基因的重組與轉(zhuǎn)移

基因的重組與轉(zhuǎn)移第1頁/共62頁外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞第六章基因的重組與轉(zhuǎn)移第2頁/共62頁第3頁/共62頁第一節(jié)重組DNA分子的構(gòu)建一、基因重組概念利用限制性內(nèi)切酶和其他一些酶類，切割和修飾載體DNA和目的基因，將兩者連接起來，再轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，以期這種外源性的目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)得到正確表達(dá)。第4頁/共62頁二、基因重組的考慮因素實(shí)驗(yàn)步驟簡單易行，連接效率較高，易于重組子篩選2.能夠回收插入的外源基因3.外源基因必須在表達(dá)載體DNA的控制下，并置于正確的閱讀框架內(nèi)，以便目的基因的正確表達(dá)第5頁/共62頁三、表達(dá)載體DNA理想的酶切位點(diǎn)應(yīng)該符合下面幾個條件1.載體上特定的酶切位點(diǎn)盡可能少最好是單一酶切位點(diǎn)2.酶切位點(diǎn)之前要有一個較強(qiáng)的啟動子高效表達(dá)第6頁/共62頁（一）粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起四、載體DNA與外源基因片段的連接第7頁/共62頁1.兩段DNA的連接依靠粘性末端第8頁/共62頁2.DNA片段與載體的連接依靠粘性末端第9頁/共62頁第10頁/共62頁ligasenick第11頁/共62頁(二)平齊末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接。1.直接連接T4－DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’第12頁/共62頁（1）同聚加尾法2.人工加尾形成“粘性末端”DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。②加尾—堿基互補(bǔ)第13頁/共62頁④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點(diǎn)第14頁/共62頁用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個人工粘性末端。（2）連接子(linker)連接①linker用化學(xué)合成法合成的一段8-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用第15頁/共62頁

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第17頁/共62頁④缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點(diǎn)：第18頁/共62頁（3）DNA接頭(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’BamHIadapter用T4－DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。②adapter的作用第19頁/共62頁Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接頭自我連接第20頁/共62頁第21頁/共62頁接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。④缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我連接第22頁/共62頁5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP處理-OHHO-第23頁/共62頁Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’缺口缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接。第24頁/共62頁(三)PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補(bǔ)；5’端6~10bp是某個內(nèi)切酶的識別序列。（5’端多余的3~5bp屬保護(hù)堿基）避免與所擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。第25頁/共62頁引物1GCAGAATTC互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--3’GCAGAATTC互補(bǔ)序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互補(bǔ)序列PCR產(chǎn)物5’--3’3’復(fù)性延伸模板模板3’3’第26頁/共62頁GCTAGCCGG互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’3-’5’復(fù)性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互補(bǔ)序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGGPCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列-5’3’-引物2第27頁/共62頁帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTCPCR產(chǎn)物5’--3’GCTAGCCGGPCR產(chǎn)物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTCPCR產(chǎn)物5’--3’GCTAGPCR產(chǎn)物-5’3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個粘性末端！第28頁/共62頁2.與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個3’端一般都有一個ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個3’端人為地各加一個T利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時，被迫在平端載體上添加T！第29頁/共62頁AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA第30頁/共62頁(四)DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進(jìn)行非粘性末端連接。第31頁/共62頁EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個堿基的粘性末端。第32頁/共62頁2.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第33頁/共62頁3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！第34頁/共62頁4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’3’載體插入片斷第35頁/共62頁（4）使用同尾酶產(chǎn)生的粘性末端連接方法酶切反應(yīng)后不必將核酸內(nèi)切酶失活再進(jìn)行連接反應(yīng)（3）采用同聚物加尾連接技術(shù)線狀DNA分子的兩個3’-OH末端具有同樣的堿基結(jié)構(gòu)第36頁/共62頁1.載體自身環(huán)化連接（能存活）2.載體之間互相連接（能存活）3.插入片段互相連接（不能存活）4.一個載體與幾個插入片段重組（能存活）(五)載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果5.幾個載體與一個插入片段重組（能存活）第37頁/共62頁17第38頁/共62頁1.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。第二節(jié)重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備什么是感受態(tài)？就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。第39頁/共62頁使用喪失了限制體系的大腸桿菌；具有與重組體互補(bǔ)的遺傳性狀；重組整合缺陷型。2.菌種第40頁/共62頁第41頁/共62頁用低滲CaCl2溶液在低溫時處理快速生長的細(xì)菌，此時細(xì)菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面，促進(jìn)細(xì)胞對DNA的吸收。3.制備原理第42頁/共62頁4.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice30min4℃離心收集菌用冰冷的0.01MCaCl2重懸4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存Onice20min用冰冷的0.01MCaCl2重懸第43頁/共62頁二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。1.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。第44頁/共62頁2.轉(zhuǎn)化率每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.DNA分子的轉(zhuǎn)化過程①吸附:完整的雙鏈DNA吸附在受體菌表面②轉(zhuǎn)入:雙鏈DNA分子解鏈單鏈DNA進(jìn)入受體菌,另一鏈降解③自穩(wěn):單鏈DNA在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈環(huán)狀④表達(dá):外源基因同復(fù)制子同時復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯第45頁/共62頁4.轉(zhuǎn)化方法簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法第46頁/共62頁50ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置30分鐘42oC90秒加入800LLB培養(yǎng)基37℃搖45min10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法第47頁/共62頁LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-4000.5g質(zhì)粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37℃中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法第48頁/共62頁5.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜第49頁/共62頁環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片段進(jìn)入細(xì)菌會被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒6.影響轉(zhuǎn)化率的因素第50頁/共62頁①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。④儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞（competentcells)第51頁/共62頁把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。7.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）體外包裝（invitropackaging）（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過受體菌細(xì)胞表面的DNA接受器位點(diǎn)（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。第52頁/共62頁第53頁/共62頁cI857基因是個溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32℃下培養(yǎng)細(xì)菌時能夠保持溶源性。但當(dāng)溫度升高到44℃—45℃時，就會導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。（3）cI857基因突變的噬菌體但由于該噬菌體的S基因上有一個突變，所以細(xì)菌還不裂解。第54頁/共62頁cI857其它基因溶源