多肽導向技術(shù)及其應用

第五章多肽導向技術(shù)及其應用生物技術(shù)的快速發(fā)展大大促進了新藥發(fā)現(xiàn)與設計的速度，但是體內(nèi)用藥時，如何使藥物特異性地到達病灶部位仍然是限制許多藥物由實驗室走向臨床的一大難題。藥物在其它組織或器官的非特異性分布，不僅增大了體內(nèi)用藥的劑量，使得藥物成本提高；而且有可能損傷正常的組織或器官，引發(fā)毒副作用，這種毒副作用有時甚至是致死的[1]。為了克服這一難題，人們提出了導向性的治療策略，該策略的理論基礎是相對于正常的組織，病灶部位（特別是腫瘤）具有自己獨特的表面分子[2]，這些分子不僅是相對特異的,而且常常是高表達的，所以若給藥物連接上這些分子的配體或抗體，則借助于這些配體或抗體和它們相應的分子的結(jié)合，藥物便可特異性的被帶到病灶部位。該策略被認為是提高藥物特異性的有效方法，目前導向性藥物的開發(fā)在藥物開發(fā)領域發(fā)展處于鄰先地位，僅以美國為例，其導向性藥物的開發(fā)以13.2%的年增長率位居全美藥物市場的首位[3]。一、多肽導向技術(shù)的概念和由來導向性的分子有很多類，如抗體、靶分子的天然配體、肽等，其中以小分子肽作為導向分子的技術(shù)被稱為多肽導向技術(shù)。最初作為導向性分子的為抗體，如抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體，抗HER2抗體等與藥物連接后都大大提高了藥物在病灶組織的富集[4,5]。但是抗體由于分子量大在作為導向性分子時有一些缺點，如易引發(fā)機體的免疫反應，滲透性差等，由此人們更傾向于利用小分子肽作為導向性分子?？梢宰鳛閷蛐苑肿拥碾陌▋纱箢?，一類是天然存在的肽，如生長激素釋放抑制因子（somatostatin）、血管活性腸肽（vasoactiveintestinalpeptide,VIP）等，它們分別在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、消化道癌等的特異性診斷和治療方面發(fā)揮了良好的導向性作用[6-7]。另一類則是非天然存在的肽，與天然肽相比，該類肽的種類更多，鑒定更方便，而且有可能比天然肽與其相應受體的親和力更高，故該類肽成為近年來人們關(guān)注的熱點。噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)則被認為是用于篩選該類肽的快速而有效的方法[8]。本文將著重對以噬菌體呈現(xiàn)肽庫來源的肽為導向分子的導向技術(shù)進行論述。二、肽庫的構(gòu)建噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)起源于Smith在1985年報道的將外源多肽在單鏈噬菌體表面呈現(xiàn)的結(jié)果[9]，其原理是將編碼外源多肽或蛋白的基因片斷插入噬菌體衣殼蛋白的基因中，從而將外源多肽或蛋白呈現(xiàn)于噬菌體表面[10]。由于構(gòu)成外源基因片段的脫氧核苷酸可以隨機的排列組合，所以可以構(gòu)建呈現(xiàn)不同外源多肽或蛋白的噬菌體表面呈現(xiàn)多肽或蛋白庫，進而應用于酶底物的篩選，抗體的篩選，配體的篩選，蛋白間相互作用的研究，疾病的診斷等方面。近幾年來，該技術(shù)迅速發(fā)展，已成為生物學研究和應用領域中有效而重要的工具。（一）用于噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)的載體可用于噬菌體表面呈現(xiàn)的載體很多，如T4噬菌體、λ噬菌體及絲狀噬菌體等。與絲狀噬菌體相比，T4噬菌體和λ噬菌體作為呈現(xiàn)載體有一些優(yōu)點：第一兩者均為烈性噬菌體，它們通過裂解宿主菌的方式得以釋放，這樣一些難以穿過細菌細胞膜的蛋白，如球狀蛋白、疏水性的肽和蛋白等就可以呈現(xiàn)在噬菌體表面；而對于絲狀噬菌體而言，其衣殼蛋白的組裝是在細菌的質(zhì)周腔中完成的，從而限定了其所呈現(xiàn)的肽和蛋白必須是能夠穿越細菌細胞膜到達質(zhì)周腔的。第二，T4噬菌體和λ噬菌體可以用于呈現(xiàn)高拷貝的外源分子，而且對外源分子的大小限制較小。第三，T4噬菌體和λ噬菌體可以比較方便的用于外源蛋白的C-端呈現(xiàn)。目前T4噬菌體和λ噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)發(fā)展很快，但是絲狀噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)依然是構(gòu)建肽庫的首選載體，這是因為首先由于T4噬菌體和λ噬菌體呈現(xiàn)的蛋白是在細菌的細胞內(nèi)完成的，而細胞內(nèi)還原性的環(huán)境無法形成二硫鍵，呈現(xiàn)的外源蛋白全部是缺少二硫鍵的，這樣就提高了蛋白錯誤折疊的可能。而如前所述，絲狀噬菌體呈現(xiàn)外源蛋白的組裝是在質(zhì)周腔中完成的，質(zhì)周腔中氧化性的環(huán)境為二硫鍵的形成提供了條件，從而保證了外源蛋白折疊的準確性。第二，T4噬菌體和λ噬菌體的基因組大，比較復雜，操作比較麻煩，而絲狀噬菌體的基因組較小，操作起來很方便。第三，T4噬菌體和λ噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)必須進行DNA的亞克隆才能在蛋白水平上進行分析。正是由于這些原因，絲狀噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)仍然是目前最常用，發(fā)展最快的呈現(xiàn)系統(tǒng)。（二）絲狀噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)的特點絲狀噬菌體是一類具有絲桿狀形態(tài)的噬菌體，在分類中屬于絲桿噬菌體科(Inoviride),絲狀噬菌體屬(Inovirus)。用于表面呈現(xiàn)的噬菌體為一類特異性感染大腸桿菌的噬菌體，包括M13、fd、f1、If1和Ike等。它們具有相似的結(jié)構(gòu)。以M13噬菌體為例，它的核心為6000bp的環(huán)狀單鏈DNA，含10個基因，分別編碼10種不同的蛋白。其中基因=8\*ROMANVIII編碼主要衣殼蛋白p=8\*ROMANVIII,基因=3\*ROMANIII,=6\*ROMANVI,=7\*ROMANVII,=9\*ROMANIX分別編碼次要衣殼蛋白p=3\*ROMANIII、p=6\*ROMANVI、p=7\*ROMANVII、p=9\*ROMANIX。M13噬菌體以其次要衣殼蛋白p=3\*ROMANIII僅感染具F纖毛的大腸桿菌[11]。絲狀噬菌體自身有許多適于構(gòu)建多肽庫的特點。如它能夠接受在衣殼蛋白中插入外源多肽，并將外源蛋白表達后呈現(xiàn)于病毒顆粒表面，便于被相應的受體或抗體識別。即使外源序列干擾病毒的生活周期，也能通過雙基因或噬菌粒系統(tǒng)將多肽表達于表面，產(chǎn)生攜帶野生型和重組衣殼蛋白的嵌合噬菌體。易于擴增，重組后的噬菌體能夠通過感染大腸桿菌得到擴增。對于篩選到的能夠特異性結(jié)合某一靶分子的多肽噬菌體也能夠再感染大腸桿菌，擴增后測序分析其核苷酸序列。噬菌體在各種洗脫條件（如低pH）下仍然很穩(wěn)定，可以感染形成很高的滴度（一般達到1012），這樣高的滴度足以代表庫中所有的克隆[12]。（三）絲狀噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)的呈現(xiàn)方式常用于絲狀噬菌體表面呈現(xiàn)的是衣殼蛋白p=3\*ROMANIII或p=8\*ROMANVIII。p=3\*ROMANIII是衣殼蛋白中最大的蛋白，位于噬菌體的最尾端，其C末端錨定在內(nèi)膜上，N末端游離在外。它識別并結(jié)合大腸桿菌的F纖毛，其用于呈現(xiàn)時最大的特點是對外源蛋白或多肽的大小無嚴格限制，大至50kD的蛋白已被成功呈現(xiàn)[13-14]。由于p=3\*ROMANIII的拷倍數(shù)只有3-5個，可篩選高親和力的抗原決定簇，故常為呈現(xiàn)的首選蛋白，但在免疫學和生物疫苗的研究中受到限制。用p=8\*ROMANVIII呈現(xiàn)的外源分子在無任何佐劑的情況下就能刺激生物體產(chǎn)生較強的免疫學反應，且其拷貝數(shù)多達2700個左右，因此可用于篩選親和力較低的抗體，但小分子量的p=8\*ROMANVIII不能容納多于6個氨基酸的外源多肽，這一點限制了外源多肽與p=8\*ROMANVIII的融合[15]。高拷貝p=8\*ROMANVIII在疫苗開發(fā)中具有潛在的應用價值。最初人們只是簡單的將外源蛋白的編碼基因插入噬菌體的衣殼蛋白中，這樣所有的p=3\*ROMANIII或p=8\*ROMANVIII均為非野生型的蛋白，這種呈現(xiàn)方式被稱為3型和8型（圖1）。但是由于衣殼蛋白對噬菌體正常生理功能的發(fā)揮很重要，特別是p=3\*ROMANIII蛋白對噬菌體識別并結(jié)合宿主菌密切相關(guān)，如果p=3\*ROMANIII或p=8\*ROMANVIII全部用于呈現(xiàn)外源蛋白，則必然影響噬菌體的生理功能，為了克服這一缺點，人們又設計了33型、88型、3+3型和8+8型這幾種呈現(xiàn)方式（圖1）。33型和88型是指噬菌體的基因組中含有兩種衣殼蛋白的基因，一種編碼野生型的衣殼蛋白，一種則編碼呈現(xiàn)了外源蛋白的衣殼蛋白。如果噬菌體的基因組中僅含編碼野生型的衣殼蛋白的基因，而用噬菌粒攜帶編碼呈現(xiàn)了外源蛋白的衣殼蛋白的基因，則這種呈現(xiàn)方式稱為3+3型或8+8型。33型、88型、3+3型和8+8型的噬菌體的衣殼蛋白中及含有野生型的蛋白殼，又含有呈現(xiàn)了外源蛋白的衣殼蛋白，這樣即呈現(xiàn)了外源蛋白，同時又保持了噬菌體的天然功能[16]。在呈現(xiàn)外源分子時，人們常用N末端呈現(xiàn)法，但這并不意味著C末端呈現(xiàn)不重要。恰恰相反，在有些情況下必須用到C末端呈現(xiàn)，例如研究那些需要游離C末端的蛋白與蛋白間的相互作用。除此之外，C末端呈現(xiàn)對于呈現(xiàn)細胞內(nèi)蛋白也很重要，噬菌體組裝前，p=3\*ROMANIII和p=8\*ROMANVIII以它們的C末端滯留在大腸桿菌的內(nèi)膜上，它們的N末端則在質(zhì)周腔內(nèi)[17]。有些分泌性的蛋白需要在氧化性的環(huán)境中才能很好的折疊，質(zhì)周腔的環(huán)境正好提供這一條件。但對于那些需要在還原性的環(huán)境中才能很好折疊的蛋白，則必須用C末端呈現(xiàn)使外源蛋白位于還原性的胞內(nèi)環(huán)境才能滿足其要求[18]。圖1.M13呈現(xiàn)系統(tǒng)的呈現(xiàn)方式三、導向肽的篩選篩選是指用一些方法從噬菌體文庫中挑選出呈現(xiàn)了人們所需要的肽的噬菌體克隆。一般情況下，第一輪篩選要投入一個庫容較大的庫，通過感染宿主菌，陽性噬菌體得到擴增，然后進入下一輪篩選，從而使陽性噬菌體得到進一步富集。嚴謹性和產(chǎn)率（stingency和yield）是兩個評定篩選效率的主要參數(shù)。一般而言增加前者往往會導致后者的降低[19]。目前常用的篩選方法可分為兩類，一類是體內(nèi)篩選，一類是體內(nèi)篩選。體外篩選當純化的靶蛋白易于獲得或高表達靶蛋白的細胞易于獲得時，人們常常選用體外篩選法來對噬菌體文庫進行篩選。該方法的基本流程為首先將篩選配基固定在固相載體上，然后加入噬菌體文庫。其中呈現(xiàn)了與配基結(jié)合肽的噬菌體被捕獲于固相載體上，而不與配基結(jié)合的噬菌體則被洗去。再用洗脫液洗脫結(jié)合的噬菌體并感染大腸桿菌得以擴增，擴增后的噬菌體進入下一輪循環(huán)。親和配基的固定可采用許多種固相支持物，如表面吸附的聚丙乙烯皿或管，硝酸纖維膜和磁性珠，可滲透的珠狀瓊脂糖凝膠等。洗脫的方法也有多種，常用的有低pH的緩沖液洗脫法和用配基的已知配體與噬菌體競爭的競爭洗脫法。以下列舉了一些體外篩選法獲得的多肽（表一）。表一體外篩選獲得的異性結(jié)合肽靶分子/靶細胞結(jié)合的肽生物學評價參考文獻人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（humantransferrinreceptor,hTfR）HAIYPRH,THRPPMWSPVWP高親和力（親和力達1.5x10-8M）地與高表達hTfR的細胞結(jié)合，并且可以介導大分子的內(nèi)化。[20]αvβ1整合素VSWFSHRYSPYSPFAVS可以與αvβ1整合素結(jié)合[21]黑皮質(zhì)素受體1(melannocortinreceptor1,MCR1)FRW體外實驗中，與MCR1高表達的細胞特異性結(jié)合的能力是表達其它MCR細胞的3000倍，并且可以競爭抑制MCR的天然配體α促黑激素（α-melanocyte-stimulatinghormone,α-MSH）與MCR1的結(jié)合[22]血管內(nèi)皮細胞生長因子受體Ⅰ（vascularendotheliacellgrowthfactorreceptorⅠ,VEGFRⅠ）HTMYYHHYQHHL高親和力的和VEGFRⅠ結(jié)合，可抑制雞胚脲囊膜的血管生成，在腫瘤動物模型中抑制乳腺癌的生長[23]、NGYEIEWYSWVTHGMY肽分別與半乳糖甘酶和過氧化酶連接后，融合蛋白與VEGFRⅠ結(jié)合的親和力分別比單純的半乳糖甘酶和過氧化酶與VEGFRⅠ結(jié)合的親和力提高了200倍和400倍[24]白介素11受體(interleukin11receptor,IL11R)CGRRAGGSC有效的識別IL11R，有望用于前列腺癌的診斷和治療[25]鼻咽癌細胞RLLDTNRPLLPY與包裹了阿霉素的脂質(zhì)體相連后，體外實驗中該脂質(zhì)體特異性殺傷鼻咽癌細胞，體內(nèi)實驗，可是用藥量減低至原來的1/5[26]人臍靜脈細胞SIGYPLP當與腺病毒相連時，其基因轉(zhuǎn)染效率比單一的腺病毒提高了15.5倍[27]神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞VLPH與RG2神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞結(jié)合的活性是星形膠質(zhì)細胞的63倍[28]（二）體內(nèi)篩選在有些情況下，當某些抗原及標志物不易確定或難以獲得純化產(chǎn)物時，體內(nèi)篩選是比較合適的選擇。體內(nèi)篩選的優(yōu)點是其是在體內(nèi)進行的，所以篩選出的肽是與完全保持了活性狀態(tài)的靶分子結(jié)合的，但是篩選出的肽究竟是與何種分子結(jié)合還有待于進一步確定。它的基本過程是：將噬菌體肽庫經(jīng)尾靜脈注射入小鼠，待噬菌體在體內(nèi)循環(huán)適宜時間后，通過心臟對小鼠進行全身灌注以洗去非特異性結(jié)合的噬菌體，然后收集靶器官中的噬菌體，經(jīng)感染大腸桿菌擴增、純化后再注射小鼠，進行下一輪淘篩，一般為3－4輪，直到噬菌體得到富集，挑取單克隆，對噬菌體表面呈現(xiàn)片段進行測序，推導其序列的同源性。利用體內(nèi)篩選法，人們發(fā)現(xiàn)了許多器官和組織特異性結(jié)合的肽（表二）。表二，體內(nèi)篩選發(fā)現(xiàn)的特異性結(jié)合肽靶向組織或器官篩選出的肽生物學評價參考文獻乳房組織CPGPEGAGC在乳房組織的富集是其它組織的100倍，并且可在乳腺癌小鼠中特異性的富集于小鼠的乳腺癌血管上[29]腎ELRGD(R/M)AX(W/L)在腎的富集是對照噬菌體的39倍[30]肺CGFECVRQCPERC在肺的富集是對照噬菌體的35倍[31]皮膚CVALCREACGEGC在皮膚的富集是對照噬菌體的7倍胰腺SWCEPGWCR在胰腺的富集是對照噬菌體的6倍腸YSGKWGW在腸的富集是對照噬菌體的10倍動脈粥樣硬化區(qū)域的內(nèi)皮細胞CAPGPSKSC在動脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)可以特異性的結(jié)合于動脈粥樣硬化區(qū)域的內(nèi)皮細胞上[32]四、導向肽的鑒定和評估篩選出的肽是否可作為導向分子用于導向性藥物的開發(fā)，一般可從以下3個方面進行測定和評估。（一）特異性篩選出的肽應該是可以特異性地識別并結(jié)合靶分子或靶組織，這樣才能保證其作為導向分子時將藥物特異性的帶到病灶部位，從而提高藥物在病灶的富集度，降低用藥量，減輕對正常組織的損害。一般常用的鑒定肽特異性的方法有ELISA、細胞結(jié)合實驗（包括免疫組化、流式細胞術(shù)等）、體內(nèi)分布實驗等。（二）親和性篩選出的肽僅具有特異性是不夠的，它與靶分子或靶組織必須具有相當?shù)挠H和力才能用于藥物的開發(fā)，如果親和力不夠則是沒有實用價值的?？赏ㄟ^競爭實驗、生物傳感器測定其親和力、進行Scatchard分析等方法來評價肽的親和力。（三）生物學反應有些篩選得到的肽不僅可以和靶分子或靶組織結(jié)合，而且可能還能引發(fā)其它的生物學效應，比如阻斷其它分子與靶分子或靶組織的結(jié)合、改變靶分子所介導的信號轉(zhuǎn)導通路等。同時該肽對機體是否有害，是否具有免疫原性，這些都需要通過實驗進行研究?？梢苑謩e在蛋白水平、細胞水平及實驗動物水平三個層次上對肽的生物學特性進行研究。五、導向肽的應用由于導向肽可以特異性的識別靶向分子或靶向組織，所以其無論是在疾病的診斷還是在疾病的治療中都有著很廣闊的應用前景在疾病診斷中的作用腫瘤表面分布的標記性分子可以有效的將腫瘤和其它器官和組織區(qū)分開來，故常常用于腫瘤的診斷。而導向多肽具有和這些標記性分子特異性結(jié)合的性質(zhì)，所以是很好的診斷用分子。如M.J.Campa等以內(nèi)皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）三的變種III為靶分子從噬菌體呈現(xiàn)肽庫中篩選出與之結(jié)合的肽用于腫瘤的診斷，實驗表明陽性肽與在低劑量（30-nmol/L）時仍然可以特異而高親和力的與EGFR變種II結(jié)合，是十分理想的診斷分子[33]。在疾病治療中的應用導向性化療藥物化療藥物如阿霉素、道諾霉素等在腫瘤的治療中一直具有很好的作用，但是由于它們對正常的細胞往往也有很強的殺傷力，故在臨床應用中常常受到限制。如果將這些化學藥物與腫瘤表面特異性分子的結(jié)合肽相連構(gòu)建成導向性的藥物，則可以大大降低已有化療藥物的用藥劑量，減少其毒副作用，并且可以使得一些具有潛在腫瘤治療價值但受其毒副作用限制而未能走向臨床的化療藥物走向應用。如A.Wadih等將腫瘤血管內(nèi)皮細胞特異性結(jié)合肽RGD-4C與阿霉素相連構(gòu)建導向性的藥物RGD-4C-阿霉素，在乳腺癌小鼠動物模型中實驗，結(jié)果顯示與單純的阿霉素相比，RGD-4C-阿霉素的用藥量顯著降低，用藥量在單純阿霉素用量的1/40時便可以使腫瘤細胞發(fā)生壞死，而在這一藥物劑量下，單純阿霉素對腫瘤是沒有作用的[34]。2．導向性蛋白藥物基因工程的發(fā)展使得許多蛋白分子如細胞因子等在腫瘤的治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。干擾素、腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor,TNF）等在相關(guān)腫瘤的治療中都顯示出了良好的應用前景，但是有些生物分子在體內(nèi)可能誘發(fā)嚴重的毒副反應，如何降低它們的毒復作用已成為醫(yī)藥工作者共同關(guān)心的問題。多肽導向技術(shù)是解決這一問題的有效策略之一。C.Flavio等將腫瘤血管內(nèi)皮細胞特異性結(jié)合肽NGR與TNF相連構(gòu)建融合蛋白NGR-TNF，在臨床實驗中NGR-TNF相對于天然TNF，對腫瘤的殺傷力顯著提高，而用藥量僅為天然TNF的1/30[35]，目前NGR-TNF已獲準上市。3．導向性基因治療藥物近年來，基因治療成為繼蛋白類藥物之后又一個治療腫瘤的有效方法?；蛑委煹某晒σ蕾囉诨騻鬟f載體的有效性，該載體必須可以特異地將目的基因轉(zhuǎn)入足量的腫瘤細胞內(nèi)以發(fā)揮治療作用。但是目前基因治療所常用的大部分病毒載體的特異性都不是十分讓人滿意，而導向性的基因傳遞系統(tǒng)則是解決之一問題的可能方法。如A.N.Stuart等以人臍靜脈細胞為靶細胞，從噬菌體呈現(xiàn)肽庫種篩選到與之特異性結(jié)合的肽SIGYPLP，當該肽與基因傳遞載體腺病毒相連后，實驗表明與單一的腺病毒相比，SIGYPLP-腺病毒的基因轉(zhuǎn)染效率提高了15.5倍[36]。六、展望多肽導向技術(shù)是近年來發(fā)展很快的一項技術(shù)，它為解決長久以來藥物發(fā)展中的難題之一：藥物在體內(nèi)分布的特異性不夠以至增加藥物的用量、提高藥物的成本和引發(fā)毒副反應提供了理想的方案。利用該技術(shù)不僅可以提高原有藥物的療效，而且還可以開發(fā)設計出許多新的藥物。人類基因組計劃的完成及蛋白質(zhì)組研究的開展，使得人們利用先進的科技手段如生物芯片、差示PCR、2D電泳等技術(shù)發(fā)現(xiàn)病灶組織的標記分子越來越便捷，其中很多標記分子都是導向性藥物治療很好的靶點；同時通過對噬菌體呈現(xiàn)肽庫的淘洗來發(fā)現(xiàn)與藥物靶點特異性結(jié)合的肽這項技術(shù)也日臻成熟，相信在不久的將來一定會有越來越多的多肽導向性類藥物走向臨床，造福于患者。參考文獻[1]QianZM,LiHY,SunHZ,HoKK.Targeteddrugdeliveryviathetransferringreceptormediatedendocytosispathway.PharmacologicalReview,2002,54(4):561-587[2]ReubiJC.PeptideReceptorsasmoleculartargetsforcancerdiagnosisandtherapy.EndocrineReviews,2003,24(4):389-427[3]OriveG,HernandezRM,GasconAR,AlfonsoDG,PedrazzJL.Drugdeliveryinbiotechnology:presentandfuture.CurrentOpinioninBiotechnology,2003,14:659–664[4]PirkerP,FitzGeraldDJ.Anti-transferrinreceptorantibodylinkedtopseudomonasexotoxinasamodelimmunotoxininhumanovariancarcinomacelllines.CancerRes,1985,45(2):751-757.[5]ParkJ.W.Tumortargetingusinganti-her2immunoliposomes.JControlRelease,2001,74:95-113[6]BenjegardSA,ForsselE.Intraoperativetumourdetectionusing111In-DTPA-D-Phe1-octreotideandascintillationdetector.EurJNuclMed,2001,28:1456-1462[7]RaoPS,ThakurML.99mTclabledVIPanalog:evaluationforimagingcolorectalcancer.NuclMedBiol,2001,28:445-450[8]LeTY,WuHC.Anovelpeptidespecificallybindingtonasopharyngealcarcinomafortargeteddrugdelivery.CancerRes.2004,64:8002-8008.[9]SmithGP.Filamentousfusionphage:novelexpressionvectorsthatdisplayclonedantigensonthevirionsurface.Science,1985,228:1315-1317[10]楊輝.人血管形成素基因克隆、表達、純化及其拮抗劑的初步研究：[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