第一節(jié)核酸的分離純化

分子生物學研究之所以從20世紀中葉開始得到高速發(fā)展，其中最主要的原因就是現(xiàn)代分子生物學研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進步。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細胞轉(zhuǎn)化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點突變PCR擴增等核心技術(shù)當前1頁，總共44頁?；蚬こ陶Q生的基礎(chǔ)1、理論上的三大成就2、技術(shù)上的二大發(fā)明當前2頁，總共44頁。三大成就

：1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；1928FrederickGriffith&1944Oswald

AveryTransformationofStreptococcuspneumoniae1952年Hershey和Chase證實噬菌體DNA侵染細菌實驗當前3頁，總共44頁。2.50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklin拍出了第一張能反映DNA美麗雙螺旋結(jié)構(gòu)的X射線照片MauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&Wilkins當前4頁，總共44頁。Descriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatson三位科學家因為對這一成果的貢獻，共享1962年的諾貝爾生物學獎當前5頁，總共44頁。ConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway當前6頁，總共44頁。3.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。JacobandMonod當前7頁，總共44頁。但是，如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學家就無法對這類物質(zhì)進行直接的生化分析。

當前8頁，總共44頁。兩大技術(shù)保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶（DNAligase）當前9頁，總共44頁。一把特殊的剪刀

—限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，

獲1978年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎當前10頁，總共44頁。HerbertBoyer,StanleyCohen1972年獲得第一個重組DNA分子(實現(xiàn)不同來源DNA的重組)HerbertBoyer當前11頁，總共44頁。1972-PaulBergProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA當前12頁，總共44頁。1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies當前13頁，總共44頁。2.DNA的核苷酸序列分析技術(shù)DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學和生物化學的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來的一門重要的DNA技術(shù)學，這門技術(shù)，對于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價值。當前14頁，總共44頁。Generalprocessofgeneengineering1.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。4.從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經(jīng)得到擴增的目的基因。當前15頁，總共44頁。5.將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間的關(guān)系。當前16頁，總共44頁。

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線當前17頁，總共44頁。分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克?。┍恚ㄟ_目的基因）當前18頁，總共44頁。第一節(jié)核酸的分離純化當前19頁，總共44頁。主要內(nèi)容

前言一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性（二）防止核酸的生物降解二、分離提取核酸的主要步驟（一）細胞的破碎（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除（三）核酸的沉淀

(四）核酸的濃度測定（五）核酸的保存當前20頁，總共44頁。

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。無論是進行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。前言當前21頁，總共44頁。一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性

1意義遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。

2分離核酸原則：

1）溫度不要過高；

2）控制一定的pH值范圍(pH值5-9);

3）保持一定的離子強度;

4）減少物理因素對核酸降解的機械剪切力.當前22頁，總共44頁。（二）防止核酸的生物降解細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。當前23頁，總共44頁。1DNA酶抑制劑1）金屬離子螯合劑：

DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉；2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。當前24頁，總共44頁。2RNA酶（RNAase)抑制劑

RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。

(1)皂土（bentonite

）作用機制：皂土帶負電荷，能吸附RNase，使其失活。當前25頁，總共44頁。

(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。

作用機制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。

使用注意：

1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。

2）容易降解，保存在4℃或液氮中；

3）提RNA時，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。

4）劇毒。當前26頁，總共44頁。（3)肝素（4）復合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)當前27頁，總共44頁。二分離提取核酸的主要步驟（一）細胞的破碎

1高速組織搗碎機搗碎

2玻璃勻漿器勻漿

3超聲波處理法

4液氮研磨法

5化學處理法(SDS、LDS，吐溫80等）

6生化法（溶菌酶、纖維素酶等）當前28頁，總共44頁。（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。當前29頁，總共44頁。常用方法：

1加入濃鹽溶液（如NaCl）核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；

2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；

當前30頁，總共44頁。

3酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。當前31頁，總共44頁。

1）使用注意酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。

2）安全操作酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應戴手套。使用酚時應注意當前32頁，總共44頁。（三）核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調(diào)整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。當前33頁，總共44頁。1核酸沉淀的鹽類及濃度當前34頁，總共44頁。2有機沉淀劑

（1）乙醇優(yōu)點：

對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實驗。缺點：

需要量大，一般要求低溫操作。當前35頁，總共44頁。（2）異丙醇優(yōu)點：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。當前36頁，總共44頁。（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量的DNA片段。應用6000相對分子質(zhì)量的PEG進行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。當前37頁，總共44頁。（4）精胺

精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DNA。

原理是：精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開，達到純化DNA的目的。當前38頁，總共44頁。3核酸沉淀的溫度和時間一般強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達到實驗要求。當前39頁，總共44頁。(四）核酸的濃度測定

1紫外分光光度法測定DNA和RNA的含量

前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應大于0.25μg/ml。

結(jié)論：在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。當前40頁，總共44頁。DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強吸收，其吸收峰在260nm處。波長為260nm時，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。

對標準樣品來說，濃度為1μg/ml時，DNA鈉鹽的OD260＝0.02

當OD260＝1時，dsDNA濃度約為50μg/ml

ssDNA濃度約為37μg/ml

RNA濃度約為40μg/ml

當前41