質(zhì)粒DNA的抽提、純化與檢測

質(zhì)粒DNA的抽提、酶切及電泳鑒定試驗YL-1試驗支配上午：質(zhì)粒DNA的提取與純化中午：質(zhì)粒DNA的酶切下午：電泳鑒定質(zhì)粒(plasmid)：是細菌、酵母菌和放線菌中自然存在的獨立于染色體外、具有復制實力的小分子共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA?，F(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過改造或人工構建的，常含抗生素抗性基因。是重組DNA技術中重要的載體。質(zhì)粒作為載體的質(zhì)粒：

多克隆位點選擇標記容納較大的外源DNA質(zhì)粒的特性：相對獨立性獨立的復制單位賜予宿主細胞一些表型與宿主菌染色體DNA不同質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNA的目的與意義基因載體/基因克隆/基因工程：在基因工程中，常用人工構建的質(zhì)粒作為載體。人工構建的質(zhì)粒可以集多種有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。如何獲得批量的純化質(zhì)粒DNA分子？（一）載體的制備：質(zhì)粒DNA的提取與純化提取方法概述基本步驟培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增收集和裂解細菌分離、純化質(zhì)粒常用方法堿裂解法煮沸裂解

試劑盒法氯化銫密度梯度離心法堿裂解法分別純化質(zhì)粒DNA基本原理：利用質(zhì)粒DNA與染色質(zhì)DNA變性與復性的差異。

當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性；當加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠快速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不復性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。原理示意圖溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖,（pH8.0）10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-HCl溶液Ⅱ：0.2mmol/LNaOH,1%SDS溶液Ⅲ：pH4.8,[K+]=3mol/L,（pH4.8）[Ac-]=5mol/L

重懸細菌；保護和緩沖作用裂解細菌蛋白、DNA變性中和NaOH質(zhì)粒DNA復性染色質(zhì)DNA、蛋白不能復性重要試劑堿裂解法提取質(zhì)粒的流程離心收集菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液1.取1mL菌液于1.5mL離心管中，10000rpm離心1min，棄上清。2.將細菌沉淀懸浮于100μL冰預冷的溶液I中，振蕩混勻。3.加200μL簇新配制的溶液II，蓋緊管蓋，上下溫順顛倒離心管混勻5次（勿猛烈振蕩），冰上放置2min。4.加入150μL預冷的溶液III，將管溫順上下顛倒數(shù)次（6-8次）混勻，見白色絮狀沉淀，冰上放置3min。堿裂解法提取質(zhì)粒操作步驟步驟1中可用移液槍將殘留液體吸取，勿吸到沉淀。步驟2中應充分懸浮，使細胞分散混勻。步驟3、4中切記動作溫順，應緩慢上下顛倒離心管混勻，勿猛烈振蕩，否則質(zhì)粒簡潔斷裂。菌液：EcoliJM109菌株(含pUC19-X基因重組質(zhì)粒)5.12000rpm離心5min，當心吸取上清至干凈的1.5mL離心管中。6.加等體積（約450μL）酚:氯仿，混勻，12000rpm離心5min，取上清移至另一1.5mL離心管中。7.加1mL冰預冷無水乙醇，上下顛倒混勻幾次，室溫放置10min；12000rpm離心5min，棄上清。8.加1mL冰預冷70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm離心5min。9.棄上清，室溫放置5-10min，晾干沉淀。10.加20μL含RNase（無DNase）的TE溶解DNA，37℃水浴消化15-30min以去除RNA。堿裂解法提取質(zhì)粒操作步驟步驟5、6中吸取上清液時應避開將交界面的蛋白、染色體DNA也吸走。不要讓質(zhì)粒完全干燥，否則將難以溶解。下一步試驗用提取質(zhì)粒后分裝每人最終得到20μL質(zhì)粒DNA，其中10μL用于酶切，5μL用于電泳，其余5μL用于下次的轉(zhuǎn)化試驗，切記！??！作好標記，放在講臺上20μL質(zhì)粒5μL質(zhì)粒（凍存）10μL質(zhì)粒（酶切）5μL質(zhì)粒（加入15μLTE）試驗留意事項移液槍的正確運用標記好自己的離心管加不同溶液要換槍頭轉(zhuǎn)移上清時不要吸到沉淀運用酚:氯仿留意平安離心機的運用：嚴格平衡留意（二）質(zhì)粒DNA的酶切及電泳鑒定識別特異的DNA序列，并在識別位點或其四周切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。

常用限制性內(nèi)切核酸酶有高度特異的堿基識別序列和切割點。例如EcoRⅠ的切割位點：５′－G▼AATTC－３′３′－CTTAA▲G－５′HindⅢ的切割位點：５′－A▼AGCTT－３′３′－TTCGA▲A－５′限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）本試驗所提取的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒，含有插入的目的片段。假如用EcoRⅠ和HindⅢ同時切割重組質(zhì)粒（含兩個單一酶切位點），就產(chǎn)生兩條帶相應酶切位點的線性DNA分子。3.4kb2.5kb0.9kbEcoRⅠHindⅢ運用限制性內(nèi)酶切的原則限制酶的熱不穩(wěn)定性，選擇合適的條件；避開反復凍融，保持低溫（冰?。┫逻M行；酶的用量可參照酶單位的定義確定；兩種以上的酶切割DNA時應選擇合適的緩沖液；酶切反應必需運用無菌離心管及吸頭號，避開交叉污染。

質(zhì)粒DNA10μL10×MBuffer2μL

EcoRⅠ1μL

HindⅢ1μLddH2O6μL

20合計

20μL準備室老師已將其配成2×限制性酶反應混合液雙酶切體系的建立重組質(zhì)粒的酶切反應5μL質(zhì)粒（凍存）5μL質(zhì)粒（加入15μLTE）

酶切反應體系

質(zhì)粒DNA10μL2×限制性酶反應混合液10μL20μL質(zhì)粒10μL質(zhì)粒（酶切）共計20μL37℃水浴保溫2-3h2×限制性酶反應液包含：10×酶反應緩沖液、EcoRI、HindIII核酸電泳核酸分子是兩性解離分子，在pH8.0～pH8.5時，磷酸全部解離，使得核酸分子帶負電荷，向電場正極移動。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段在凝膠中泳動速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小或構型來使其分別。質(zhì)粒的三種構型在細胞內(nèi)質(zhì)粒常以共價閉環(huán)的超螺旋形式存在如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就能發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子如果兩條鏈均斷開，即為線狀DNA超螺旋DNA（CCCDNA）開環(huán)DNA（OCDNA）線狀DNA

(LDNA)電泳時，三者泳動速度大小關系（？？？）最快中最慢重組質(zhì)粒雙酶切電泳酶切質(zhì)粒線狀質(zhì)粒DNA標準插入片段線性載體DNA標準（Marker）是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝膠電泳時，加樣用做對比來檢測瓊脂糖凝膠是否有問題以及估算條帶的大小。質(zhì)粒DNA電泳步驟制膠取酶切后的質(zhì)粒DNA溶液20μL、酶切比照的質(zhì)粒DNA溶液20μL，各加5×上樣緩沖液5μL，混勻后，用移液槍漸漸將混合物加至樣品孔中；另加入5μLDNAMarker至另一樣品孔中。電壓120V，電泳約40min-1h。點樣：開環(huán)構型線性構型超螺旋構型（希望得到最多）預期電泳結果點樣孔（如果純化不好，就可能有DNA-蛋白復合物殘留）RNA殘留酶切后提取的質(zhì)粒2.5Kb0.9Kb小結1．質(zhì)粒的提?。簤A裂解法分別純化質(zhì)粒DNA，利用質(zhì)粒DNA與染色質(zhì)DNA變性與復性的差異。2．質(zhì)粒的酶切：限制性核酸內(nèi)切酶可以識別特異的DNA序列，并切割雙鏈DNA。本試驗中EcoRI、HindIII將3.4Kb的質(zhì)粒雙酶切為2.5Kb和0.9Kb的兩個片段。