分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件：實(shí)驗(yàn)五 電泳技術(shù)

實(shí)驗(yàn)五電泳技術(shù)一、定義帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象，稱為電泳。帶正電荷的粒子向負(fù)極移動，帶負(fù)電荷的粒子向正極移動。是生化與分子生物學(xué)的重要研究方法之一，可用于樣品分離、物質(zhì)純度分析和分子量的測定等。第一節(jié)電泳的基本原理+-1.許多生物分子帶有電荷，在電場中可以發(fā)生移動。2.每種分子遷移率不同，一定時(shí)間內(nèi)在電場中的遷移距離不同。二、電泳遷移率設(shè)一帶電粒子在電場中所受的力為F，則

F=QE（Q為粒子所帶電荷，E為電場強(qiáng)度）根據(jù)Stoke定律，一球形分子在溶液中運(yùn)動所受的阻力F’為：F’=6πrηv（v為分子移動速度；r為分子半徑；η為介質(zhì)

黏度）當(dāng)分子達(dá)到動態(tài)平衡時(shí)，F(xiàn)=F’

即QE=6πrηv

移項(xiàng)得v/E=Q/6πrηv/E:表示單位電場強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動速度，稱為遷移率，也稱電泳速度，以表示。

因此上式也可表示為：=Q

/6πrη從上式可推知，帶電粒子在電場中的移動與:

粒子大小有關(guān)，顆粒愈小愈快粒子的電荷有關(guān)，電荷愈多愈快粒子的形狀有關(guān)，愈接近球形愈快三、影響遷移率的因素1.電場強(qiáng)度（E）

電場強(qiáng)度是指每厘米的電位降。電泳速度與電場強(qiáng)度成正比。電場強(qiáng)度越高電泳速度越快。

根據(jù)電場強(qiáng)度大小，電泳可分為：常壓電泳：2～10V/cm

高壓電泳：20～200V/cm2.溶液的pH值

pH值決定帶電顆粒的解離程度，決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少。選擇合適pH，使混合物中各成分所帶電量差別較大。3.溶液的離子強(qiáng)度

緩沖液的離子強(qiáng)度越高，電泳速度越慢一般在0.02-0.2mol/L。4.電滲現(xiàn)象

在電場中液體對固體支持物的相對移動。電泳介質(zhì)多孔，且?guī)в锌山怆x的化學(xué)基團(tuán)，吸附正離子或負(fù)離子，使溶液相對帶電。應(yīng)盡量避免選用有電滲作用的支持物。四、電泳的分類按電泳的原理來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。根據(jù)支持介質(zhì)物理形狀不同（1）濾紙及其它纖維素薄膜電泳（2）凝膠電泳

（3）粉末電泳（4）線絲電泳

根據(jù)支持介質(zhì)的裝置形式（1）平板式電泳

（2）垂直板式電泳

（3）連續(xù)式電泳（4）圓盤電泳

根據(jù)pH連續(xù)性與否（1）連續(xù)pH電泳（2）非連續(xù)pH電泳

瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)五、瓊脂糖凝膠電泳特點(diǎn)1.具有大量微孔

孔徑大小取決于濃度：0.075%濃度孔徑800nm0.16%濃度孔徑500nm1%濃度孔徑150nm2.具有較高的機(jī)械強(qiáng)度可以在1%或更低濃度下使用3.無毒，不需要催化劑4.具有熱可逆性，低熔點(diǎn)瓊脂糖回收樣品容易電極緩沖液TAE:

40mM/LTris-醋酸1mM/LEDTA5×:24.2克Tris5.7ml冰醋酸

10ml0.5M/LEDTATBE:

45mM/LTris-硼酸1mM/LEDTA5×:54克Tris27.5克硼酸

10ml0.5M/LEDTA瓊脂糖凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)：

1.雙重效應(yīng)：電泳效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。

2.操作簡單，電泳速度快，樣品無需預(yù)處理。

3.電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。

4.凝膠透明且無紫外吸收，可在紫外燈下觀看結(jié)果。

5.易染色，易洗脫，便于定量。

瓊脂糖凝膠電泳一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠分離范圍瓊脂糖濃度%線狀DNA分子分離范圍Kb

0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2六、等點(diǎn)聚焦1.用兩性電解質(zhì)建立電場中連續(xù)線性pH梯度2.只適用于兩性解離的物質(zhì)電泳pH1018642七、雙向電泳

(2-DE)蛋白印跡(westernblotting)檢測血清中的免疫球蛋白一、概念

通過PAGE/SDS分離樣品中不同的蛋白質(zhì)組分，利用電轉(zhuǎn)移法將電泳分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持物，然后用免疫學(xué)原理來檢測目的蛋白質(zhì)。常用于檢測樣品中特異蛋白的存在、以及半定量分析。制備蛋白樣品SDS轉(zhuǎn)膜免疫學(xué)檢測二、工作流程

封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色/發(fā)光1.蛋白樣品的獲得來源：組織、細(xì)胞、體液方法：可用各種蛋白裂解液聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE）。PAGE靈敏度高（ug），分辨率高（幾個(gè)bp）。

PAGE電泳體系中加入SDS--→SDSPAGE應(yīng)用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離、定性、定量及少量制備，還可測定分子量、等電點(diǎn)等。2.SDS2.1聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點(diǎn)(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用；(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g;(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑;(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍適用的凝膠濃度(%)蛋白質(zhì)1041～4×1044×104～1×1051～5×1055×10520～3015～2010～155～102～5核酸104104～105105～2×10615～205～102～2.62.2聚丙烯酰胺凝膠的制備

Acr和Bis單獨(dú)存在或混合在一起時(shí)是穩(wěn)定的，但在自由基存在時(shí)就會發(fā)生聚合反應(yīng)形成凝膠。引發(fā)產(chǎn)生自由基的方法有化學(xué)和光聚合兩種方法。

1）化學(xué)聚合常用的催化劑系統(tǒng)有：

（1）過硫酸胺（AP）——TEMED(四甲基乙二胺)；（2）過硫酸胺——DMPN(二甲基氨基丙腈)；（3）過硫酸胺——三乙醇胺。

2）光聚合由光敏物質(zhì)核黃素代替過硫酸銨作催化劑。影響聚合反應(yīng)的因素：（1）大氣氧能淬滅自由基，抑制聚合。在進(jìn)行化學(xué)聚合前，一般在膠液表面，覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。（2）低溫、低pH都會減慢聚合反應(yīng)速度。（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機(jī)玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)。（4）過硫酸銨易潮解失效。2.3SDS分離蛋白的原理電泳體系由濃縮膠、分離膠及電極緩沖液組成。

①濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為

pH6.8的Tris-HCl。

②分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為

pH8.8Tris-HCl。③電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。

2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性→→樣品濃縮的主要因素。

SDS分離蛋白的特點(diǎn)(1)樣品濃縮效應(yīng)

(a)凝膠孔徑不連續(xù)性；

(b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；(2)分子篩效應(yīng)(3)電荷效應(yīng)8.38.38.86.82.4十二烷基磺酸鈉（SDS）的作用SDS：陰離子表面活性劑，能夠使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)上（結(jié)合比為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)）使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。此時(shí)蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于其分子量大小?？梢岳肧DS測定蛋白質(zhì)分子量。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)加入巰基乙醇（強(qiáng)還原劑），使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵保持還原狀態(tài)，利于蛋白質(zhì)和SDS定量結(jié)合。3.轉(zhuǎn)膜實(shí)現(xiàn)蛋白從凝膠到膜的轉(zhuǎn)移常用的固相支持物：NC膜,PVDF膜轉(zhuǎn)膜方法：電轉(zhuǎn)移法（濕法、半干法）轉(zhuǎn)膜裝置：夾心三明治結(jié)構(gòu)(陰極碳極板、海綿、濾紙、凝膠、NC膜、濾紙、海綿、陽極碳極板)，180mAX2hrs/100vX1hr轉(zhuǎn)膜效果檢測：①膜的檢測：麗春紅染膜；應(yīng)用預(yù)染蛋白Marker②凝膠的檢測：考馬斯亮藍(lán)染色轉(zhuǎn)膜后的膠4.免疫學(xué)檢測封閉：5%脫脂奶粉或BSA，封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)。一抗孵育：一抗與封閉液以一定稀釋度配比。二抗孵育：用與一抗種屬相同的二抗進(jìn)行孵育。檢測：利用二抗上的標(biāo)記物（AP/HRP）可以使底物顯色或發(fā)光來檢測蛋白。注意事項(xiàng)：①一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對不同的蛋白質(zhì)要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。②底物溶液要新鮮配制。③帶手套操作，避免樣品污染，也保護(hù)自己。SDS-三、儀器、原料和試劑試劑：10%SDS、凝膠貯存液（30%ACr-Bis）、分離膠緩沖液（1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液）、濃縮膠緩沖液（1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液）、10%過硫酸銨、TEMED、pH8.3Tris-Gly電極緩沖液、0.05%考馬斯亮蘭R250器材：垂直板電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、脫色搖床原料：血清蛋白樣品四、實(shí)驗(yàn)步驟1、安裝夾心式垂直板電泳槽

：注意：安裝前，膠條、玻璃板都要潔凈干燥；勿用手接觸灌膠面的玻璃。2、配膠：根據(jù)所測蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。3、制備凝膠板（1）分離膠制備（10%分離膠，20ml/電泳槽）（2）濃縮膠的制備（5%濃縮膠，10ml/電泳槽）4、樣品的處理及加樣將血清樣品與加樣緩沖液混勻，在沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。用微量進(jìn)樣器取上述混合液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。5、電泳

將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接，打開電泳儀開關(guān)，開始時(shí)電壓為80V，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至12