短棒狀桿菌菌苗制造及檢定規(guī)程

短棒狀桿菌菌苗制造及檢定規(guī)程本品系用具有免疫調(diào)節(jié)及抑HYPERLINK\o"書(shū)籍相關(guān)：瘤"瘤等活性的厭氧棒狀桿菌經(jīng)培養(yǎng)后制成懸液，加甲醛殺菌，以無(wú)菌緩沖生理鹽水稀釋而成。用于惡性腫HYPERLINK\o"書(shū)籍相關(guān)：瘤"瘤及其他疾病的免疫治療。1菌種1.1菌種來(lái)源制造菌苗用的菌種采用厭氧短棒狀桿菌H75010或其他經(jīng)試驗(yàn)證明安全有效的菌株。生產(chǎn)用菌種和檢定用血清，由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。1.2菌種檢定1.2.1培養(yǎng)特性檢定菌種用碎肉半流體、肝硫乙醇酸鈉培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基。本菌應(yīng)為革蘭氏陽(yáng)性短棒狀菌，有異染顆粒。1.2.2生化反應(yīng)應(yīng)發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵棉子糖、HYPERLINK\o"中藥材：麥芽"麥芽糖、蔗糖，液化明膠，靛基質(zhì)、硝酸鹽反應(yīng)陽(yáng)性。1.2.3血清學(xué)試驗(yàn)應(yīng)屬Ⅰ型。Ⅰ型血清由中國(guó)藥品生物制品檢定所供應(yīng)或經(jīng)同意。1.2.4脾激活試驗(yàn)用體重18～20g純種小白鼠（C3H、615或C57BL），試驗(yàn)及對(duì)照各10只，雌雄各半。試驗(yàn)組每只腹腔注射菌液0.5ml（15億菌），對(duì)照組注射同量生理鹽水，14天處死小白鼠，分別稱(chēng)體重、脾重、計(jì)算脾指數(shù)，其指數(shù)應(yīng)不低于2.0。脾指數(shù)=試驗(yàn)組脾重（mg）/總體重（g）÷對(duì)照組總脾重（mg）/總體重（g）1.2.5抑HYPERLINK\o"書(shū)籍相關(guān)：瘤"瘤試驗(yàn)（艾氏腹水HYPERLINK\o"書(shū)籍相關(guān)：癌"癌）用體重18～20g純種小白鼠（C3H、615、C57BL或K-LACA），試驗(yàn)及對(duì)照組各10只。雌雄各半，每只腹腔注射活的HYPERLINK\o"書(shū)籍相關(guān)：瘤"瘤細(xì)胞100萬(wàn)/0.2ml（用傳代5～8天非血性腹水）。試驗(yàn)組于注射HYPERLINK\o"書(shū)籍相關(guān)：瘤"瘤細(xì)胞前1天及攻HYPERLINK\o"書(shū)籍相關(guān)：瘤"瘤后次日起，連續(xù)腹腔注射菌液0.25ml（15億）3～5次，每次間隔1天，對(duì)照組同時(shí)注射同量生理鹽水，由對(duì)照組小白鼠全部因HYPERLINK\o"書(shū)籍相關(guān)：癌"癌性腹水死亡起點(diǎn)計(jì)算試驗(yàn)組小白鼠存活率，觀察期最長(zhǎng)30天，其存活率應(yīng)不低于70%。1.2.6毒性試驗(yàn)小白鼠及分組要求同1.2.4項(xiàng)，稱(chēng)總體重，試驗(yàn)組每只小白鼠腹腔注射0.5ml菌液（15億），對(duì)照組注射同量生理鹽水，觀察1周，到期稱(chēng)總體重，不得較試驗(yàn)前減輕或死亡。1.3菌種保存菌種應(yīng)凍干，置2～8℃保存。2菌苗制造2.1制造用培養(yǎng)基可用蛋白胨、肝或酵母透析液培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基。2.2原液制造2.2.1接種連續(xù)2～4次傳代的種子液接種于大瓶或培養(yǎng)罐，36～37℃厭氧培養(yǎng)4～6天。2.2.2采集到期之培養(yǎng)物采集前逐瓶或逐罐鏡檢，有雜菌污染者廢棄。2.2.3殺菌采集之菌體加入不超過(guò)0.5%(ml/ml)甲醛溶液，殺菌48小時(shí)后進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)，不得有任何菌生長(zhǎng)。2.2.4菌液洗滌無(wú)菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)離心沉淀后，用新鮮無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，其最后一次用無(wú)菌生理鹽水做成懸液，加溫60～65℃1小時(shí)，逐瓶做無(wú)菌試驗(yàn)，合格后合并。2.2.5原液合并無(wú)菌試驗(yàn)合格的菌液合并成批，放2～8℃保存。2.3原液檢定2.3.1鏡檢菌形正常，至少觀察10個(gè)視野，應(yīng)無(wú)雜菌。2.3.2無(wú)菌試驗(yàn)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。2.3.3濃度測(cè)定按中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。2.3.4毒性試驗(yàn)按1.2.6項(xiàng)進(jìn)行。2.3.5脾激活試驗(yàn)除脾指數(shù)應(yīng)不低于1.5個(gè)，余同1.2.4項(xiàng)。2.3.6抑HYPERLINK\o"書(shū)籍相關(guān)：瘤"瘤試驗(yàn)同1.2.5項(xiàng)。樣品應(yīng)先按2.6項(xiàng)加溫處理。2.4菌液稀釋2.4.1稀釋根據(jù)2.3.3項(xiàng)測(cè)定的原液濃度用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液生理鹽水（pH7.2～7.4）稀釋成每ml含菌體60億±的菌苗。2.4.2分批同一天由同一批原液稀釋的菌苗作為1批，如1批有數(shù)瓶，應(yīng)分亞批。2.4.3檢定稀釋的菌苗應(yīng)逐瓶做無(wú)菌試驗(yàn)。2.5分裝經(jīng)2.4.3項(xiàng)檢定合格的菌苗在充分搖勻下分裝。2.6加熱處理分裝安瓿后立即60℃±2℃加熱30分鐘。3成品檢定3.1理化檢定菌苗應(yīng)為乳白色懸液，pH6.6～7.2，無(wú)異味，無(wú)搖不散的菌塊及異物。甲醛含量不得超過(guò)0.006%（ml/ml）。3.2無(wú)菌試驗(yàn)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。3.3脾激活試驗(yàn)按2.3.5項(xiàng)進(jìn)行3.4抑HYPERLINK\o"書(shū)籍相關(guān)：瘤"瘤試驗(yàn)按1.2.5項(xiàng)進(jìn)行（檢定合格的原液在半年內(nèi)分裝者，成品可不再作3.3～3.5項(xiàng)檢定）。3.5