝膠電泳的一般過程第二頁，共六十六頁，2022年，8月28日SDS電泳的基本原理及過程瓊脂糖電泳的特點及其應用等電聚焦電泳的基本原理雙相電泳的概念及其特點第三頁，共六十六頁，2022年，8月28日電泳的簡單原理蛋白質、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質的H+濃度或與其它大分子的相互作用。帶電粒子在電場中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小和形狀、分子所帶電荷或分子的生物學與化學特性。第四頁，共六十六頁，2022年，8月28日第五頁，共六十六頁，2022年，8月28日電泳：是荷電溶質在電場作用下發(fā)生定向泳動的現(xiàn)象。電泳分離是利用荷電溶質在電場中泳動速度的差別進行分離的方法。20世紀初，電泳法用于蛋白質的分離，20世紀70年代，電泳多用于分析目的。第六頁，共六十六頁，2022年，8月28日（1）自由電泳：是最早的一種電泳形式，目前已很少使用。瑞典管內蛋白質溶液和緩和液間有清晰可見界面，然后加一電場，由于界面處存在濃度梯度因而產生折射梯度，利用適當?shù)墓鈱W系統(tǒng)可以觀察到界面的移動。第七頁，共六十六頁，2022年，8月28日在電泳過程中，每個移動的界面相當于某一特定的蛋白質，通過一定計算可得其泳動度。第八頁，共六十六頁，2022年，8月28日缺點：電泳中因通電發(fā)熱等原因而引起的對流，常回使已分離的溶質重新混合，為防止對流，可將電泳在多孔介質中進行，稱為區(qū)帶電泳。區(qū)帶電泳：應用支持介質的電泳，它表示在一個電場的作用下，在某一支持物上能將一個樣品組成徹底分離成若干條區(qū)帶的過程。第九頁，共六十六頁，2022年，8月28日（2）區(qū)帶電泳：在支持物上電泳時蛋白質混合物被成若干區(qū)帶。根據(jù)支持物物理性質的不同可分為4類：濾紙電泳和薄膜電泳，粉末電泳，細絲電泳，凝膠電泳。多孔介質稱為載體，應用最普通的是以濾紙或凝膠為載體故稱為紙電泳法或凝膠電泳法。第十頁，共六十六頁，2022年，8月28日第一節(jié)凝膠電泳法凝膠電泳的作用是基于凝膠過濾作用（分子篩作用）和電泳淌度的雙重機理，所以它能獲得較高的分辨率。凝膠電泳：凝膠過濾作用（分子篩作用）電泳淌度正比于電荷數(shù)（電荷效應）單位電場強度下的運動速度稱為離子淌度或遷移率。第十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應在使用凝膠介質的電泳中，由于電泳介質具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不僅可以防止對流，而且可以把擴散減到最小。凝膠中的大分子分離取決于它的電荷、尺寸和形狀凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力（Sizesievingcapacity），這種現(xiàn)象被稱為分子篩效應（molecularsievingeffect）第十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日分子篩效應圖中A，B，C均為陽離子，在直流電場作用下電泳情況示意圖分子量大小依次為MA=MB>MC，所帶電荷量相同QA=QB=QC。ABC+-第十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日常用的凝膠材料：聚丙烯酰胺、瓊脂糖凝膠。聚丙烯酰胺（丙烯酰胺）單體是神經毒素，可積累。凝膠電泳使用的凝膠種類和濃度根據(jù)分離料液中溶質的相對分子質量而異。第十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日聚丙烯酰胺含量適用的分子量范圍7.5%凝膠10kD~1000kD3.5%凝膠1000kD~5000kD瓊脂糖或瓊脂糖與聚丙烯酰胺混合物>5000kD孔徑從小到大。第十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日垂直電泳槽及灌膠模具第十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日電泳的一般過程第十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日第十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日聚丙酰胺電泳第十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日凝膠電泳與凝膠過濾的區(qū)別在凝膠電泳中，樣品混合物中各分子的運動速度是小分子大于大分子物質，這種凝膠過濾中的情況恰好相反，這是因為在凝膠電泳中，系統(tǒng)里沒有空隙體積，只有充滿整體凝膠的網狀骨架，因此在其內部大分子物質不及小分子物質容易移動。第二十頁，共六十六頁，2022年，8月28日常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是多孔介質，不僅能防止對流，把擴散減少到最低；而且其孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級，能主動參與生物分子的分離，具有分子篩效應。因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質分離時，在電泳過程中不僅取決于蛋白質的電荷密度，還取決于蛋白質的尺寸和形狀。PAGE可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳第二十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日電泳前的準備工作緩沖系統(tǒng)的選擇：保證蛋白質的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持；電泳時間和分辨率：從理論上講PAGE可以在任何pH進行，但實際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。因此，pH應限制在3~10之間。第二十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日緩沖系統(tǒng)的選擇原則是兩種標準的對立權衡如果緩沖液的pH選擇在遠離樣品中各種蛋白的等電點，蛋白質分子所帶電荷的密度大，電泳時間短，區(qū)帶細而窄；如果緩沖pH選擇在靠近被分離樣品的一種或幾種蛋白質的等電點，則蛋白質分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高； 因此，常常選擇pH8.0~9.5的緩沖，常用的緩沖液有Tris-甘氨酸（pH8.3~9.5），Tris-硼酸(pH8.3~9.3)和Tris-醋酸（pH7.2~8.5）第二十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日離子強度的選擇離子強度不宜過高，此時電導率低，產熱少，電泳速度快；但也不可過低，必須具有一定的緩沖能力，過低的離子強度容易導致蛋白質絮凝。一般選擇緩沖液的離子強度為0.01~0.1mol/L之間第二十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日凝膠濃度的選擇由于PAGE電泳分離不僅取決于蛋白質的電荷密度，而且取決于分子的大小、形狀。因此，與凝膠的分子篩效應（即凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關。根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為：非排阻性凝膠（unrestrictivegel）:濃度0.7~1.0%的瓊脂糖凝膠；排阻性凝膠（restrictivegel）：濃度大于1%的瓊脂糖凝膠和常規(guī)PAGE第二十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質分子不能進入凝膠，樣品仍留在加樣位置；凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質分子均隨緩沖液推進，不能得到很好的分離；第二十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日凝膠濃度(C=2.6%)分子量范圍(kDa)凝膠濃度(C=5%)分子量范圍(kDa)530~200560~7001015~1001022~2801510~501510~200202~15205~150凝膠濃度與分子量測定的關系第二十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日PAGE的具體操作過程制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖液），使用灌膠模具灌膠；樣品準備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適的樣品濃度（1~2mg/L，考染），加樣（溴酚藍）；電泳：4~6小時，待溴酚藍前沿到達陽極底部；檢測：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍R-250、銀染色—靈敏度比考染高100倍、熒光探針）；照相、凝膠干燥：定量測定：第二十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日凝膠電泳：裝柱操作，鋪板操作。近來聚丙烯酰胺凝膠電泳法有了兩個新進展：A、不連續(xù)凝膠電泳。B、十二烷基硫酸鈉(SDS)—聚丙烯酰胺凝膠電泳。第二十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日1、不連續(xù)凝膠電泳：不連續(xù)凝膠由兩層組成，上層為濃縮層（丙烯酰胺2~3%），下層為分離層（丙烯酰胺5~25%）。第三十頁，共六十六頁，2022年，8月28日第三十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺為支持物，制成凝膠柱。凝膠柱由二節(jié)凝膠組成（小節(jié)濃縮膠，大節(jié)分離膠）。這二節(jié)膠孔徑大小，緩沖液離子成分和離子強度值，電場強度都是不同的。第三十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日樣品先被壓縮一個薄層，然后進行電泳。一般經過三個效應，濃縮效應，分子篩效應，電荷效應，使樣品分離效果好，分辨率高。第三十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日2、十二烷基硫酸鈉（SDS)—聚丙烯酰胺凝膠電泳一種加陰離子去污劑—SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳。主要用途：分離蛋白質和測定它的相對分子量。第三十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于測定蛋白質亞基分子量以及未知蛋白質分子量的測定；特點：設備簡單、操作簡便、測定快速、重復性高、樣品無需純化。第三十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日基本原理：SDS能以一定比例與蛋白質結合，并使蛋白質帶有大量的負電荷，（大大超過原來所帶電荷），從而使天然蛋白質分子之間電荷差別下降乃至消除。同時蛋白質的結構也在SDS作用下變的松散（蛋白質變成多肽），形狀趨于一致，排除了電泳過程中電荷的影響，使SDS—聚丙烯酰胺電泳時，蛋白質遷移率的差異僅是相對分子質量的函數(shù)。第三十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日SDS的原理蛋白質分子的解聚SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級、三級結構；而強還原劑，如二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。因此，在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，蛋白質分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈與SDS結合后，形成帶負電的蛋白質-SDS膠束，所帶電荷遠遠超過了蛋白質原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異；同時，蛋白質-SDS聚合體的形狀也基本相同，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。第三十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日蛋白質樣品用SDS處理后亞基的解聚和分子形狀的改變第三十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日未知蛋白質分子量的測定基于上述SDS的原理介紹，我們可以利用SDS電泳進行未知蛋白質的分子量測定；以不同分子量的標準蛋白進行SDS電泳得到不同標準蛋白的電泳遷移率，制作標準校正曲線，然后對未知蛋白在相同條件下進行SDS電泳，測定遷移率，從標準曲線得到相應的分子量；第三十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日LgM

=A-KRmM—相對分子量A—常數(shù)K—斜率Rm—遷移率由于蛋白質結合SDS的量與蛋白質種類、pH、I、緩沖液組成有關。一般都必須用已知相對分子量蛋白質作為指示蛋白質、與被測樣品在同一條件下進行電泳，給出LgM–Rm曲線，求出樣品Rm值對應的LgM，計算出被測樣品相對分子量。第四十頁，共六十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)等電點聚焦等電點聚焦（IEF)：利用蛋白質和氨基酸等兩性電解質具有等電點，在等電點的pH下呈電中性，不發(fā)生泳動的特點進行電泳分離。在電泳設備中首先調配連續(xù)的pH梯度，然后使蛋白質在電場作用下泳動到各自等電點的pH區(qū)域形成具有不同等電點的蛋白質區(qū)帶。第四十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日等電聚焦原理示意圖第四十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日裝置:第四十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日特點：優(yōu)點：消除分子擴散引起的分離度下降。缺點：

1、載體兩性電解質對產品產生污染；

2、pH梯度的穩(wěn)定性不高；

3、操作過程中發(fā)生凝膠脫水起皺現(xiàn)象。第四十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日載體兩性電解質pH梯度等電聚焦等電聚焦（isoelectrofocusing）,IEF

利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進行蛋白質的分離和分析。利用等電聚焦技術分離、分析的對象僅限于蛋白質和兩性分子。根據(jù)建立pH梯度的原理不同，梯度有分為載體兩性電解質梯度（CarrierampholytespHgradient）和固相梯度。第四十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日工作原理蛋白質的等電點 蛋白質最主要的特性是它的帶電行為，它們在不同的pH環(huán)境中帶不同數(shù)量的正電或負電，只是在某一pH時，蛋白質的凈電荷為0，此pH即為該蛋白的等電點（isoelectricpointpI）。蛋白質的等電點取決于它的氨基酸組成和構象，是一個物理化學常數(shù)?？梢岳玫入婞c差異來進行蛋白質的分離、分析

第四十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日載體兩性電解質pH梯度等電聚焦原理載體兩性電解質pH梯度等電聚焦是在支持介質中加入載體兩性電解質，通以直流電后在兩極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度，當帶電的蛋白質分子進入該體系時，便會產生移動，并聚集于相當于其等電點的位置。第四十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日等電聚焦分離示意圖第四十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日常規(guī)PAGE和等電聚焦電泳的區(qū)別第四十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日載體兩性電解質和pH梯度的形成等電聚焦技術的關鍵在于pH梯度的建立載體兩性電解質的概念：作為載體兩性電解質應該具有以下特點：應該是兩性的，使它們在分離柱中也能達到一個平衡位置；應該可以作為“載體”，兩性電解質不能用于等電聚焦，只有載體兩性電解質，即具有好的導電性和好的緩沖能力的化合物才能用于等電聚焦。第五十頁，共六十六頁，2022年，8月28日用于等電聚焦的主要載體兩性電解質Ampholine(瑞典LKB公司)由許多脂肪族的多氨基多羧基的異構體和同系物組成，它們具有連續(xù)改變的氨基與羧基比Servalyte(德國Serva公司)產品BiolytePharmalyte(瑞典Pharmacia公司)產品分為九種pH范圍第五十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日pH梯度的形成在沒有電場時，載體兩性電解質的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值，所有載體兩性電解質分子都荷電。當引入電場時，載體兩性電解質分子將向陰極或陽極遷移，帶有最低等電點的分子（荷最多負電）將最快地向陽極移動；當它達到凈電荷為0的位置時才停止，這個位置靠近陽極，由于它具有高的緩沖能力，使環(huán)境溶液的pH等于分子本身的pI。第五十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日其次，一些低pI的載體兩性電解質（荷其次多的負電）也向陽極移動，直到它的凈電荷減少到0才停止。同樣的，其周圍環(huán)境溶液pH值也等于它本身的pI。依次類推，所有的載體兩性電解質分子用增加pI級數(shù)的方法將分別在陽極、陰極之間到達它們自己的位置，從而給出一個pH梯度。第五十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日載體兩性電解質在電場中

形成pH梯度的模式圖第五十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日水平等電聚焦電泳制膠：溶液配制（丙烯酰胺、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺、載體兩性電解質等），灌膠；電泳：加樣可在凝膠上的任何位置，濃度一般為0.5~2mg/ml；固定：染色：脫色：第五十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日第五十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日等電聚焦的主要應用同工酶分離、分析pI測定 實際應用當中，等電聚焦的操作過程要復雜得多，具體內容可參考《蛋白質電泳實驗技術》，作者：郭堯君，科學出版社。第五十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日雙相電泳第一相等電聚焦第二相SDS－PAGE目的：為了獲得更詳細的組分信息目前已經廣泛應用于蛋白質組研究中第五