化學(xué)毒物的一般毒性作用

化學(xué)毒物的一般毒性作用第1頁(yè)/共94頁(yè)2外源化學(xué)物機(jī)體一般毒性特殊毒性生殖毒性

致突變

致癌生殖毒性試驗(yàn)

致突變?cè)囼?yàn)

致癌試驗(yàn)急性毒性

重復(fù)劑量毒性

亞慢性毒性

慢性毒性急性毒性試驗(yàn)

重復(fù)劑量毒性試驗(yàn)

亞慢性毒性試驗(yàn)

慢性毒性試驗(yàn)第2頁(yè)/共94頁(yè)3

一般毒性評(píng)價(jià)(evaluationforgeneraltoxicity)

按接觸化學(xué)毒物時(shí)間長(zhǎng)短所進(jìn)行的哺乳動(dòng)物試驗(yàn)以觀察毒效應(yīng)、評(píng)價(jià)化學(xué)毒物綜合毒性的試驗(yàn)，即為急性毒性試驗(yàn)、重復(fù)劑量毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果對(duì)化學(xué)毒物的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)稱(chēng)為一般毒性評(píng)價(jià)。

第3頁(yè)/共94頁(yè)4

意義：1．是毒理學(xué)工作中非常重要的內(nèi)容；2．是化學(xué)物毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)和危險(xiǎn)度評(píng)定的基礎(chǔ)；3．對(duì)防治化學(xué)毒物中毒、制訂標(biāo)準(zhǔn)以及管理毒理學(xué)等有重要意義。第4頁(yè)/共94頁(yè)5第一節(jié)急性毒性作用及其評(píng)價(jià)

一．基本概念

急性毒性(acutetoxicity)：

是指機(jī)體(人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物)一次或24小時(shí)內(nèi)多次接觸一定劑量化學(xué)物后在短期(最長(zhǎng)到14天)內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)。第5頁(yè)/共94頁(yè)6急性接觸的含義：“一次接觸”是含有時(shí)間因素的?！岸啻巍笔侵府?dāng)化學(xué)物毒性很低，需要給予動(dòng)物較大劑量時(shí)，可在24小時(shí)內(nèi)分多次給予(一般不超過(guò)3次)。第6頁(yè)/共94頁(yè)7中毒效應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間:

急性毒性效應(yīng)一般是指機(jī)體接觸化學(xué)物后，在較短時(shí)間內(nèi)觀察到的毒性癥狀。

“一次或24小時(shí)內(nèi)多次接觸”后所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。觀察時(shí)間一般為7天-14天，如有必要可延長(zhǎng)至14天以上。第7頁(yè)/共94頁(yè)8中毒效應(yīng)的強(qiáng)度

機(jī)體急性一次性大劑量接觸毒物后所表現(xiàn)出的一般行為、外觀、大體形態(tài)的改變十分明顯，中毒癥狀嚴(yán)重，常常發(fā)生死亡。第8頁(yè)/共94頁(yè)9二．急性毒性試驗(yàn)?zāi)康呐c常用參數(shù)

目的：A.求出LD50以及其它的急性毒性參數(shù)，了解急性毒作用強(qiáng)度。B.通過(guò)觀察動(dòng)物中毒表現(xiàn)和死亡的情況，了解急性毒作用性質(zhì)、可能的靶器官和致死原因，提供化學(xué)毒物的急性中毒資料，初步評(píng)價(jià)對(duì)人體產(chǎn)生損害的危險(xiǎn)性。C.探求化學(xué)毒物急性毒性的劑量-反應(yīng)關(guān)系，為進(jìn)一步毒理學(xué)試驗(yàn)的染毒劑量設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)。第9頁(yè)/共94頁(yè)10常用的急性毒性參數(shù)：（一）LD50

(或LC50)

：是急性毒性評(píng)價(jià)中重要的參數(shù)，是比較不同化學(xué)毒物急性毒性的重要基礎(chǔ)。

局限：

LD50(或LC50)的測(cè)定受許多因素的影響；不能反映化學(xué)毒物致死作用的中毒特征；LD50波動(dòng)性很大。第10頁(yè)/共94頁(yè)11（二）其他指標(biāo)

1.急性毒作用帶

（Zac=LD50/Limac）：可反應(yīng)急性閾劑量距離LD50的寬窄，即表示引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡劑量與最低毒作用劑量之間劑量范圍的寬窄。其越大，表示化學(xué)物引起急性死亡的危險(xiǎn)性越小。

2.LD84/LD16(或LC84/LC16)：靈敏性好、重復(fù)性強(qiáng)而且容易求。

3.LD100、LD014.劑量反應(yīng)曲線斜率

(即劑量-死亡曲線的概率單位直線的斜率)。圖第11頁(yè)/共94頁(yè)12死亡率死亡率%（概率單位）

A

B550

劑量（mg/kg）

圖兩種化學(xué)物的毒性比較第12頁(yè)/共94頁(yè)13三．急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(一)經(jīng)典的急性毒性試驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求：代謝和毒效應(yīng)表現(xiàn)；易于獲得、品系純化、價(jià)格較低和易于飼養(yǎng)等；檢疫。

第13頁(yè)/共94頁(yè)141）種屬：一般要求最好能選擇兩個(gè)種屬的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，嚙齒類(lèi)和非嚙齒類(lèi)。實(shí)際應(yīng)用中以嚙齒類(lèi)動(dòng)物為主。急性皮膚毒性實(shí)驗(yàn)：成年大鼠、豚鼠或家兔。急性吸入和經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)：大、小鼠。第14頁(yè)/共94頁(yè)152）年齡和體重：

未曾交配和受孕的剛成年動(dòng)物：大鼠180-220g、小鼠18-22g、家兔2-2.5kg、豚鼠200-250g、Beagle犬4-6kg、雜種犬8-15kg。（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物年齡與體重一般是呈正比關(guān)系的，因此常根據(jù)體重來(lái)推算其年齡）一般來(lái)說(shuō)，同一次試驗(yàn)同一批實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重變異范圍不應(yīng)超過(guò)該批動(dòng)物平均體重的20%。

3）性別：一般要求雌雄各半。第15頁(yè)/共94頁(yè)164）動(dòng)物數(shù)量與隨機(jī)分組：至少3個(gè)劑量組，一般5-7劑量組（根據(jù)不同的LD50計(jì)算方法要求）。小動(dòng)物數(shù)量為每組10只，大動(dòng)物6只。嚴(yán)格遵循隨機(jī)化的原則。5）動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前需飼養(yǎng)觀察3-5d。第16頁(yè)/共94頁(yè)172.受試物及處理

受試物的接受、分樣、保管、稱(chēng)量、配制以及在此過(guò)程中的嚴(yán)格的質(zhì)量保證是急性毒性試驗(yàn)成功與否的重要環(huán)節(jié)。急性毒性試驗(yàn)受試物配制的常用劑型為水溶液、混懸液、油溶液。所用的溶劑和助溶劑應(yīng)該是基本無(wú)毒的，與受試物不起反應(yīng)。第17頁(yè)/共94頁(yè)183.染毒途徑的選擇

應(yīng)考慮人在生產(chǎn)和生活環(huán)境中接觸該化學(xué)毒物的情況，通常根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、化學(xué)毒物的性質(zhì)和用途、人類(lèi)實(shí)際接觸途徑和方式來(lái)選擇染毒途徑。第18頁(yè)/共94頁(yè)19

1）經(jīng)口（胃腸道）染毒（oralexposure）一般來(lái)說(shuō)新的化學(xué)物均先進(jìn)行經(jīng)口染毒途徑的急性毒性試驗(yàn)，求出LD50值。通常以經(jīng)口途徑的LD50值來(lái)比較不同化學(xué)物急性毒性大小。灌胃法、喂飼法、吞咽膠囊灌胃法可以準(zhǔn)確控制染毒劑量，最常用。第19頁(yè)/共94頁(yè)20

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的適宜容積（最大容積）分別為：大鼠灌胃1.0(2.0)ml/100g體重小鼠灌胃0.1～0.2(0.4)ml/10g體重

等容量灌胃法。第20頁(yè)/共94頁(yè)21禁食：

經(jīng)口染毒的試驗(yàn)，要求動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前禁食。禁食期間均正常給予飲水，染毒3～4ｈ后提供飼料。經(jīng)口多次染毒，可不禁食。第21頁(yè)/共94頁(yè)22

2）經(jīng)呼吸道染毒（inhalation）：

研究生產(chǎn)條件下以氣體、蒸氣、粉塵、煙、霧等形式存在的化學(xué)毒物和評(píng)價(jià)環(huán)境空氣污染物以及吸入給藥途徑的藥物。

第22頁(yè)/共94頁(yè)23

靜式吸入：

將一定量的易揮發(fā)的靜態(tài)化學(xué)毒物或一定體積的氣態(tài)化學(xué)毒物加入到具有一定體積的密閉容器內(nèi)，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物吸入染毒。

優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、受試物消耗量少，尤其適合于小鼠接觸易揮發(fā)的液態(tài)或氣態(tài)化學(xué)物的急性毒性試驗(yàn)。

缺點(diǎn)：隨時(shí)間延長(zhǎng)氧含量下降、CO2增加；毒物濃度不易長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有經(jīng)皮吸收的可能。故一般僅用于急性實(shí)驗(yàn)。第23頁(yè)/共94頁(yè)24

動(dòng)式吸入：

即染毒柜裝備有補(bǔ)充新鮮空氣和排出含化學(xué)毒物之空氣的動(dòng)力系統(tǒng)以及隨時(shí)補(bǔ)充化學(xué)毒物的配氣系統(tǒng)。

優(yōu)點(diǎn)：染毒過(guò)程中受試物濃度和氧分壓較穩(wěn)定。缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，耗費(fèi)毒物量較多。第24頁(yè)/共94頁(yè)25

氣管注入法：

經(jīng)喉插入法、氣管穿刺法。

優(yōu)點(diǎn)：染毒劑量較準(zhǔn)確，用毒物量少；形成中毒模型速度快。

缺點(diǎn)：操作易造成損傷，引起動(dòng)物死亡；不能發(fā)揮上呼吸道的防衛(wèi)作用，與自然吸入有差異。第25頁(yè)/共94頁(yè)26

3）經(jīng)皮膚染毒（dermalexposure）：液態(tài)、固態(tài)的化學(xué)毒物。首選大鼠，也可選用家兔和豚鼠。試驗(yàn)開(kāi)始前24h，采用動(dòng)物脊柱兩側(cè)皮膚脫毛（剪毛法、剃毛法、化學(xué)脫毛法）。局部涂敷受試化學(xué)毒物并以塑料薄膜或玻璃紙和兩層紗布覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布或繃帶加以固定。24h后取下固定物和覆蓋物，用溫水或適當(dāng)?shù)娜軇┫慈テつw上殘留的受試樣品。第26頁(yè)/共94頁(yè)27

4）經(jīng)注射途徑染毒（ingestion）：

進(jìn)行化學(xué)毒物的毒作用機(jī)制研究、比較毒性研究、了解化學(xué)毒物代謝與毒物動(dòng)力學(xué)參數(shù)或?qū)本人幬镞M(jìn)行篩選研究。腹腔注射、靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射。第27頁(yè)/共94頁(yè)284.染毒劑量與分組

了解化學(xué)毒物的理化特性，純度，雜質(zhì)成分與含量等。

有相關(guān)毒性資料可供參考者

沒(méi)有毒性資料可供查閱者

限量試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)

找出大致致死范圍

(即死亡率從0-10%至90-100%)設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量和分組

近似化學(xué)物的LD50(LC50)值作預(yù)期毒性中間劑量,上下各設(shè)計(jì)1～2個(gè)劑量組進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)第28頁(yè)/共94頁(yè)29

在實(shí)際工作中，除有特殊規(guī)定外，均不設(shè)立對(duì)照組。

5.試驗(yàn)周期：化學(xué)毒物的LD50（LC50）的測(cè)定一般要求計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸受試物后14天內(nèi)的總死亡數(shù)。第29頁(yè)/共94頁(yè)306.毒效應(yīng)觀察

1)中毒癥狀

觀察動(dòng)物出現(xiàn)的中毒癥狀、發(fā)生的時(shí)間、癥狀發(fā)展的經(jīng)過(guò)、死亡前的特征以及死亡時(shí)間等。圖2)體重

體重可以反映動(dòng)物中毒后的整體變化。對(duì)存活動(dòng)物，應(yīng)在觀察期14天內(nèi)稱(chēng)量其體重的變化，以便了解受試物引起毒效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。第30頁(yè)/共94頁(yè)31表6-1

嚙齒類(lèi)動(dòng)物急性中毒表現(xiàn)

系統(tǒng)和器官

觀察項(xiàng)目

中毒后常見(jiàn)的表現(xiàn)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)與軀體感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)

行為

體位異常，叫聲異常，活動(dòng)異常，不安，多動(dòng)、少動(dòng)或呆臥，側(cè)倒

運(yùn)動(dòng)狀態(tài)

運(yùn)動(dòng)異常、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、步態(tài)蹣跚、痙攣、抽搐、強(qiáng)直、麻痹，后肢無(wú)力，

管狀尾

對(duì)外界刺激反應(yīng)性

易興奮、易激惹，感覺(jué)遲鈍或過(guò)敏，反應(yīng)低下或過(guò)高

腦、脊髓反射

減弱或消失

肌肉張力

松弛或緊張

自主神經(jīng)系統(tǒng)

瞳孔

散大或縮小

腺體分泌

流涎，流淚，出汗

第31頁(yè)/共94頁(yè)323)病理檢查及其它指標(biāo)對(duì)死亡的動(dòng)物：均應(yīng)及時(shí)進(jìn)行大體解剖和病理組織學(xué)檢查。對(duì)存活動(dòng)物：在觀察期結(jié)束時(shí)進(jìn)行大體病理檢查.4)死亡和死亡時(shí)間

分析中毒死亡時(shí)間的分布規(guī)律，也可以提供重要信息。第32頁(yè)/共94頁(yè)33四、急性毒性評(píng)價(jià)

各種急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)是以LD50/LC50值為基礎(chǔ)劃分的，以往沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

如1994年頒布實(shí)施的《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法》中提出急性毒性分級(jí)的六級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(表6-3)。聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦了一個(gè)五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

第33頁(yè)/共94頁(yè)34

表6-3化學(xué)物質(zhì)急性毒性(LD50)劑量分級(jí)

____________________________________________________________________

級(jí)

別

大鼠口服LD50

相當(dāng)于人的致死劑量

(mg/kg)___________________________

mg/kgg/人

_____________________________________________________________________

極

毒<1稍嘗0.05

劇

毒

1～50500～40000.5

中

等

毒51～5004000～300005

低

毒501～500030000～25000050

實(shí)際無(wú)毒

5001500000500

無(wú)

毒

>15000>5000002500

_____________________________________________________________________

引自GB15193.3-94食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法

第34頁(yè)/共94頁(yè)35第35頁(yè)/共94頁(yè)36WHO于2003年公布《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類(lèi)和標(biāo)簽制度》（GHS），2005年修訂，2008年全面實(shí)施。第36頁(yè)/共94頁(yè)37五、急性毒性試驗(yàn)報(bào)告受試樣品名稱(chēng)、理化性狀、配制方法、所用濃度。試驗(yàn)動(dòng)物的種屬、品系和來(lái)源。所用劑量和動(dòng)物分組、每組所用動(dòng)物性別、數(shù)量級(jí)體重范圍。染毒后動(dòng)物中毒表現(xiàn)和死亡情況及出現(xiàn)時(shí)間，大體解剖及病理所見(jiàn)。計(jì)算LD50值的方法及其LD50和95%可信限。結(jié)論。第37頁(yè)/共94頁(yè)38（二）急性毒性替代試驗(yàn)“3R原則”

OCED（經(jīng)濟(jì)合作和發(fā)展組織）推薦：固定劑量法急性毒性分級(jí)法上下移動(dòng)法第38頁(yè)/共94頁(yè)391.急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)固定劑量法（fixeddoseprocedure）不以動(dòng)物死亡作為觀察終點(diǎn)，而是利用預(yù)先選定的或固定的一系列劑量染毒，從而觀察化學(xué)物的毒性反應(yīng)來(lái)對(duì)化學(xué)物的毒性進(jìn)行分級(jí)。觀察終點(diǎn)：

明顯毒性（evidenttoxicity）：給予受試樣品后出現(xiàn)的明確的毒作用表現(xiàn)，可作為危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)的充分依據(jù)，預(yù)期隨著染毒劑量的增加可發(fā)展為嚴(yán)重的中毒癥狀直至死亡。第39頁(yè)/共94頁(yè)40★預(yù)試驗(yàn)：選擇5、50、300和2000mg/kg4個(gè)固定劑量，特殊情況下可增加1個(gè)5000mg/kg劑量。采用單性別（一般為雌性）1只動(dòng)物循序進(jìn)行，根據(jù)受試物的有關(guān)資料，從上述劑量中選擇1個(gè)作為初始劑量；如沒(méi)有相關(guān)資料可參考，可用300mg/kg作為初始劑量進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選擇一個(gè)能產(chǎn)生明顯毒性效應(yīng)但不引起死亡的劑量進(jìn)行正式試驗(yàn)。第40頁(yè)/共94頁(yè)41注：A——死亡；B——明顯毒性；C——無(wú)毒性第41頁(yè)/共94頁(yè)42第42頁(yè)/共94頁(yè)43★正式試驗(yàn)每個(gè)劑量組5只動(dòng)物（包括預(yù)試驗(yàn)在該水平做過(guò)的動(dòng)物）。一般只需一個(gè)劑量。如果正式試驗(yàn)選擇的起始劑量未見(jiàn)明顯毒性，應(yīng)接著進(jìn)行下一個(gè)較高劑量的染毒。如正式試驗(yàn)選擇的起始劑量出現(xiàn)動(dòng)物死亡或嚴(yán)重毒性反應(yīng)時(shí)，應(yīng)從保護(hù)動(dòng)物免受痛苦出發(fā)，選擇下一個(gè)較低劑量進(jìn)行。出現(xiàn)下列情況結(jié)束試驗(yàn)：當(dāng)出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)或已確認(rèn)不多于一只動(dòng)物死亡；最高劑量未出現(xiàn)毒性反應(yīng)；最低劑量動(dòng)物出現(xiàn)死亡。應(yīng)在確認(rèn)前一個(gè)劑量組的動(dòng)物存活后，才可進(jìn)行下一個(gè)劑量試驗(yàn)。一般兩個(gè)劑量組試驗(yàn)之間要間隔3～4d。第43頁(yè)/共94頁(yè)44★限量試驗(yàn)：如果有相關(guān)的資料表明受試物可能無(wú)毒，可進(jìn)行限量試驗(yàn)。染毒劑量為2000mg/kg（5000mg/kg），選擇另外4只動(dòng)物進(jìn)行。預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)都不出現(xiàn)中毒體征，試驗(yàn)終止?！锝Y(jié)果判定：GHS類(lèi)別。第44頁(yè)/共94頁(yè)45注：A——死亡數(shù)大于或等于2只；B——觀察到明顯毒性大于或等于1只，或者1只死亡；C——無(wú)毒性。第45頁(yè)/共94頁(yè)462.急性毒性分級(jí)法

（acutetoxicclassmethod）以死亡為終點(diǎn)的分階段實(shí)驗(yàn)法。每一階段使用單性別3只動(dòng)物（通常為雌性，如雄性更敏感則用雄性）。從5、50、300、2000mg/kg4個(gè)固定劑量中選擇一個(gè)劑量開(kāi)始進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)死亡動(dòng)物數(shù)，決定下一階段：★不需要進(jìn)一步試驗(yàn)即可分級(jí)；★以相同劑量的另一種性別試驗(yàn)；★以較高或較低的劑量水平進(jìn)行（從300mg/kg開(kāi)始）。第46頁(yè)/共94頁(yè)47平均經(jīng)過(guò)2～4階段即可判定急性毒性。急性毒性分級(jí)法根據(jù)在某一染毒劑量下死亡發(fā)生的數(shù)量，通過(guò)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法判定大致的LD50值范圍，然后進(jìn)行評(píng)價(jià)和分級(jí)。第47頁(yè)/共94頁(yè)48階梯法以死亡為終點(diǎn)，也可觀察不同的終點(diǎn)。推薦的劑量序列：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000mg/kg。如無(wú)毒性資料可參考，推薦從175mg/kg開(kāi)始。如有資料參考，從比理論LD50值稍低的劑量開(kāi)始。一只動(dòng)物序貫進(jìn)行，需單性別毒物6～10只。3.上下移動(dòng)法（up/downprocedure）第48頁(yè)/共94頁(yè)49一只動(dòng)物染毒后觀察48h。存活：下一只動(dòng)物提高一檔劑量；死亡：下一只動(dòng)物降低一檔劑量；每一只存活的動(dòng)物都要觀察至14天。后期死亡動(dòng)物在統(tǒng)計(jì)結(jié)果時(shí)也記為死亡。第49頁(yè)/共94頁(yè)50第二節(jié)短期、亞慢性、慢性毒性作用一

、基本概念及試驗(yàn)?zāi)康男罘e作用：指外源化學(xué)物連續(xù)地、反復(fù)地進(jìn)入機(jī)體，而且吸收速度或總量超過(guò)代謝轉(zhuǎn)化排出的速度或總量時(shí)，化學(xué)物質(zhì)就有可能在體內(nèi)逐漸增加并貯留，稱(chēng)為化學(xué)物質(zhì)的蓄積作用。蓄積作用是發(fā)生慢性毒作用的前提。第50頁(yè)/共94頁(yè)51蓄積作用有兩個(gè)含義：1.物質(zhì)蓄積（materialaccumulation）：當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)接觸化學(xué)毒物一定時(shí)間之后，用化學(xué)分析方法能夠測(cè)得機(jī)體內(nèi)（或某些組織器官內(nèi)）存在該化學(xué)毒物的原型或其代謝產(chǎn)物時(shí)。2.損傷蓄積（damageaccumulation）：有的化學(xué)毒物在機(jī)體內(nèi)雖不能被測(cè)出，然而在長(zhǎng)期接觸的情況下機(jī)體可以出現(xiàn)慢性中毒的現(xiàn)象。第51頁(yè)/共94頁(yè)52重復(fù)劑量（短期）毒性：指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人連續(xù)接觸外源化學(xué)物14-30天所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。（28天）亞慢性毒性：指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人連續(xù)較長(zhǎng)期（相當(dāng)于生命周期的1/10）接觸外源化學(xué)物所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。（90天）慢性毒性：指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人連續(xù)長(zhǎng)期(甚至終生)反復(fù)接觸低劑量外源化學(xué)物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。第52頁(yè)/共94頁(yè)53短期、亞慢性、慢性毒性試驗(yàn)?zāi)康模ü餐c(diǎn)）：1.劑量－反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系2.毒性效應(yīng)譜、毒作用特點(diǎn)和毒作用靶器官3.毒性作用的可逆性4.比較不同動(dòng)物物種、不同接觸時(shí)間的毒效應(yīng)的差異，為受試物毒性機(jī)制研究和將研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。第53頁(yè)/共94頁(yè)54試驗(yàn)?zāi)康牟煌c(diǎn)重復(fù)劑量毒性試驗(yàn)?zāi)康模?.初步估計(jì)未觀察到有害作用的劑量（NOAEL）。2.為亞慢性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)和觀察指標(biāo)提供依據(jù)。亞慢性毒性試驗(yàn)?zāi)康模?.確定NOAEL和LOAEL，提出安全限量參考值。2.為慢性試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)和觀察指標(biāo)選擇提供依據(jù)。慢性毒性試驗(yàn)?zāi)康模?.確定NOAEL和LOAEL，為制定人類(lèi)接觸時(shí)的安全限量標(biāo)準(zhǔn)以及危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)提供毒理學(xué)依據(jù)。第54頁(yè)/共94頁(yè)55二、試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.物種和品系：遵循動(dòng)物選擇的大原則一般選擇兩種試驗(yàn)動(dòng)物：嚙齒類(lèi)、非嚙齒類(lèi)亞慢性：首選大鼠，也可用小鼠犬：Beagle犬經(jīng)皮：兔或豚鼠第55頁(yè)/共94頁(yè)562.性別、年齡和動(dòng)物數(shù)（以大鼠為例）

：

性別：雌雄各半年齡：不超過(guò)9周大鼠（短期）；

6～8周齡大鼠（亞慢性）；剛斷乳大鼠（慢性）各試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物數(shù)應(yīng)相同，在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)動(dòng)物體重差異不得超過(guò)同性別平均體重的20%。

數(shù)量：每組不少于10只（短期）每組不少于20只（亞慢性）每組不少于40只（慢性）如設(shè)計(jì)要定期處死動(dòng)物，需增加動(dòng)物數(shù)。第56頁(yè)/共94頁(yè)57

3.飼養(yǎng)條件:

動(dòng)物房溫度應(yīng)為22±3℃。相對(duì)濕度應(yīng)為30-70%，以50-60%為最佳。常規(guī)飼料，飲水不限。單籠或按性別少量動(dòng)物群養(yǎng)。4.動(dòng)物準(zhǔn)備：健康動(dòng)物，未進(jìn)行過(guò)其他試驗(yàn)，染毒前在實(shí)驗(yàn)室至少適應(yīng)5d。標(biāo)記和隨機(jī)分組。第57頁(yè)/共94頁(yè)58（二）染毒條件（以亞慢性毒性試驗(yàn)為例）

染毒途徑應(yīng)盡量采用人群實(shí)際的接觸途徑和方式，并與預(yù)期進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)的接觸途徑相一致。一般以經(jīng)口（喂飼法、灌胃法、膠囊法）、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚染毒三種途徑為多。注射劑型的新藥需進(jìn)行注射染毒長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)（犬）。

第58頁(yè)/共94頁(yè)59小動(dòng)物（大鼠和小鼠）常用灌胃法和喂飼法。犬：膠囊法或灌胃法喂飼法：受試物穩(wěn)定，受試物摻入飼料要有嚴(yán)格規(guī)定。30天試驗(yàn)不得超過(guò)10g/100g飼料

90天試驗(yàn)，不得超過(guò)8g/100g飼料慢性試驗(yàn)不得超過(guò)5g/100g飼料第59頁(yè)/共94頁(yè)60染毒頻率：一般每天一次。每日定時(shí)染毒：一般為上午。經(jīng)呼吸道染毒時(shí)間通常為每日2-6小時(shí)，工業(yè)毒物可以縮短至1小時(shí)或延長(zhǎng)，環(huán)境污染物可延長(zhǎng)至8小時(shí)。經(jīng)皮染毒一般每天6小時(shí)，而且每周應(yīng)對(duì)染毒部位脫毛一次。第60頁(yè)/共94頁(yè)61（三）劑量分組（以亞慢性毒性試驗(yàn)為例）至少設(shè)3個(gè)染毒組和1個(gè)同步的對(duì)照組。必要時(shí)加1個(gè)賦形劑對(duì)照組（以各染毒組中使用賦形劑量最大組的使用量進(jìn)行）。附加對(duì)照：如需要，可設(shè)雌雄各5只的附加組作為附加對(duì)照，以高劑量組的劑量染毒，在停止染毒后暫不處死，用以觀察是否有遲發(fā)毒作用和毒性作用的可逆性，時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)所觀察到的毒性來(lái)確定。第61頁(yè)/共94頁(yè)62

如混入飼料中的受試物使動(dòng)物的進(jìn)食量減少，應(yīng)設(shè)計(jì)飼料配對(duì)對(duì)照組，用于鑒別是毒性導(dǎo)致進(jìn)食量降低？受試物影響飼料的適口性導(dǎo)致？劑量設(shè)計(jì)：根據(jù)重復(fù)劑量毒性試驗(yàn)和進(jìn)行的確定染毒劑量范圍的預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，并結(jié)合受試物或結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物已有的毒理學(xué)和毒代動(dòng)力學(xué)的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行。第62頁(yè)/共94頁(yè)63

最高劑量組的染毒劑量應(yīng)使動(dòng)物在染毒期間產(chǎn)生較明顯的毒性，但不應(yīng)引起動(dòng)物死亡和承受明顯的痛苦，即使有死亡，也應(yīng)小于10%的動(dòng)物數(shù)。通常以該化學(xué)物急性毒性的閾劑量（同一動(dòng)物品系和同樣的染毒途徑）或以該化學(xué)物的1/20-1/5LD50作為最高染毒劑量；最低劑量組的動(dòng)物應(yīng)無(wú)中毒反應(yīng)或僅有極其輕微的反應(yīng)，相當(dāng)于亞慢性的閾劑量或NOAEL水平。在低、高劑量組之間再設(shè)置1個(gè)中間劑量組（約相當(dāng)于LOAEL）。組間隔一般為2-4倍。對(duì)照組除不染毒外，其他處理與染毒組動(dòng)物相同。第63頁(yè)/共94頁(yè)64

對(duì)于人群主動(dòng)攝入的食品和藥品：采用人體可能擬用的最高劑量為劑量設(shè)計(jì)依據(jù)。大鼠：10、30和100倍，非嚙齒類(lèi)：5、15、50倍。預(yù)期受試物無(wú)明顯毒性：亞慢性和慢性試驗(yàn)設(shè)計(jì)至少等于人擬用劑量的最大倍數(shù)，保健食品為100倍，化學(xué)藥品為30倍，中藥為50倍。第64頁(yè)/共94頁(yè)65（四）觀察指標(biāo)

短期、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)檢測(cè)各種毒性終點(diǎn)的流程圖

短期、亞慢性、慢性毒性試驗(yàn)過(guò)程中外觀

生長(zhǎng)和發(fā)育行為功能毒性體征

生物體液最終體重臟器濕重臟/體比活殺解剖器官/組織大體尸解固定/染色顯微鏡檢查血液學(xué)血清-化學(xué)-生化學(xué)尿分析生物學(xué)標(biāo)志

酶

內(nèi)源性成分

膽汁

第65頁(yè)/共94頁(yè)661.一般觀察：

動(dòng)物體重：每周稱(chēng)量所有動(dòng)物體重一次。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重增長(zhǎng)的抑制或體重減輕受到多種毒效應(yīng)的影響，包括食欲、消化功能、代謝和能量消耗變化等。如果各劑量組體重增長(zhǎng)變化呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，可以肯定這是一種綜合毒性效應(yīng)。食物利用率：即動(dòng)物每食入100g飼料所增長(zhǎng)的體重克數(shù)（g體重/100g飼料），可鑒別動(dòng)物體重降低是由于進(jìn)食減少，還是受試物毒作用。每周觀察并記錄飼料消耗量。第66頁(yè)/共94頁(yè)67中毒癥狀：試驗(yàn)期間至少每天相同時(shí)間對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次臨床觀察，最好在染毒后預(yù)期中毒癥狀出現(xiàn)的高峰期。每天至少兩次檢查動(dòng)物有無(wú)瀕死征象或死亡。詳細(xì)記錄各癥狀出現(xiàn)的時(shí)間和先后次序，包括食欲、活動(dòng)、被毛、分泌物、呼吸等，尤其要留意動(dòng)物被毛的光潔度和色澤、眼分泌物、呼吸、神態(tài)、行為等。第67頁(yè)/共94頁(yè)68

血液學(xué)指標(biāo)：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)、血小板計(jì)數(shù)、凝血時(shí)間等。血液生化學(xué)指標(biāo)：轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、尿素氮、總蛋白、清蛋白、血糖、總膽紅素、肌酐、總膽固醇等。2.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目：第68頁(yè)/共94頁(yè)69

大體解剖檢查：所有動(dòng)物。包括體表、體腔的各開(kāi)口處、顱腔、胸腔、腹腔及其內(nèi)容物的檢查。取出心、肝、脾、腎、肺、腎上腺、甲狀腺、睪丸、附睪、卵巢、胸腺、腦等，肉眼檢查，盡快稱(chēng)重，保存在固定液中。臟器系數(shù)：指某個(gè)臟器的濕重和單位體重的比值，通常是每100g體重中某臟器所占的質(zhì)量。表示為臟器質(zhì)量（g）/體重（100g），又稱(chēng)臟/體比值。組織病理學(xué)：對(duì)照組和高劑量組所有動(dòng)物及肉眼見(jiàn)到損害的器官和組織都應(yīng)進(jìn)行詳盡的組織病理學(xué)檢查。如高劑量組出現(xiàn)異常，中低劑量組也應(yīng)檢查。3.病理學(xué)檢查：第69頁(yè)/共94頁(yè)70

最后染毒后24小時(shí)，每組活殺動(dòng)物(如2/3)，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，剩下停止染毒，繼續(xù)觀察2～4周。如病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)有異常變化，應(yīng)將剩下動(dòng)物活殺剖檢，重點(diǎn)觀察毒性反應(yīng)器官。4.可逆性觀察：第70頁(yè)/共94頁(yè)71

指毒物對(duì)機(jī)體毒作用本質(zhì)的特征性指標(biāo)，與其毒作用機(jī)制有關(guān)，有時(shí)可作為效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志。根據(jù)受試物毒性資料，適當(dāng)增加檢測(cè)指標(biāo)心血管系統(tǒng)有毒性：心電圖、血壓、眼底檢測(cè)；電解質(zhì)、微量元素代謝：血鈣、血磷等含量。5.特異性指標(biāo)：第71頁(yè)/共94頁(yè)72

重視試驗(yàn)項(xiàng)目管理合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)：明確的劑量－反應(yīng)關(guān)系，獲到理想的LOAEL和NOAEL。合乎要求的試驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境檢測(cè)條件控制（五）長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的注意事項(xiàng)第72頁(yè)/共94頁(yè)73三、結(jié)果評(píng)價(jià)亞慢性毒性評(píng)價(jià):

明確化學(xué)物質(zhì)的毒效應(yīng)。確定毒效應(yīng)的敏感指標(biāo)，并依據(jù)指標(biāo)出現(xiàn)變化的情況來(lái)確定閾劑量和/或最大無(wú)作用劑量。根據(jù)閾劑量和/或最大無(wú)作用劑量，進(jìn)行評(píng)價(jià)。第73頁(yè)/共94頁(yè)74

觀察指標(biāo)是否有差異？這種差異是否與受試物有關(guān)？是否有生物學(xué)意義和毒理學(xué)意義？第74頁(yè)/共94頁(yè)751.劑量相關(guān)趨勢(shì)

劑量-反應(yīng)關(guān)系是反映效應(yīng)與處理因素關(guān)系的重要的指標(biāo)。有劑量-反應(yīng)關(guān)系說(shuō)明受試物和效應(yīng)相關(guān)；沒(méi)有劑量-反應(yīng)關(guān)系，可初步判斷與受試物無(wú)關(guān)。理想試驗(yàn)結(jié)果是最高劑量組中毒效應(yīng)明顯，中劑量組有輕度表現(xiàn)，而低劑量組無(wú)任何異常毒效應(yīng)。如差異有顯著性而無(wú)生物學(xué)意義的參數(shù)過(guò)多，試驗(yàn)可能存在質(zhì)量問(wèn)題。第75頁(yè)/共94頁(yè)76

試驗(yàn)結(jié)果可以重復(fù)，才可確定與受試物有關(guān)。重復(fù)的形式：另一個(gè)物種中發(fā)生相同的差異；同一物種不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)生相同的差異。2.反應(yīng)重現(xiàn)性第76頁(yè)/共94頁(yè)773.相關(guān)指標(biāo)變化處理因素某項(xiàng)指標(biāo)相應(yīng)指標(biāo)GOT升高肝壞死GST活性升高4.差異大小和性別差異差異越大，與受試物相關(guān)的可能性越大。注意：需要知道數(shù)據(jù)的正常范圍。差異大多發(fā)生在兩種性別，也可能只發(fā)生在高敏感性別第77頁(yè)/共94頁(yè)785.歷史性對(duì)照的作用歷史參考范圍可以識(shí)別異常的陰性對(duì)照；可以更好地理解低發(fā)生率的發(fā)現(xiàn)；可以更好的判斷差異的生物學(xué)意義。第78頁(yè)/共94頁(yè)79差異是否代表有害效應(yīng)？下列的情形，可以排除有害效應(yīng)：受試對(duì)象功能沒(méi)有改變，該效應(yīng)為短暫的、適應(yīng)性的改變；沒(méi)有相關(guān)的指標(biāo)或參數(shù)變化；出現(xiàn)的效應(yīng)不是該受試物已知效應(yīng)的前期表現(xiàn)等。第79頁(yè)/共94頁(yè)80全部觀察和檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行全面的綜合分析結(jié)合化學(xué)物的理化性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)應(yīng)用生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的基本理論進(jìn)行科學(xué)的評(píng)價(jià)第80頁(yè)/共94頁(yè)81第三節(jié)局部毒性作用及其評(píng)價(jià)

局部毒性是指發(fā)生化學(xué)毒物與機(jī)體直接接觸部位處的損傷作用。用于評(píng)價(jià)機(jī)體接觸化學(xué)毒物的局部（如皮