郜剛分子生物學-10-3-RNA操作

RNA的制備分子生物學技術(shù)講義郜剛山西師范大學生命科學學院3DmodelofRNAmolecule,withphosphatebackbone(gray)andsecondarystructure(blue)5.3.1RNA提取概述要了解生物某個器官或結(jié)構(gòu)的功能和作用機理，一個重要的方式就是從分子角度去研究其功能基因的表達和調(diào)控，而分離得到高質(zhì)量的RNA是進一步研究進行的首要條件,比如從植物組織中提取RNA是進行植物分子生物學方面研究的必要前提。要進行Northern雜交分析，純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR及差示分析等分子生物學研究，都需要高質(zhì)量的RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進行上述研究的關鍵所在。RNA的制備與分析對于了解基因表達在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)是必不可少的,也是最常使用的通過cDNA途徑分析細胞基因表達的前提。植物細胞內(nèi)的RNA主要是rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和mRNA（占1～5％）。rRNA含量最豐富，由25S、18S和5S幾類組成。mRNA種類繁多，分子量從數(shù)百至數(shù)千堿基不等，但絕大多數(shù)mRNA在3’端都有一個polyA尾巴，因此，可根據(jù)此特性用寡聚脫氧胸苷(OligodT)層析柱從總RNA中將mRNA分離出來。一般情況下，提取的總RNA也可用于Northernblot試驗。RNA分析通常一個典型的哺乳動物細胞約含10-5μgRNA，但其中大部分為rRNA及tRNA，而mRNA僅占1%～5%。雖然mRNA大小和序列各不相同，但在多數(shù)真核細胞mRNA的3’末端都帶有一段較長的多腺苷酸鏈。這個群體編碼了所有由該細胞合成的多肽。RNA分析其實是對組織細胞總RNA中的mRNA進行分析。最常用的方法主要有:原位雜交、RT-PCR、Northern,另外還有:Sl

核酸酶作圖分析、引物延伸法等RNA是一類極易降解的分子在所有RNA實驗中,最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定,一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解,而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果,所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實驗中,一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。

RNA酶可耐受多種處理而不被滅活,如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等,也可存在于灰塵中。在其他分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。各種組織和細胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。RNaseAStructureofH(PDBid:1JL1)generatedusingwithpreset:pretty

Ribonuclease

A(RNaseA)withthefourdisulfidebondsenlargedandhighlightedingreen無孔不入的RNases即使是100度高溫或者是高壓滅菌也不能完全滅活防止RNA酶的污染1.如果可能，實驗室應專門辟出RNA操作區(qū)，離心機，移液器，試劑等均應專用。RNA操作區(qū)應保持清潔，并定期行除菌。2.如果可能，在超凈臺中按照細胞培養(yǎng)的要求進行操作，可以有效避免操作中引起的RNA酶污染。3.操作過程中應始終戴一次性橡膠手套，并經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶到試管或污染用具，盡避免使用一次性塑料手套。塑料手套不但常常造成操作不便，且塑料手套的多出部分常常在器具的RNase污染處和RNase-free處傳遞RNase，擴大污染。4.避免在操作中說話聊天。也可以戴口罩以防止引起RNA酶污染。5.盡量使用一次性的塑料制品，盡量避免共用器具如tips，tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經(jīng)常使用RNaseH，T1等，在操作過程中極有可能造成移液器、離心機等的污染。而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。6.關于一次性塑料制品，建議使用廠家供應的出廠前已經(jīng)滅菌的tips和tubes等。多數(shù)廠家供應的無菌塑料制品很少有RNA酶污染，買來后可直接用于RNA操作。許多研究者用DEPC等處理的塑料制品，往往由于二次污染而帶有RNA酶，從而導致實驗失敗。7.配制溶液用的酒精、異丙醇、Tris等應采用未開封的新瓶。8.所有舊塑料制品都必須用0.5M的NaOH處理10分鐘，用雙蒸水徹底沖洗，DEPC-H20浸泡過夜后滅菌。9.無法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通?？梢韵齊NA酶的活性。但氯仿會溶解某些塑料制品，應當注意。如用180℃干烤8小時以上處理玻璃器皿，或用0.1的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相關的緩沖液也需要用0.1DEPC水處理，但Tris-Cl緩沖液等不可以用DEPC處理。注意：DEPC有致癌之嫌，必須小心操作，防止接觸與吸入！RNA酶抑制劑1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。DEPC即diethypyrocarbonate，中文名為焦碳酸二乙酯。分子式為C6H10O5，分子量為162.142、異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。3、氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin)：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑,可以和多種RNA酶結(jié)合,使其失活。5.其他SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用10.RNase

AwayTM試劑可以替代DEPC，操作簡單，價格低，且無毒性。只需將RNaseAwayTM直接倒在玻璃器皿和塑料器皿的表面，浸泡后用水沖洗去除，即可以快速去除器皿表面的RNase，并且不會殘留而干擾后繼實驗。RNA制備方法苯酚法：用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；胍鹽法：用異硫氰酸胍或鹽酸胍和-巰基乙醇變性蛋白，并抑制RNase的活性，經(jīng)酚氯仿抽提后再沉淀；氯化鋰沉淀法：因為鋰在在一定pH下能使RNA相對特異地沉淀，但容易使小分子RNA損失，而且殘留的鋰離子對mRNA有抑制作用。特定的試劑盒法常用的有4種較為成熟的分離總RNA的方法，:操作方案一：經(jīng)典方法：苯酚+胍鹽法

也是很少有人用的方法方案一：改良法：經(jīng)典方法：苯酚+胍鹽法

1.取1.2g幼葉。放入研缽，在液氮中研磨成粉末狀，移入10mL離心管。加入

4mol/L異硫氰酸胍4mL

苯酚3mL

2mol/LNaAc(pH4.8)0.3mL

氯仿0.6mL

混勻，冰浴放置30min。

2.4℃，8000r/min，離心（機）13min。

3.棄沉淀，取上清至另一干凈無菌離心管中。DEPC處理烘干4.加入2倍體積無水乙醇，-70℃，0.5h。5.4℃，8000r/min，離心13min。6.棄上清，在沉淀中加入1mL4mol/LLiCl，使其溶解。7.移入1.5mL離心管中，冰浴2h。8.4℃，13000r/min，離心15min。9.棄上清，在沉淀中加入400uLDEPC水，再加入400uL氯仿，混勻。

10.4℃，13000r/min，離心6min。11.取上清，并加入1/10體積3mol/LNaAc（pH5.0），2倍體積無水乙醇，-20℃，放置30min。12.4℃，13000r/min，離心20min。13.將沉淀RNA用70%乙醇洗滌2次。14.將沉淀RNA室溫下稍干燥。15.加30uLDEPC水溶解，-70℃保存。Trizol法—傻瓜法一步法總RNA提取試劑Trizol主要是由酚與異硫氰酸胍組成的均相溶液。不僅可直接用于從人類、動物、植物、細菌等細胞或組織中提取總RNA，而且還可以從樣品中提取DNA或蛋白質(zhì)。純化的總RNA完整性好，不受蛋白、DNA的污染。可用于Northern雜交、RNA點雜交、poly(A)+mRNA的分離、體外轉(zhuǎn)錄、RT-PCR、RNase封阻分析以及分子克隆p185Trizol+異丙醇

利用Trizol提取液抽提RNA，具體步驟如下：

1.取幼葉約250mg在液氮中研磨至細粉，轉(zhuǎn)入預冷的1.5ml離心管；2.加入1mlTRIZOL提取液震蕩搖勻；3.室溫放置5min后，加入0.5ml的氯仿，劇烈搖動離心管5min；4.在8℃條件下，12000rpm離心15min；5.溶液分為兩層，下層為酚－氯仿淺紅色液層，將上層液體移入干凈離心管，加入0.5ml異丙醇在15~30℃條件下，沉淀10min；6.然后在,2~8℃條件下，12000rpm離心10min，RNA沉淀管壁和底部；7.去掉液體部分，加入1ml75%酒精洗2次；8.風干后，加入25µlDEPC處理過的水溶解RNA，儲藏于-80℃冰箱備用。Trizol+吸附柱加入液氮研磨加入Trizol，研磨轉(zhuǎn)移至離心管劇烈渦旋離心，上清過柱消化DNA洗脫，回收RNA產(chǎn)量一般為1~15μgRNA/mg組織或1×106個細胞，A260/A280的比率一般在1.6~1.8之間試劑盒聰明的傻瓜法Qiagen

RNeasy植物RNA提取試劑盒依據(jù)胍鹽法。即在含有強的異硫氰酸胍變性劑的提取液中裂解植物組織粉末，在提取緩沖液中含有RNase抑制劑，抑制RNase活性，保證RNA的完整性。通過第一次離心柱時細胞碎片被阻留在柱子上，溶液均質(zhì)化，包括RNA在內(nèi)的分子物質(zhì)通過離心柱。加入乙醇后，再過第二個離心柱，RNA就結(jié)合在柱子底部有硅膠的膜上，洗去其它雜質(zhì)，最后用無RNase的水溶出RNA。該柱子可結(jié)合100g大于200bp的RNA，所以應控制起始材料的用量。QIAGEN試劑盒原理3.實驗材料與試劑材料：新鮮植物組織（水稻）試劑：Qiagen

RNeasy植物試劑盒，甲醛，瓊脂糖電泳系統(tǒng)，凝膠成象系統(tǒng)等。4.實驗方法和步驟實驗步驟（每一步均要求無RNase污染）①稱取新鮮材料100mg，液氮速凍；②在預冷的研缽中并在液氮中將材料研磨成細粉末，轉(zhuǎn)移到2ml或1.5ml離心管中；③待液氮揮發(fā)（但不能解凍）后，加入450μl提取緩沖液RLT，混勻后在56℃下溫育1～3min；④將裂解液加到離心柱（淡紫色）上下接一個2ml收集管，最大轉(zhuǎn)速離心2min。裂解液通過柱子時被均質(zhì)化，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移到另一新離心管；加入0.5倍體積（225μl）96～100%乙醇，混合均勻。加入乙醇后，可能會出現(xiàn)沉淀，無影響；細胞碎片被阻留在柱子上，包括RNA在內(nèi)的分子物質(zhì)通過離心柱所謂均質(zhì)化將混合液全部（包括沉淀675μl）轉(zhuǎn)移到吸附離心柱（粉紅色）內(nèi)，下接2ml的收集管，10000rpm離心15秒。棄去管內(nèi)液體；⑦加入700μlRW1緩沖液，10000rpm轉(zhuǎn)速下離心25秒，棄去收集管；⑧將離心柱轉(zhuǎn)移到一個新的2ml收集管上，加入500μlRPE緩沖液，10000rpm離心15秒，棄去管內(nèi)液體重復使用收集管；加入500μlRPE到離心柱內(nèi)，最大轉(zhuǎn)速離心2min，干燥離心柱，棄去收集管；⑩把離心柱接在一個新的1.5mlEppen管上，加入30～50μl無RNase水（0.1%DEPC處理），10000rpm離心1min，洗出RNA。若RNA產(chǎn)量在20μg以上，用30～50μl無RNase水再洗脫1次。RNA樣品保存于-20℃?zhèn)溆?。RNA的檢測：RNA的檢測主要用瓊脂糖凝膠電泳，分為非變性電泳和變性電泳。一般變性電泳用的最多是甲醛變性電泳（如Northernblot實驗過程中）。由于RNA分子是單鏈核酸分子，它不同于DNA的雙鏈分子結(jié)構(gòu)，其自身可以回折形成發(fā)卡式二級結(jié)構(gòu)及更復雜的分子狀態(tài)，以至通過一般傳統(tǒng)的瓊脂塘凝膠電泳難以得到依賴于分子量的電泳分離條帶，為此電泳上樣前將樣品于65攝氏度加熱變性5分鐘，使RNA分子的二級結(jié)構(gòu)充分打開，并且在瓊脂糖凝膠中加入適量的甲醛，可保證RNA分子在電泳過程中持續(xù)保持單鏈狀態(tài)，因此，總RAN樣品便在統(tǒng)一構(gòu)像下得到了瓊脂糖凝膠上的依賴于分子量的逐級分離條帶。而且RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜的結(jié)合。

RNA通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，可以直觀快捷的分析RNA質(zhì)量之優(yōu)劣，當有標準的“分子標尺”（marker）存在時，還可相對客觀的對總RNA樣品進行定性和定量。為測定片段大小，可在同一塊膠上加標記物一同電泳，之后將標記物膠切下，上色、照像。瓊脂糖凝膠非變性電泳

所需試劑：

10ⅹ凝膠緩沖液嗎啉代丙磺酸（MOPS）（pH7.0）200mmol/L

NaAC50mmol/LEDTA（pH8.0）10mmol/L

用DEPC水配制，用NaOH調(diào)節(jié)pH＝7.0。過濾除菌后避光保存。

10ⅹ電泳上樣緩沖液

50％（V/V）甘油（用DEPC處理的水稀釋）

10mmol/LEDTA（pH8.0）

0.25％（m/V）溴酚藍

0.25％（m/V）二甲苯青FF凝膠制備（1.2％）：用1ⅹ凝膠緩沖液配制1.2％的凝膠，至少使其凝固30分鐘后進行上樣；樣品制備：在離心管中，將RNA樣品與10ⅹ上樣緩沖液以9:1比例混勻，迅速在冰上冷浴5分鐘，瞬時離心數(shù)秒。RNA上樣量為2-30g，本次實驗為10g；上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入加樣孔，以5V/cm的電壓電泳1h～1.5h；待溴酚藍遷移至凝膠長度的4/5處結(jié)束電泳。將凝膠置于溴化乙錠溶液中染色約30min；在紫外燈下觀察結(jié)果(如果用于Northernblot,在凝膠轉(zhuǎn)膜前應做好移動距離的標記)。步驟：瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳步驟：制備凝膠(1.2％)：稱1.2克瓊脂糖，加72mlDEPC處理的水，加熱溶化。冷卻至60oC，在通風廚內(nèi)加入10×凝膠緩沖液10ml，甲醛（37％）18ml，混均后到入凝膠模具中。樣品制備：在離心管里，將RNA樣品與10×樣品緩沖液以9：1比例混合。65oC溫浴5－10分鐘，迅速在冰上冷浴5分鐘，瞬時離心數(shù)秒。對于Northern雜交實驗，總RNA上樣量可達到10-30g。上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。以5V/cm的電壓電泳1.5h-2.0h。待溴酚藍遷移至凝膠長度2/3-4/5處結(jié)束電泳。將凝膠置于溴化乙錠溶液(0.5g/mL，用0.1mol/mL乙酸胺配制)中染色30min。在紫外燈下觀察結(jié)果。100mg葉子可以提到80g（溶于50l），點樣量每個孔2-10g。北京天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒產(chǎn)品名稱目錄號

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TrizolDP405-01/0220ml/100ml180/600RNAplantDP407-01/0220ml/100ml180/600RNAsimpleDP41950次680RNAcleanDP41220次360RNAprep動物組織/細菌DP40150次880RNAprep植物DP40250次780Quant逆轉(zhuǎn)錄酶ER103-02/03/0425/50/100次850/1500/2800Quantscript

cDNA第一鏈合成試劑盒KR103-01/0250/200次2500/7500TIANscriptM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶ER104-01/0210000/50000U450/1800TIANscript

cDNA第一鏈合成試劑盒KR10450次1200Q：RNA降解怎么回事？A：

1.新鮮細胞：如果試劑沒有問題，且外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中裂解細胞，一定要使裂解液能覆蓋住細胞。2.新鮮組織：某些富含內(nèi)源核酸酶的樣品(如肝臟，胸腺等)，即使使用電動勻漿器勻漿也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮條件下將組織研碎，并且勻漿時使用更多裂解液。3.冷凍樣品：樣品取材后應立即置于液氮中速凍，然后移至-70℃冰箱保存。樣品決不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于