顯微鏡的使用課件

動(dòng)物染色體制備——小鼠骨髓染色體HAT培養(yǎng)基主要組分H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNA選擇作用淋巴細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻目的要求掌握動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體制備的基本過程及原理。掌握小鼠骨髓細(xì)胞染色體制備步驟及試劑的作用。觀察小鼠染色體的形態(tài)特征及數(shù)目實(shí)驗(yàn)原理染色體只有在分裂期的細(xì)胞，特別是中期細(xì)胞中表現(xiàn)出典型形態(tài)便于觀察和計(jì)數(shù)。用秋水仙素處理骨髓細(xì)胞后，使分裂細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期，再經(jīng)低滲處理、固定、滴片、染色等步驟，得到染色體標(biāo)本。

最常用的是骨髓細(xì)胞、血淋巴細(xì)胞和組織培養(yǎng)的細(xì)胞。方法與步驟注射秋水仙素（Cochicine）

實(shí)驗(yàn)前3～4小時(shí)，向腹腔內(nèi)注射秋水仙素。注射濃度隨動(dòng)物種類不同而異。秋水仙素的主要作用是抑制紡錘體的形成，使有絲分裂停于中期，增加中期分裂相的比例。

處死小鼠

：頸椎脫臼法1、剪取小鼠的后肢，注意不要將股骨兩端關(guān)節(jié)剪斷，否則容易造成骨髓細(xì)胞的流失。

2、將股骨上皮膚、肌肉用剪刀、紗布清除干凈，然后將股骨兩端的關(guān)節(jié)剪去，使股骨兩端相通。取股骨：用小針筒吸取

0.075mol/LKCl低滲液(5ml)，在培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗骨髓腔，使骨髓細(xì)胞全部洗脫出來。收集細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)步驟5ml反復(fù)沖洗加固定液5滴終止低滲前1～2min秋水仙素頸椎脫臼小白鼠處理實(shí)驗(yàn)前3～4h處死、取股骨KCl低滲液收集骨髓細(xì)胞37℃靜置30min低滲混勻、預(yù)固定2000轉(zhuǎn)∕分5min離心、棄上清加固定液5ml、混勻10min固定2000轉(zhuǎn)∕分5min離心、棄上清8-10滴固定液細(xì)胞懸液吹打混勻預(yù)冷的玻片低滲：0.075mol/LKCl固定：甲醇:冰醋酸3:1

滴片：20-30cm的高度(預(yù)冷潔凈的載玻片)染色：Giemsa染液7min

鏡檢：“U”形染色體2n=40

結(jié)果觀察結(jié)果觀察結(jié)果觀察結(jié)果顯示小鼠染色體的特點(diǎn)：呈“U”型，全部為端著絲粒染色體；40條（19對(duì)常+1對(duì)性）小鼠染色體核型圖：注意事項(xiàng)：1.把握好秋水仙素的濃度和處理時(shí)間。2.控制好離心的速度。3.低滲處理是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，其目的是使細(xì)胞體積脹大，染色體松散。低滲處理時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)造成細(xì)胞破裂，染色體丟失。低滲處理時(shí)間不足，細(xì)胞內(nèi)染色體易聚集在一起，觀察時(shí)無法準(zhǔn)確分辨與計(jì)數(shù)。4.固定液要現(xiàn)用現(xiàn)配。5.用吸管吹散細(xì)胞時(shí)用力必須盡量輕柔。6.載玻片要潔凈、預(yù)凍；滴片要有一定高度。人染色體制備鏡下所見染色體非顯帶染色體G-帶染色體染色體G顯帶制作技術(shù)原理：G顯帶技術(shù)是指經(jīng)胰蛋白酶處理后用Giemsa染色的方法。也是目前最基本最常用的染色體分析技術(shù)，它不僅能對(duì)染色體數(shù)目，而且能對(duì)染色體結(jié)構(gòu)畸變進(jìn)行分析。為什么經(jīng)胰蛋白酶處理后染色體上會(huì)出現(xiàn)深淺不同的帶紋呢？這與染色體的化學(xué)成份有關(guān)。染色體經(jīng)蛋白水解酶類物質(zhì)處理后，蛋白質(zhì)部份被水解，使DNA中堿基暴露。由于DNA中堿基組合的比例不同，對(duì)染料結(jié)合程度不同，形成深淺不同的帶紋。染色體核酸（DNA為主）蛋白質(zhì)組蛋白非組蛋白實(shí)驗(yàn)操作1.將染色體標(biāo)本放入60-70度烘箱中烤2-3小時(shí)，然后放入37度恒溫箱中備用。2.把配制成0.042%胰蛋白酶液置室溫預(yù)溫。3.取一張玻片浸入已預(yù)溫的胰酶溶液中，處理大約20-25秒左右。4.緩沖液沖洗。5.1:10Giemsa液染色8分。6.沖洗，晾干，鏡檢。

ISCN2005預(yù)習(xí)：實(shí)驗(yàn)一醋酸纖維素薄膜電泳的原理？P55：1、2思考題3、簡(jiǎn)述對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的各個(gè)操作及染色體觀察的體會(huì)？顯微鏡使用、細(xì)胞的基本形態(tài)與結(jié)構(gòu)《細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》錄像動(dòng)物染色體制備秋水仙素、低滲處理蟾蜍血細(xì)胞的體外融合原理、試劑、細(xì)胞融合的原理、細(xì)胞計(jì)數(shù)格子AKP的Km測(cè)定原理、試劑雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量葡萄糖的酶法測(cè)定原理、試劑酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）—雙抗體夾心法實(shí)驗(yàn)原理醋纖薄膜電泳分離血清蛋白實(shí)驗(yàn)原理對(duì)流免疫電泳鑒定免疫球蛋白實(shí)驗(yàn)原理小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞的分離實(shí)驗(yàn)原理、離心后分層、細(xì)胞計(jì)數(shù)雙向聚酰胺薄膜層析分離DNS-氨基酸凝膠層析技術(shù)分離脲酶和胰島素原理、試劑鼠肝DNA的制備試劑作用PCR技術(shù)檢測(cè)β-actin基因?qū)嶒?yàn)原理、反應(yīng)體系中各成分作用電泳鑒定三個(gè)分光光度法、兩次層析、三次電泳比較內(nèi)容總結(jié)動(dòng)物染色體制備?！∈蠊撬枞旧w。染色體只有在分裂期的細(xì)胞，特別是中期細(xì)胞中表現(xiàn)出典型形態(tài)便于觀察和計(jì)數(shù)。最常用的是骨髓細(xì)胞、血淋巴細(xì)胞和組織培養(yǎng)的細(xì)胞。秋水仙素的主要作用是抑制紡錘體的形成，使有絲分裂停于中期，增加中期分裂相的比例。1、剪取小鼠的后肢，注意不要將股骨兩端關(guān)節(jié)剪斷，否則容易造成骨髓細(xì)胞的流失。2、將股骨上皮膚、肌肉用剪刀、紗布清除干凈，然后將股骨兩端的關(guān)節(jié)剪去，使股骨兩端相通。用小針筒吸取0.075mol/LKCl低滲液(5ml)，在培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗骨髓腔，使骨髓細(xì)胞全部洗脫出來。固定：甲醇:冰醋酸3:1

滴片：20-30cm的高度。小鼠