第7章脂類代謝與控制

概述脂類，也稱脂質(zhì)或類脂，是一類低溶于水而高溶于非極性溶劑的生物有機分子。對大多數(shù)脂類而言，其化學本質(zhì)是脂肪酸和醇所形成的酯類及其衍生物。參與脂類組成的脂肪酸多是4碳以上的長鏈一元羧酸，醇成分包括甘油（丙三醇）、鞘胺醇、高級一元醇和固醇。脂類元素組成主要是碳、氫、氧，有些含有氮、磷及硫等。當前1頁，總共71頁。當前2頁，總共71頁。第一節(jié)脂類的代謝與調(diào)節(jié)一、脂肪酸的分解（β-氧化作用）1904年，F(xiàn)ranzKnoop將末端碳連有苯基的一些奇數(shù)碳和偶數(shù)碳脂肪酸衍生物喂狗，然后分離狗尿中的苯化合物。Knoop發(fā)現(xiàn)，當奇數(shù)碳脂肪酸衍生物被降解時，尿中檢測出的是馬尿酸（苯甲酸和甘氨酸的結(jié)合物）；如果是偶數(shù)碳，則尿中排出的是苯乙尿酸（苯乙酸和甘氨酸的結(jié)合物）。因此Knoop認為，脂肪酸的氧化發(fā)生在β-碳原子上，即每次從脂肪酸鏈上降解下來的是2碳單位，也就是后來所謂的脂肪酸β-氧化。當前3頁，總共71頁。

當前4頁，總共71頁。細胞內(nèi)脂肪酸的降解過程可以分為3個階段：⑴脂肪酸在細胞質(zhì)中活化為脂酰CoA；⑵脂酰CoA通過轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入線粒體基質(zhì)；⑶以2碳單位降解——β-氧化。當前5頁，總共71頁。1、脂肪酸的活化

長鏈脂肪酸氧化前必須進行活化，活化在線粒體外進行（原核生物在細胞溶膠中進行），脂肪酸先與CoA形成硫酯鍵。胞液中的脂肪酸可以在脂酰CoA合成酶的催化下，與乙酰CoA酯化，生成脂酰CoA。細胞中有4種不同的脂酰CoA合成酶，它們分別對帶有短的（<C6）、中等長度的（C6～12）、長的（>C12）和更長的（>C16）碳鏈的脂肪酸具有催化的特異性。當前6頁，總共71頁。

當前7頁，總共71頁。2、脂肪酸轉(zhuǎn)入線粒體

——肉毒堿（carnitine）穿梭機制當前8頁，總共71頁。肉毒堿穿梭機制包括以下步驟：⑴在脂酰肉毒堿轉(zhuǎn)移酶I（carnitineacyltransferaseI，CATI）催化下，脂酰CoA中的脂?；D(zhuǎn)移到L-肉毒堿上，形成脂酰肉毒堿。⑵脂酰肉毒堿在肉毒堿：脂酰肉毒堿轉(zhuǎn)運酶的作用下，與游離的肉毒堿交換后進入線粒體基質(zhì)。⑶在線粒體基質(zhì)中，脂酰肉毒堿在與膜結(jié)合的脂酰肉毒堿轉(zhuǎn)移酶II（CATII是CATI的同功酶）的催化下，重新生成脂酰CoA和肉毒堿（CATI催化反應的逆反應）。當前9頁，總共71頁。

當前10頁，總共71頁。3、脂肪酸的β-氧化

脂肪酸的β-氧化發(fā)生于線粒體中，脂酰CoA氧化生成乙酰CoA涉及4個基本反應：第一次氧化反應（oxidation）；水化反應（hydration）；第二次氧化反應（oxidation）；硫解反應（cleavage）。當前11頁，總共71頁。當前12頁，總共71頁。當前13頁，總共71頁。當前14頁，總共71頁。

當前15頁，總共71頁。當前16頁，總共71頁。4、脂肪酸的其他氧化分解方式奇數(shù)碳鏈脂肪酸的分解氧化產(chǎn)生n-1個乙酰CoA和1個丙酰CoA，丙酰CoA與ATP、CO2反應，生成甲基丙二酸單酰CoA，經(jīng)分子重排成琥珀酰CoA，進入TCA循環(huán)。脂肪酸的ω-氧化脂肪酸ω位的碳原子首先氧化，生成二羧酸，再通過β-氧化作用脫下二碳化合物。當前17頁，總共71頁。

當前18頁，總共71頁。5、能量代謝脂肪酸代謝的能量產(chǎn)生分為三個階段：長鏈脂肪酸經(jīng)β-氧化降解為乙酰基（乙酰CoA）。乙?；?jīng)檸檬酸循環(huán)氧化為CO2。前面兩個階段產(chǎn)生的NADH和FADH2經(jīng)呼吸鏈氧化，合成ATP。當前19頁，總共71頁。當前20頁，總共71頁。二、脂肪酸的生物合成對微生物、動植物細胞合成脂肪酸的研究證明，脂肪酸的合成并不是脂肪酸β-氧化的逆反應，而是通過另外的途徑合成。在脂肪酸β氧化途徑中，中間產(chǎn)物都是輔酶A（CoASH）的衍生物；在脂肪酸的生物合成途徑中，則都是?；d體蛋白（ACP）的衍生物。這是兩者之間的根本性區(qū)別。當前21頁，總共71頁。ACP：不同生物體中的ACP十分相似，E.coli中的ACP是一個由77個aa組成的熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)，在第36位Ser的側(cè)鏈上，連有輔基4‘-磷酸泛酰巰基乙胺。當前22頁，總共71頁。脂肪酸的生物合成是在細胞液中進行，需要CO2和檸檬酸參加；而氧化降解是在線粒體中進行的。真核生物中脂肪酸的生物合成包括三個過程：⑴乙酰CoA的轉(zhuǎn)運（檸檬酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)）。⑵丙二酸單酰CoA的生成。⑶脂肪酸的合成。當前23頁，總共71頁。1、乙酰CoA的轉(zhuǎn)運（檸檬酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)）由糖代謝產(chǎn)生的乙酰CoA可以通過檸檬酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，從線粒體轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中，供給脂肪酸的合成。首先在檸檬酸合成酶催化下，線粒體中的乙酰CoA和草酰乙酸縮合形成檸檬酸。生成的檸檬酸經(jīng)檸檬酸——二羧酸載體轉(zhuǎn)運出線粒體。當前24頁，總共71頁。當前25頁，總共71頁。進入到胞液內(nèi)的檸檬酸經(jīng)檸檬酸裂解酶催化，裂解生成乙酰CoA和草酰乙酸，裂解反應需要CoA-SH和消耗ATP。檸檬酸裂解生成的草酰乙酸在細胞質(zhì)中的蘋果酸脫氫酶催化下還原為蘋果酸，同時NADH氧化為NAD＋。蘋果酸在蘋果酸酶催化下脫羧生成丙酮酸，NADP＋還原為NADPH。當前26頁，總共71頁。2、丙二酸單酰CoA的生成

細胞質(zhì)中的乙酰CoA在乙酰CoA羧化酶催化下羧化，形成丙二酸單酰CoA。乙酰CoA羧化酶的輔基是生物素，其反應機理類似丙酮酸羧化酶。當前27頁，總共71頁。3、脂肪酸的合成脂肪酸的合成是在脂肪酸合成酶復合體的作用下完成的。E.coli的脂肪酸合成酶復合體包含7種酶，而哺乳動物的脂肪酸合成酶只有一條肽鏈，但具有多種催化活性。另外，脂肪酸的合成還需要?；d體蛋白（ACP：acylcarrierprotein）來轉(zhuǎn)移酰基基團。

當前28頁，總共71頁。

包括5個反應步驟：前體負載，前體縮合，還原，脫水和進一步還原。⑴負載乙酰CoA在乙酰CoA-ACP轉(zhuǎn)?；傅拇呋拢瑢⑵湟阴；D(zhuǎn)移到ACP上，形成乙酰-ACP。丙二酸單酰CoA在丙二酸單酰-ACP轉(zhuǎn)?；傅拇呋?，將丙二酸單酰基轉(zhuǎn)移到ACP上，形成丙二酸單酰-ACP。E.Coli中脂肪酸的合成當前29頁，總共71頁。⑵縮合酮?；?ACP合成酶接受乙酰-ACP的乙?；?，釋放HS-ACP。酮?；?ACP合成酶催化乙?；D(zhuǎn)移到丙二酸單酰-ACP上，形成乙酰乙酰-ACP，并釋放一分子CO2。⑶還原在酮酰基－ACP還原酶催化下，乙酰乙酰-ACP中的b-酮基被NADPH＋H＋還原為醇，形成D-b-羥丁酰-ACP。當前30頁，總共71頁。⑷脫水在b-羥酰基-ACP脫水酶的催化下，D-b-羥丁酰-ACP脫水，生成帶有雙鍵的反式丁烯酰-ACP。⑸還原烯?；?ACP還原酶催化反式丁烯酰-ACP還原為丁酰-ACP，NADPH為輔酶。當前31頁，總共71頁。當前32頁，總共71頁。當前33頁，總共71頁。4、脂肪酸β-氧化和合成的主要區(qū)別從上述脂肪酸合成途徑可以看出，脂肪酸合成和降解是通過完全不同的兩條途徑進行的。下表歸納了軟脂酸β-氧化和合成的主要區(qū)別。當前34頁，總共71頁。為增加脂肪酸生物合成，可從以下幾方面考慮：⑴選育乙酰-CoA羧化酶活力強的菌株，設法解除終產(chǎn)物（脂酰CoA及脂肪酸）的反饋抑制。選育抗代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株（抗脂肪酸結(jié)構(gòu)類似物），即抗反饋調(diào)節(jié)突變株。選育營養(yǎng)缺陷型的回復突變株或選育條件突變株，解除微生物細胞正常的自我調(diào)節(jié)，使脂肪酸得以積累。三、脂肪酸生物合成的代謝控制育種當前35頁，總共71頁。⑵選育易生成并大量積累檸檬酸的菌株或有利于檸檬酸合成而不利于檸檬酸降解的突變株。⑶選育喪失或只具有微弱檸檬酸脫氫酶活力的突變株。如異檸檬酸脫氫酶的滲漏突變株等。當前36頁，總共71頁。第二節(jié)多不飽和脂肪酸發(fā)酵

的代謝控制育種多不飽和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacids,PUFAs）是指含2個或2個以上雙鍵且碳原子數(shù)為16～22的直鏈脂肪酸，包括γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等。由于多不飽和脂肪酸可廣泛用于醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料等領域，因此世界各國開展了多飽和脂肪酸的微生物育種、發(fā)酵提取工藝以及發(fā)酵動力學等方面的研究。當前37頁，總共71頁。多不飽和脂肪酸的自然來源主要是動植物，但含量最豐富的是微生物，特別是藻類、真菌、細菌等，且主要以儲存油和膜脂的形式存在，尤其是ω-3多不飽和脂肪酸。藻類、真菌、細菌擁有重新合成多種ω-3多不飽和脂肪酸所需的系列脫飽和酶和連接酶，它們是自然界中這些化合物的初始生產(chǎn)者，而高等植物和動物則很少含有ω-3多不飽和脂肪酸。當前38頁，總共71頁。目前商業(yè)上ω-3多不飽和脂肪酸主要是從深海魚油中提取，工藝復雜、成本高、穩(wěn)定性差，還受氣候條件和資源的限制。微生物具有適應性強、生長繁殖迅速、生長周期短、易培養(yǎng)、不受原料產(chǎn)地限制等特點，所以利用微生物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸是一條重要途徑。目前，日本、英國等國家已先后問世了γ-亞麻酸、雙高γ-亞麻酸、花生四烯酸等發(fā)酵產(chǎn)品，而EPA、DHA等仍處于研究階段。當前39頁，總共71頁。一、γ-亞麻酸發(fā)酵的代謝控制育種1919年德國的藥理學家Hei-duschKa博士從月見草中發(fā)現(xiàn)與亞油酸相似的高級多不飽和脂肪酸，被命名為γ-亞麻酸。γ-亞麻酸是人體內(nèi)所必需的必需脂肪酸。如果人體一旦缺乏了必需脂肪酸，心腦血管、生殖、內(nèi)分泌等系統(tǒng)就會出現(xiàn)異常，發(fā)生紊亂，從而引起高血脂，高血壓，血栓病、動脈粥樣硬化、糖尿病、加速衰老等一系列疾病，γ-亞麻酸特別對腦組織的生長發(fā)育至關重要。當前40頁，總共71頁。當前41頁，總共71頁。當γ-亞麻酸的生物活性含量達到15%以上，就能起到顯著的藥理治療作用。由此可見，γ-亞麻酸是人類的生命之寶。從植物中提取γ-亞麻酸受到諸多因素的限制，植物生長周期長，種子采集較難，油含量不穩(wěn)定，難以滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求。1948年，Bernhard和Alberch首次從布拉克須霉的菌體脂肪中鑒定出含有γ-亞麻酸，揭開了微生物發(fā)酵γ-亞麻酸的序幕，大量的研究隨之展開。當前42頁，總共71頁。γ－亞麻酸（GLA）為全順式6，9，12－十八碳三烯酸，非共軛立體構(gòu)型，分子式為C18H30O2，由于其高度的不飽和性在空氣中不穩(wěn)定，在堿性條件下易發(fā)生雙鍵位置及構(gòu)型的異構(gòu)化反應，形成共軛多烯酸。當前43頁，總共71頁。㈠發(fā)酵法生產(chǎn)γ－亞麻酸的菌種目前發(fā)現(xiàn)能積累γ－亞麻酸的微生物主要是一些真菌和微藻，其中真菌研究較多的有被孢霉屬、毛霉屬、枝酶屬、根霉屬等；藻類的研究主要集中在螺旋藻。藻類的培養(yǎng)受外界條件的影響較大，生產(chǎn)多不飽和脂肪酸有一定難度，真菌在自然界分別廣且易培養(yǎng)，目前利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)γ－亞麻酸已成為國內(nèi)外研究熱點。當前44頁，總共71頁。絲狀真菌利用葡萄糖合成γ-亞麻酸的代謝途徑如下圖所示。從圖中可以看出，γ-亞麻酸的生物合成機制比較復雜，從葡萄糖到γ-亞麻酸需涉及20多步酶促反應。關于其代謝調(diào)節(jié)機制，目前尚不清楚。㈡γ-亞麻酸的代謝途徑分析當前45頁，總共71頁。當前46頁，總共71頁。脂肪酸合成的前體物質(zhì)，一是乙酰CoA，為脂肪酸的合成提供碳骨架；二是NADPH，為脂肪酸的合成提供還原力。NADPH主要由胞質(zhì)轉(zhuǎn)氫酶循環(huán)產(chǎn)生，限速酶為蘋果酸酶。當蘋果酸酶的活性受到抑制或者表達上被削弱時，胞質(zhì)中的NADPH將減少，脂肪酸的合成也將隨之減少。因此，胞內(nèi)NADPH與乙酰CoA的水平對微生物合成GLA至關重要。當前47頁，總共71頁。當前48頁，總共71頁。㈢γ-亞麻酸產(chǎn)生菌的育種思路可歸納如下：當前49頁，總共71頁。根據(jù)上述育種思路，要選育γ-亞麻酸高產(chǎn)菌株，可以從以下幾方面著手：1、出發(fā)菌株的選擇γ-亞麻酸產(chǎn)生菌多采用被孢霉（Mortierella）、毛霉（Mucor）、紅酵母（Rhodotorula）、小克銀漢霉（Cunninghamella）等產(chǎn)油脂較高的真菌作為出發(fā)菌株。當前50頁，總共71頁。誘變育種及其篩選方法目前，用于產(chǎn)GLA微生物誘變的方法主要有物理誘變和化學誘變，物理誘變包括：紫外誘變、激光誘變、低能Ｎ＋離子注入等；常用的化學誘變方法有：硫酸二乙酯、亞硝基胍、氯化鋰和亞硝酸鹽誘變等。然而，產(chǎn)生正突變的概率通常較小，因此需要一種簡單易行的篩選方法不僅可以減輕工作量，還可以提高篩選效率，減小盲目性。當前51頁，總共71頁。蘇丹黑染色法篩選：其原理是菌體用蘇丹黑染色后，油脂被染成藍黑色，原生質(zhì)為淡紅色，在顯微鏡下觀察菌體的顏色，藍黑色深者說明菌體內(nèi)的油脂含量較多。于愛群等利用蘇丹黑染色法篩選獲得１株GLA產(chǎn)生菌EM10，通過搖瓶培養(yǎng)，其生物量達11.882g\L，菌絲體油脂含量達18.86％，進一步鑒定該菌株，表明該菌為毛霉屬。劉陽等通過紫外-硫酸二乙酯復合誘變深黃被孢霉AS3.3410，用蘇丹黑染色初篩，得到突變株H3.3410-5，其GLA含量較原始菌株提高了14.4％。當前52頁，總共71頁。2、切斷或減弱支路代謝通過切斷或減弱非γ-亞麻酸生物合成的支路代謝，使更多的磷酸烯醇式丙酮酸、乙酰CoA、亞油酸生成γ-亞油酸，從而提高γ-亞油酸的產(chǎn)量。據(jù)報道，采用α-亞油酸缺陷型、花生四烯酸缺陷型、二十碳五烯酸缺陷型，均有助于γ-亞油酸產(chǎn)量的提高。另外，選育花生四烯酸滲漏、二十碳五烯酸滲漏突變株，也可使γ-亞麻酸的產(chǎn)量得到提高。當前53頁，總共71頁。3、解除反饋調(diào)節(jié)選育脂肪酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株（如LTBr）、耐高濃度γ-亞麻酸突變株，均能不同程度地解除γ-亞麻酸的反饋調(diào)節(jié)機制，使得代謝更加流暢，從而提高γ-亞麻酸的產(chǎn)量。當前54頁，總共71頁。4、強化能量代謝提高菌體細胞內(nèi)ATP的水平，有利于脂肪酸的合成。因此，選育呼吸抑制劑（丙二酸、氰化鉀、亞砷酸等）抗性突變株、ADP磷酸化抑制劑（羥胺、2,4-二硝基酚等）抗性突變株、抑制能量代謝的抗生素（寡霉素、纈氨霉素等）抗性突變株，均有助于γ-亞麻酸產(chǎn)量的提高。當前55頁，總共71頁。5、增加前體物的合成菌體生物合成γ-亞麻酸與HMP、EMP途徑直接相關。增加HMP途徑，NADPH的數(shù)量增多，有利于γ-亞麻酸產(chǎn)量的提高。選育異檸檬酸脫氫酶滲漏突變株，也有利于γ-亞麻酸產(chǎn)量的提高。當前56頁，總共71頁。6、選育Δ6-脫氫酶活力強的突變株Δ6-脫氫酶是生物合成γ-亞麻酸的關鍵酶之一，其活性的高低直接與γ-亞麻酸含量的高低密切相關，可采用TTC酶活測定法來反映Δ6-脫氫酶的活性。TTC為一種無色的氧化還原劑，能被Δ6-脫氫酶還原成紅色的物質(zhì)，紅色越深，表明菌體細胞內(nèi)的Δ6-脫氫酶活力越強，γ-亞麻酸的積累量也就越多。當前57頁，總共71頁。7、選育低溫生長突變株細胞膜是重要的微生物細胞表面結(jié)構(gòu)，由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成。脂質(zhì)分子中不飽和脂肪酸的含量越高，其在低溫下細胞膜的流動性也就越大，即微生物細胞生長的溫度就越低。據(jù)報道，選育在相對低溫（15℃）條件下生長良好的突變株，其γ-亞麻酸的產(chǎn)量提高1.4倍。當前58頁，總共71頁。8、選育耐高糖的突變株在代謝控制發(fā)酵中，常采用耐高滲透壓突變株。γ-亞麻酸發(fā)酵與培養(yǎng)基中糖濃度有密切關系，在一定范圍內(nèi)，γ-亞麻酸的產(chǎn)量隨糖濃度的增加而增加，但糖濃度過高就會抑制菌體生長，降低產(chǎn)物的積累。因此，通過選育耐高糖的突變株，可使菌體高效率地利用葡萄糖，從而提高γ-亞麻酸的產(chǎn)量。當前59頁，總共71頁。9、基因工程育種通過基因工程手段改造γ-亞麻酸生產(chǎn)菌，能大幅度提高菌種的γ-亞麻酸合成能力。Huang等從高山被孢霉中克隆得到Δ12和Δ6去飽和酶編碼基因的cDNA序列，并將它們分別克隆至啤酒酵母中。當表達Δ12去飽和酶時，以油酸為底物，發(fā)酵終點時其亞油酸的含量達到了25％，當表達Δ6去飽和酶時，以亞麻酸為底物，其發(fā)酵產(chǎn)物GLA含量為10％。當共同表達這兩個酶，在不添加前體脂肪酸的條件下，GLA的含量也能達到8％。當前60頁，總共71頁。二、花生四烯酸發(fā)酵的代謝控制育種花生四烯酸(簡稱AA)屬人體不可缺少的多不飽和脂肪酸，作為合成人體前列腺素、凝血噁烷以及白三烯的前體物質(zhì)，具有廣泛的生物活性，特別對嬰幼兒的腦和神經(jīng)發(fā)育有重要影響，對人體心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。動物組織中花生四烯酸的質(zhì)量分數(shù)很低，約為0.2%，且來源非常有限；利用微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)花生四烯酸的新途徑。當前61頁，總共71頁。利用腐霉(Pythium)通過發(fā)酵法生產(chǎn)的花生四烯酸(美國Martek生物科學公司)在1995年已獲得荷蘭健康部法規(guī)辦公室的安全認可，1996年獲得英國毒理委員會的安全認可，對于食品工業(yè)的研究有重要價值，因此從腐霉屬及近緣屬中尋找有價值的菌株是一個十分有希望的方向。目前對腐霉的育種研究較少，花生四烯酸生產(chǎn)菌的誘變育種局限于被孢霉屬的少數(shù)真菌。當前62頁，總共71頁?；ㄉ南┧嵊址Q全順-5,8,11,14-二十碳四烯酸，其分子式為C20H32O2，結(jié)構(gòu)式為：當前63頁，總共71頁?；ㄉ南┧岬纳锖铣赏緩剑雌咸烟峭ㄟ^脂肪酸的生物合成途徑，先合成硬脂酸，硬脂酸經(jīng)脫氫酶作用生成油酸，油酸進一步脫氫生成亞油酸。由亞油酸分出2個分支，一方面通過去飽和作用生成α-亞麻酸，另一方面在Δ6-脫氫酶的作用下生成γ-亞麻酸。γ-