第二章第四節(jié)核酸類藥物的生產(chǎn)

§2-4核酸類藥物的生產(chǎn)核酸知識復(fù)習(xí)核酸藥物的分類核酸類藥物的生產(chǎn)方法核酸類藥物的生產(chǎn)實(shí)例核酸類藥物的檢測思考題當(dāng)前1頁，總共27頁。核酸知識復(fù)習(xí)核糖（核糖脫氧核糖）核苷嘌呤（腺嘌呤、鳥嘌呤）堿基核酸核苷酸嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）（DNA、RNA）磷酸DNA和RNA是存在于細(xì)胞中的正常成分。DNA主要存在于細(xì)胞核中，少量（2%）存在于線粒體和葉綠體中；RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，少量（10%）存在于核仁、核漿和染色體中。核酸的含量與細(xì)胞大小無關(guān)，以生長旺盛的組織細(xì)胞中含量較多，如動物胰臟、脾臟、胸腺，植物的莖尖、根尖及各種分生組織等。當(dāng)前2頁，總共27頁。一、核酸藥物的分類（一）、具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)如：DNA、RNA、肌苷、ATP、輔酶A、脫氧核苷酸、肌苷酸等。獲得：微生物發(fā)酵或從生物資源中提取生產(chǎn)。藥理功能：有助于改善機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量代謝平衡，加速受損組織的修復(fù)，促使機(jī)體恢復(fù)正常生理功能。著名企業(yè)：珍奧集團(tuán)、GENTA公司當(dāng)前3頁，總共27頁。珍奧集團(tuán)

珍奧集團(tuán)始創(chuàng)于1996年，是一家以保健品、藥品和生物制品為核心業(yè)務(wù)，集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售于一體的健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)，是國家級高新技術(shù)企業(yè)。珍奧集團(tuán)位于大連市雙D港，總占地面積近60萬平方米，下轄大連珍奧藥業(yè)有限公司、大連珍奧生物技術(shù)股份有限公司、上海珍奧生物科技有限公司、大連雙迪生物科技有限公司、福建珍奧核酸有限、大連珍奧進(jìn)出口有限公司等六家生產(chǎn)型控股子公司，現(xiàn)有藥品、保健品、化妝品、功能性紡織品、核酸原料、健康整水系統(tǒng)等7大系列400多個品種，產(chǎn)品銷往日本、美國、瑞士、英國、意大利、加拿大等近20多個國家和地區(qū)。當(dāng)前4頁，總共27頁。珍奧集團(tuán)

珍奧集團(tuán)是中國最大的核酸產(chǎn)業(yè)化基地，是世界上唯一整合了核苷酸上下游全產(chǎn)品鏈的核酸企業(yè)，核酸原料國內(nèi)市場占有率85%以上；珍奧核酸系列保健品經(jīng)上海復(fù)旦大學(xué)、同濟(jì)大學(xué)等多家國家權(quán)威部門指定的健康相關(guān)產(chǎn)品評價基地人群試食試驗(yàn)證實(shí)，功效確切，安全性高，產(chǎn)品暢銷十幾年不衰；珍奧核糖核酸（RNA）是目前世界上唯一通過GMA-SAFE（美國食品生產(chǎn)協(xié)會-食品優(yōu)秀生產(chǎn)供方審核）認(rèn)證的RNA產(chǎn)品，企業(yè)已受邀參與第一個食品用核糖核酸國際標(biāo)準(zhǔn)制定；珍奧5′核苷酸完全符合FCC（美國食品化學(xué)品法典）最新版標(biāo)準(zhǔn)要求，被多家世界頂級跨國公司用作食品添加劑，該項(xiàng)目被列為國家發(fā)改委振興東北老工業(yè)基地項(xiàng)目。在醫(yī)藥領(lǐng)域，珍奧自主研發(fā)的國家一類新藥——注射用心肌肽是“九五”國家重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目，“十五”國家重點(diǎn)科技專項(xiàng)863計(jì)劃，已通過四期臨床，獲準(zhǔn)新藥證書并全面上市。

當(dāng)前5頁，總共27頁。珍奧集團(tuán)

珍奧集團(tuán)與國內(nèi)外十幾家科研院所及上百位科學(xué)家建立了長期穩(wěn)定的科研合作關(guān)系。包括國際免疫聯(lián)合會前主席青克納格爾博士在內(nèi)的12位諾貝爾獎得主曾走進(jìn)珍奧生命園，并對珍奧科研項(xiàng)目和科研實(shí)驗(yàn)活動進(jìn)行了評價和指導(dǎo)。截至目前，珍奧集團(tuán)擁有專利近百件，被評為“國家知識產(chǎn)權(quán)試點(diǎn)單位”。

珍奧集團(tuán)貫徹“寧失一萬，不失萬一”的質(zhì)量方針，嚴(yán)格執(zhí)行健康食品和藥品生產(chǎn)的國際安全準(zhǔn)則，先后通過了ISO9001國際質(zhì)量管理體系認(rèn)證、HACCP國際食品安全預(yù)防控制體系認(rèn)證、ISO22000國際食品安全管理體系認(rèn)證、ISO14001國際環(huán)境管理體系認(rèn)證、藥品和保健食品GMP等認(rèn)證。此外，珍奧還獲得了美國FDA企業(yè)注冊資格和產(chǎn)品通關(guān)檢驗(yàn)，以及日本厚生省健康產(chǎn)品準(zhǔn)入認(rèn)證。當(dāng)前6頁，總共27頁。一、核酸藥物的分類（二）、天然堿基、核苷、核苷酸的類似物或聚合物如：三氟代胸苷、疊氮胸苷、拉米夫定（嘧啶類）、阿德福韋（嘌呤類）、恩替卡韋（第三代核苷類抗乙肝病毒藥物）等。獲得：由自然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)通過半合成生產(chǎn)。藥理功能：治療病毒病如乙肝、腫瘤、愛滋病的重要藥物，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制劑的臨床藥物。當(dāng)前7頁，總共27頁。二、核酸類藥物的生產(chǎn)方法（一）核酸類藥物的原材料除病毒外，所有的動植物組織中都含有核酸類物質(zhì)，包括大分子DNA和RNA、小分子的核苷酸、核苷、堿基等成分，但不同的組織中含量有所不同。動物胸腺中DNA含量較多，是提取DNA的原料；酵母細(xì)胞中RNA含量最多，是提取生產(chǎn)RNA的主要原料。當(dāng)前8頁，總共27頁。二、核酸類藥物的生產(chǎn)方法（二）DNA和RNA的生產(chǎn)方法1、分離提取核酸的生產(chǎn)一般采用提取法，即從粉碎、破裂的生物組織細(xì)胞中通過一定的方法獲取總DNA或總RNA。如需進(jìn)一步的純化，常用純化方法如柱層析、凝膠電泳和密度梯度超離心。２、人工合成獲取大分子核酸的另一方法是人工合成，即利用化學(xué)的方法按照設(shè)定的核苷酸順序逐一加入形成核酸?，F(xiàn)已有核酸合成儀，但合成長度還有一定限制，并且該儀器價格昂貴。因此這種方法一般用于研究，不適合生產(chǎn)。當(dāng)前9頁，總共27頁。二、核酸類藥物的生產(chǎn)方法（三）核苷酸、核苷及堿基類似物的生產(chǎn)方法酶解法、半合成法、發(fā)酵法1、酶解法生產(chǎn)酵母，從酵母中提取RNA，RNA經(jīng)青霉菌屬或鏈霉菌屬等微生物產(chǎn)生的酶進(jìn)行酶解，制成各種核苷酸。2、半合成法微生物發(fā)酵與化學(xué)合成并用。3、直接發(fā)酵法采用營養(yǎng)缺陷型菌株或營養(yǎng)缺陷型兼結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株來發(fā)酵大量生產(chǎn)目的核苷或核苷酸。當(dāng)前10頁，總共27頁。三、核酸類藥物的生產(chǎn)實(shí)例（一）DNA的生產(chǎn)技術(shù)1.提取原理在細(xì)胞內(nèi)的核酸通常是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物——核糖核蛋白（RNP）和脫氧核糖核蛋白（DNP），這兩種復(fù)合物在不同電解質(zhì)溶液中的溶解度有較大差異。RNA＋pro.→RNP（核糖核蛋白）DNA＋pro.→DNP（脫氧核糖核蛋白）0→0.14MNaCl溶液DNP溶解度逐漸降低，RNP的溶解度很大；0.14M→0.5MNaCl溶液DNP溶解度逐漸增加。在制備DNA時，可利用0.14MNaCl溶液使DNP與RNP分開。由于DNP在濃鹽溶液中的溶解度比稀溶液大得多，所以，首先采用濃鹽溶液（1～2M）盡量抽提DNP，然后再去除雜蛋白。當(dāng)前11頁，總共27頁。三、核酸類藥物的生產(chǎn)實(shí)例2.工藝路線[抽提]豬脾臟[預(yù)處理]

冷凍，絞碎

組織漿液[預(yù)處理]

0.1MNaCl-0.5M檸檬酸混合液，離心沉淀1.71MNaCl

上清液（DNP）沉淀（DNP）溶解液0.14MNaCl沉淀物白色纖維狀DNA10%NaCl上清液（DNA）氯仿-異戊醇95%乙醇真空干燥當(dāng)前12頁，總共27頁。三、核酸類藥物的生產(chǎn)實(shí)例3.工藝過程取鮮豬脾,去脂、血,稱取10g,用預(yù)冷的1×SSC溶液洗2次，剪碎。

按睥：1×SSC=1;5W/V加入50ml預(yù)冷的1×SSC，用高速組織

搗碎機(jī)破碎8次,每次5秒,中間間隔30秒。將勻漿液放在燒杯中，于冰鹽浴中冷卻30分鐘。4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。充掉上清。沉淀物中再加2倍體積的1×SSC攪勻，離心，棄上清，重復(fù)2次。將所得沉淀懸于5倍體積的PH8.0、0.15MNaCL—0.1Na2MEDTA溶液中。邊攪拌邊漫漫滴加5%SDS最終濃度達(dá)1%為止。然后加入固體氯化鈉使其最終濃度達(dá)1mol/L，繼續(xù)攪60分鐘，以確保氯化鈉全溶。所得混合液倒入磨口塞的錐形瓶中，加入同體積氯仿—異戊醇（24：1，體積比），激烈振蕩20分鐘，4000r離心20分鐘，上層水相取出后倒入燒杯，以同積氯仿—異戊醇重復(fù)去蛋白2次。取出水相于燒杯中，逐漸加入2倍體積95%乙醇，玻棒攪動，DNA纖維繞于璃玻棒上后擠干，用70%乙醇洗DNA纖維2次，用95%乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并擠干。當(dāng)前13頁，總共27頁。三、核酸類藥物的生產(chǎn)實(shí)例（二）RNA的生產(chǎn)1、來源：微生物——酵母通常在細(xì)菌中RNA占5～25％，在啤酒酵母中占2.7～15％，在霉菌中占0.7~28%，面包酵母含RNA4.1～7.2％。酵母菌體提取優(yōu)點(diǎn)：（1）收率高；（2）提取容易。當(dāng)前14頁，總共27頁。三、核酸類藥物的生產(chǎn)實(shí)例２、RNA的提取——等電沉淀法酵母菌體提取液抽提清液RNA粗品RNA精品稀NaOH，提取中和，分離洗滌、干燥pH2.53、工藝過程（1）預(yù)處理：壓榨、除水；（2）提?。?.13%NaOH，使細(xì)胞壁變性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來；（3）中和、除菌體；（4）分離：等電點(diǎn)法，調(diào)pH2.5，使RNA沉淀下來；（5）洗滌、干燥當(dāng)前15頁，總共27頁。三、核酸類藥物的生產(chǎn)實(shí)例（三）ATP制備腺嘌呤前體

腺苷AMPATP枯草桿菌160（Smr+Try－+Pur－）微生物或化學(xué)轉(zhuǎn)化微生物枯草桿菌160（Smｒ+tyr－+pur－）菌株，在添加腺嘌呤（由丙二氰化學(xué)合成）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可以大量累積腺苷。也可使用發(fā)酵法直接生產(chǎn)ATP，所用菌種是產(chǎn)氨短桿菌ATCC6872。當(dāng)前16頁，總共27頁。三、核酸類藥物的生產(chǎn)實(shí)例（四）輔酶A的生產(chǎn)1.結(jié)構(gòu)與性質(zhì)是ADP的衍生物或類似物，相對分子質(zhì)量為767.54.高純度為白色無定型粉末，具典型硫醇味，有吸潮性，易溶于丙酮、乙醚和乙醇。兼有核苷酸和硫醇的通性，易被過氧化氫、碘或高錳酸鉀等氧化失活成二硫化物，制劑需加穩(wěn)定劑，最好充氮保存。當(dāng)前17頁，總共27頁。三、核酸類藥物的生產(chǎn)實(shí)例（四）輔酶A的生產(chǎn)TCA，除蛋白新鮮豬肝【絞碎】

肝漿

【水，提取】提取液濾液GAM樹脂GAM-CoACoA濃集液LD-601-CoACoA粉HCl-NaClCoA酸化液HCl，酸化LD-601，再吸附酸化濃縮液濃縮上清液沉淀物丙酮沉淀脫水干燥2.生產(chǎn)工藝當(dāng)前18頁，總共27頁。三、核酸類藥物的生產(chǎn)實(shí)例（四）輔酶A的生產(chǎn)3.生化功能

提供機(jī)體能量輔酶A是體內(nèi)70多種酶反應(yīng)通路的輔助因子,包括糖類的分解,脂肪酸的氧化,氨基酸的分解,丙酮酸的降解,激發(fā)三羧酸循環(huán),提供機(jī)體生命所需90%的能量.提供活性物質(zhì)輔酶A參與機(jī)體大量必需物質(zhì)的合成.在腦部合成神經(jīng)肌肉信使和神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿以及促進(jìn)睡眠的褪黑激素（melatonin）等.神經(jīng)肌肉信使可在神經(jīng)和肌肉之間交換資訊,神經(jīng)遞質(zhì)可在神經(jīng)和大腦之間傳遞情感、外界刺激、記憶、學(xué)習(xí)等方面的資訊.傳遞?；饔幂o酶A是重要的乙?；王；鶄鬟f體.激活免疫作用輔酶A支持機(jī)體免疫系統(tǒng)對有害物質(zhì)的解毒、激活白細(xì)胞、促進(jìn)血紅蛋白的合成、參與抗體的合成.促進(jìn)結(jié)締組織形成和修復(fù)輔酶A能促進(jìn)結(jié)締組織成分硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸的合成,對軟骨的形成、保護(hù)和修復(fù)起重要作用.其他作用輔酶A促進(jìn)輔酶Q10和輔酶I的利用,減輕抗生素及其他藥物引起的毒副作用.當(dāng)前19頁，總共27頁。四、核酸類藥物的檢測1、DNA含量測定DNA是磷酸和戊糖通過磷酸二酯鍵形成的長鏈，所以磷酸或戊糖的量正比例于DNA的量，可通過測定磷酸或戊糖的量來測定DNA的量，前者稱為定磷法，后者稱為定糖法。（1）定磷法磷酸與鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸，再轉(zhuǎn)變?yōu)殂f藍(lán)，吸收峰在660nm。（2）定糖法——二苯胺法酸性條件下，DNA與二苯胺共熱，生成藍(lán)色化合物，吸收峰595nm。當(dāng)前20頁，總共27頁。四、核酸類藥物的檢測2、RNA含量測定（1）定磷法——660nm；（2）定糖法——地衣二酚（苔黑酚）法。鹽酸水解RNA，使核糖游離出來，并生成糠醛，與地衣二酚反應(yīng)呈藍(lán)綠色，在670nm處有最大吸收峰。3、核苷酸、核苷