血清γ球蛋白的分離、純化與鑒定

一、目的和要求學習鹽析法分離血清蛋白的原理和技術掌握凝膠過濾層析法脫鹽的基本操作技術掌握用醋酸纖維膜電泳法分離血清蛋白的原理及方法當前1頁，總共23頁。二、原理（一）鹽析1.概念和原理鹽析是指溶液中加入無機鹽類而使某種物質溶解度降低而析出的過程。

蛋白質在純水中溶解度較低，若稍加一些無機鹽則溶解度增加，這種現象稱為“鹽溶”(saltin)。而當鹽濃度繼續(xù)增加到某一濃度時，蛋白質又變得不溶而自動析出，這種現象稱為“鹽析”(saltout)。

當前2頁，總共23頁。“鹽析”破壞了蛋白質作為親水膠體的兩個穩(wěn)定因素但當鹽濃度增加到一定濃度時，一方面大量的水同鹽分子結合，使得蛋白質沒有足夠的水維持溶解狀態(tài)，破壞了維持蛋白質親水膠的水化膜另一方面加入的鹽離子中和了蛋白質分子相互排斥的電荷相互聚集沉淀出來表面電荷水化膜當前3頁，總共23頁。2.常用中性鹽：鹽析可用硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽，其中運用最廣的是硫酸銨。硫酸銨的優(yōu)點

1.在水中化學性質穩(wěn)定，2.溶解度大，3.溶解度的溫度系數變化較小，4.硫酸銨價廉易得，分離效果好，5.性質溫和，高濃度時也不會影響蛋白質的生物學活性。當前4頁，總共23頁。3.鹽濃度計算各種蛋白質“鹽析”出來所需的鹽濃度各異，所需的最小鹽量稱做鹽析濃度。A，GAG↓半飽和(NH4)2SO4飽和(NH4)2SO4A↓血清中清蛋白和球蛋白的分離按體積：

12（50%）；14（25%）當前5頁，總共23頁。(1)飽和硫酸銨溶液法

將飽和硫酸銨溶液的飽和度定為100%或1按體積：

12（50%）；14（25%）(2)固體硫酸銨法可采用直接加入固體硫酸銨的方法。硫酸銨飽和度的計算當前6頁，總共23頁。離心力(F)等于被離心的物體質量與向心加速度的乘積向心加速度=4π2V2r（其中V為每秒的轉數，r為離心半徑，單位cm）F=m

4π2V2r相對向心加速度=4π2V2rg多少個g（二）離心(centrifugation)----分離1.離心力當前7頁，總共23頁。2.離心機分類根據離心機的轉數分類可以分為三類

①<5000rpm普通離心機②5,000-25,000rpm高速離心機③25,000-10,000rpm超速離心機因離心時與空氣摩擦產熱很多，所以高速離心機有制冷裝置超速離心機不但有制冷裝置，而且離心室密封真空當前8頁，總共23頁。3.離心機的使用0.1g50g2000rpmr=12cm配平在對稱位置重量一致Balancedloadingpatternsfora12-positoncentrifugerotor當前9頁，總共23頁。三、操作2ml血清+2mlPBS逐滴加入飽和(NH4)2SO42ml2→6ml33%棄上清，2mlPBS+1ml飽和(NH4)2SO4

1→3ml33%棄上清，1mlPBS+0.5ml飽和(NH4)2SO4

0.5→1.5ml33%棄上清，洗滌0.5mlPBS溶解↓搖勻

↓

混勻靜置30min，離心3000rpm10min↓

↓

混勻靜置30min，離心3000rpm10min↓

混勻靜置30min，離心3000rpm10min當前10頁，總共23頁。層析利用物質在固定相（stationaryphase）與流動相（mobilephase）之間不同的分配比例，達到分離待測物質的技術。

(三)層析(chromatography)---純化凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）離子交換層析法（ionexchangechromatography）親和層析法（affinitychromatography）當前11頁，總共23頁。凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）當前12頁，總共23頁。葡聚糖凝膠（Sephadex）當前13頁，總共23頁。離子交換層析法（ionexchangechromatography）當前14頁，總共23頁。親和層析法（affinitychromatography）當前15頁，總共23頁。脫鹽常用透析法和凝膠過濾層析法前者的優(yōu)點是透析后樣品終體積較小，但所需時間較長，且鹽不易除盡凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時間也明顯縮短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。本實驗中樣品體積較小，凝膠過濾后樣品體積不會太增加，所以選用凝膠過濾法。當前16頁，總共23頁。透析(dialysis)當前17頁，總共23頁。凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）當前18頁，總共23頁。按流出的時間收集不同組分當前19頁，總共23頁。結果12345678910proteinNH4+11121314151617181920proteinNH4+-

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±++

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當前20頁，總共23頁。(四)電泳(electrophoresis)---鑒定帶電粒子在電場中移動的現象稱為電泳血清蛋白包括多種蛋白質，它們的等電點大都在pH7.0以下，清蛋白的等電點為4.6，球蛋白為5-7在PH高于它們等電點的緩沖液均帶負電荷，在電場中向正極移動由于各種蛋白質所帶電荷的數量和分子的大小有差別，在電場中泳動的速度也不同當前21頁，總共23頁。血清中清蛋白電荷數量較多，分子量小，泳動最快。γ球蛋白則相反，泳動最慢，適當的時間電泳后，不同的蛋白泳動到不同的位置。Albuminα1α2βγ+-血清樣品電