基因編輯的學習材料

基因編輯的學習材料第1頁/共19頁1.誕生背景

全基因組測序技術的不斷發(fā)展和完善+大型基因組注釋項目的實現(xiàn)基因革命（轉化醫(yī)學、精準醫(yī)療）2將大量數(shù)據(jù)轉化為功能和臨床相關知識需要有高效、可靠的方法確定基因型如何影響表型同源重組優(yōu)點：定向失活，準確。缺點：插入目標位點的效率低

篩選過程費時費力

有可能產生不利的突變效應RNAi基因靶向抑制技術優(yōu)點：快捷、廉價、高通量缺點：效果不夠徹底，影響因素眾多不可預知的脫靶效應基因編輯技術（近十年出現(xiàn)）:對各種細胞和各種生物體內的幾乎任意基因進行人工操作第2頁/共19頁2.1基因編輯定義

基因編輯，是指對DNA核苷酸序列進行定點修飾（刪除和插入等操作）的一項技術，該技術可精確剪斷靶DNA片段并插入新的基因片段，既可模擬基因的自然突變，又能修改、編輯原有基因組，真正實現(xiàn)“編輯基因”。3第3頁/共19頁2.2基因編輯原理（一）DNA修復系統(tǒng)主要通過兩種途徑修復DNA雙鏈斷裂,即非同源末端連接（Nonhomologousendjoining,NHEJ）和同源重組（homologousrecombination,HR）。通過這兩種修復途徑，基因組編輯技術可以實現(xiàn)三種基因組改造的目的，即基因敲除，特異突變的引入和定點轉基因。4第4頁/共19頁51）基因敲除：如果想使某個基因的功能喪失，可以在這個基因上產生DSB，NHEJ修復的過程中往往會產生DNA的插入或刪除（indel），造成移碼突變，從而實現(xiàn)基因敲除。2）特異突變引入：如果想把某個特異的突變引入到基因組上，需要通過同源重組來實現(xiàn)，這時候要提供一個含有特異突變同源模版。正常情況下同源重組效率非常低，而在這個位點產生DSB會極大的提高重組效率，從而實現(xiàn)特異突變的引入。3）定點轉基因：與特異突變引入的原理一樣，在同源模版中間加入一個轉基因，這個轉基因在DSB修復過程中會被拷貝到基因組中，從而實現(xiàn)定點轉基因。第5頁/共19頁2.2基因編輯原理6（二）人工構建或尋找一個內切酶，在預定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內的DNA修復系統(tǒng)修復過程中會產生突變，從而達到定點改造基因組的目的，如鋅指蛋白（ZNF）、類轉錄激活因子（TALEN）、Cas蛋白等。所有基因編輯系統(tǒng)關鍵組成部分：1、DNA識別域2、核酸內切酶第6頁/共19頁3、發(fā)展歷程

7第一代：鋅指核酸內切酶（zincfingerendonuclease,ZFN)，可將鋅指蛋白與核酸內切酶FokI融合形成的核酸內切酶，利用它可以在各種復雜基因組的特定位置制造DNA的雙鏈切口。DNA識別域：由一系列Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成（一般3~4個），每個鋅指蛋白識別并結合一個特異的三聯(lián)體堿基。核酸內切酶：非特異性核酸內切酶FokI，形成二聚體時切割雙鏈DNA。第7頁/共19頁TALEN第二代：類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)，TALEN可以和ZFN一樣可對復雜的基因組進行精細的修飾，同時其構建較為簡單，特異性更高，因此受到了科研工作者的青睞。8DNA結合結構域：TALE蛋白是由一連串33~35個氨基酸組成的重復結構域組成的，其中每一個結構域都能夠識別一對堿基該區(qū)域主要由兩個高度可變的氨基酸決定，被稱作重復可變雙氨基酸殘基位點（repeat-variable

di-residues,

RVD）。與鋅指結構域一樣，這種TALE重復模塊也能夠串聯(lián)起來，識別一長串的DNA序列。核酸內切酶：非特異性核酸內切酶FokI，形成二聚體時切割雙鏈DNA第8頁/共19頁全長為34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異性識別核苷酸堿基。NG可以識別THD可以識別CNI可以識別ANN可以識別G或A通過這種特異性識別，將多個Tal蛋白組裝在一起，再加上FokI核酸內切酶，就可以構成可以識別目的片段的Tale蛋白。TALEN原理9第9頁/共19頁TALEN的特異性打靶的原理：一對可以特異性識別靶基因的TALE，定位到需要編輯的基因組區(qū)域；然后非特異性核酸內切酶FokI切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）；再通過DNA的自我修復，引起堿基的缺失或突變，從而引起基因突變。FokI只有在形成二聚體的時候才有內切酶活性。TALEN原理10第10頁/共19頁TALEN介導的基因編輯TALEN質粒對共轉入細胞后，表達兩個融合蛋白，分別與靶位點特異結合，由于兩個TALEN融合蛋白中的FokI臨近，形成二聚體，發(fā)揮非特異性內切酶活性，在兩個靶位點之間剪切DNA。形成DSB時，同源重組可將需要敲入的序列組合入基因組。11第11頁/共19頁CRISPR-Cas912第三代：規(guī)律間隔成簇短回文重復序列-Cas蛋白（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9)，是在細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)的，基于細菌獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，CRISPR序列能特異性識別外源核酸序列；Cas蛋白的非特異性核酸內切酶功能將外源核酸切斷。GeorgeChurch第12頁/共19頁13DNA識別域：向導RNA，由兩部分組成：CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA(transactingCRISPRRNA,tracrRNA)，crRNA一端與雙鏈核苷酸互補結合，另一端與tracrRNA互補結合，形成向導RNA。核酸內切酶：

Cas9核酸內切酶第13頁/共19頁14Cas9蛋白與向導RNA結合、組裝的動作是這套位點特異性的基因組修飾過程里的限速步驟。CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求為PAM序列（5’-NGG-3’），即靶序列后面必須為NGG才能被向導RNA識別，在人類基因組中平均每8個堿基就可以出現(xiàn)一個NGG。第14頁/共19頁研究方向15不足：ZNF和TALEN成本高昂、效率不高CRISPR-Cas系統(tǒng)脫靶效應、安全性改進：a.優(yōu)化sgRNA結構可提高基因編輯效率、解決脫靶問題b.新系統(tǒng)開發(fā)：一種靶向作用于RNA而不是DNA的新型CRISPR系統(tǒng)、可實現(xiàn)多重編輯。c.拓寬應用鄰域：動植物學d.升級換代：NgAgo（第四代？？）、SGN第15頁/共19頁利用TALEN技術將TCR基因和CD52敲除后殺傷癌細胞，挽救淋巴癌晚期小女孩的生命（2015）基因編輯的應用與價值16利用基因編輯技術，從多靶點高效剔除了一種人源化小鼠多個器官組織中的艾滋病病毒（2017）。用基因編輯后克隆培育出世界首批對器官移植而言“無毒”的小豬（