藥物特殊毒性評價

藥物的遺傳毒性及評價

了解毒性反應劑量、時間、強度、癥狀、靶器官及可逆性等，為臨床方案供應參考、預料出現(xiàn)的毒性反應，制訂臨床防護措施、保證受試者用藥平安

毒理學特殊毒性評價一般毒性評價急性毒性長期毒性目的局部毒性遺傳毒性致癌性生殖毒性依靠性先天愚型海豹肢畸形突變（mutation）指生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生急劇的遺傳學變更，導致可遺傳的表型變異，其表型變異為不行逆的，這種現(xiàn)象稱為突變作用。

突變作用可視為DNA結構在任一水平上受到破壞，并由此變更了體細胞或生殖細胞中的遺傳信息，DNA是大分子物質(zhì)，它確定了生命現(xiàn)象的基本屬性

第1節(jié)

藥物致遺傳損傷的類型堿基的排列依次確定著蛋白質(zhì)肽鏈的長短及其氨基酸的依次基因是DNA分子上最簡潔而已完整的功能單位，每一個基因產(chǎn)生一種功能產(chǎn)物，幾乎全部的基因功能產(chǎn)物是多肽（蛋白質(zhì)）一個基因在伸直的DNA鏈上約500-1000個堿基對結果可造成細胞或機體的死亡、或細胞、機體結構形態(tài)或功能的變更染色體畸變（chromosomeaberration）基因突變（genemutation）（一）基因突變定義：組成一個染色體的一個或幾個基因發(fā)生變更，這種變更不能用光學顯微鏡干脆視察到。

二、基因突變與染色體畸變（一）自發(fā)突變與誘發(fā)突變自發(fā)突變--------在自然狀態(tài)下基因結構發(fā)生的變更，與生物適應環(huán)境變更的進化有關誘發(fā)突變--------在外界因素影響下所產(chǎn)生的基因結構變更變更一、基因突變（二）堿基置換與移碼突變（1）轉換型突變：指DNA多核苷酸鏈上的堿基中，嘌呤相互取代或嘧啶相互取代所引起的突變。如：亞硝酸可引起這種突變（2）顛換型突變：只DNA多核苷酸鏈上的堿基中，嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤所引起的突變。如：二乙基亞硝酸胺一、基因突變（二）堿基置換與移碼突變（3）移碼突變定義：指DNA多核苷酸鏈上堿基序列中丟失一個或幾個堿基，或插入一個或幾個化合物分子，結果使突變位點以下的堿基序列發(fā)生變更，以致使三聯(lián)密碼轉錄和翻譯時，發(fā)生較多遺傳信息的改變。多環(huán)芳香烴類、等能引起插入性移碼突變一、基因突變（三）同義突變、錯義突變和無義突變一、基因突變（二）染色體畸變定義：一個或幾個染色體結構或數(shù)目發(fā)生變更，用光學顯微鏡可以干脆進行視察。1.染色體數(shù)目的畸變突變細胞中，染色體可以成倍地發(fā)生變更，也可以不成倍的增減二、染色體畸變2.染色體結構的畸變斷裂是造成染色體結構變更的根本緣由，依據(jù)斷片不同的重接方式，形成以下四種畸變：（1）缺失（2）重復（3）倒位（4）易位在誘變因素的作用下，染色體從長軸上斷下一個片段染色體的斷片未與斷裂端連接結果：失去一個片段及所攜帶的遺傳密碼斷片與同源染色體連接結果：使部分遺傳密碼重復出現(xiàn)斷片作180°倒轉后，再接到斷端結果：所攜帶的遺傳密碼紊亂兩條非同源染色體同時斷裂，兩個斷片交換位置后相接結果：所攜帶的遺傳密碼紊亂二、染色體畸變其次節(jié)突變作用的分子機理一、干脆作用于DNA1.堿基類似物取代如：5-溴脫氧尿嘧啶核苷與胸腺嘧啶（T）相像2.烷化劑的影響一般認為，鳥嘌呤的N-7位置最易接受烷化劑賜予的烷化基團，當N-7位受到烷化后，分子的內(nèi)部電子和質(zhì)子位置重新排列，鳥嘌呤由酮式異構體變?yōu)橄┐际疆悩嬻w，引起堿基錯誤配對，最終產(chǎn)生轉換型堿基置換二、不以DNA為靶的間接誘變凡干擾有絲分裂的物質(zhì)，不管是抑制紡錘體的功能，或擾亂染色體分別，稱之為干擾劑1.秋水仙效應有絲分裂（細胞分裂完全抑制）秋水仙堿長春新堿2對酶促過程的作用對DNA合成和復制有關的酶系統(tǒng)作用也可間接影響遺傳物質(zhì)第3節(jié)藥物致遺傳損傷的影響因素及后果

對人類基因庫的影響人類基因庫是指人群生殖細胞所具有的能傳給下一代的全部基因總和?；蚪M是指單一個體所具有全部基因在人群中每個個體新攜帶的有害基因的平均水平叫做人群的遺傳負荷（Gennticload）或突變負荷（mutationload)體細胞突變的后果體細胞突變的后果中令人最關切的是致癌問題其次是致畸體細胞的突變可能與動脈硬化有關體細胞突變是老化的起因突變后果生殖細胞突變的后果致死性的非致死性的-----遺傳病（顯性或隱性）在遺傳疾病增多的同時，突變的基因（及染色體）損傷將造成下一代的基因庫的遺傳負荷可遺傳的突變都是壞事？突變后果符合下列狀況者應優(yōu)先考慮檢測已知的或可疑的誘變劑有關的化合物在動物試驗中表現(xiàn)出某些毒性反應的化合物臨床療程長，尤其是用于兒童和青年人的藥物在大部分人群中運用的藥物一般用于預防的藥物普遍濫用的藥物以高濃度與精子接觸起作用的藥物第4節(jié)

藥物遺傳毒性評價

1鼠傷寒沙門氏桿菌回復突變試驗2大腸桿菌回復突變試驗

3體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗4微核試驗5哺乳動物體內(nèi)骨髓細胞遺傳試驗6哺乳動物體外細胞基因突變試驗7果蠅隱性伴性致死試驗8嚙齒動物顯性致死試驗第4節(jié)藥物遺傳毒性評價國際經(jīng)濟合作發(fā)展組織（OECD）舉薦方法國際經(jīng)濟合作和發(fā)展組織（OECD）鼠傷寒沙門氏桿菌回復突變試驗大腸桿菌回復突變試驗微核試驗哺乳動物體內(nèi)骨髓細胞遺傳試驗哺乳動物體外細胞染色體畸變試驗果蠅隱性伴性致死試驗嚙齒動物顯性致死試驗測定基因點突變?nèi)旧w畸變?nèi)旧w畸變生殖細胞染色體畸變一些國家新藥遺傳毒性試驗的項目一、鼠傷寒沙門菌回復突變試驗（Ames試驗）1.[原理]組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌在缺乏組氨酸的培育基上不能生長，但在加有致突變原的培育基上培育，則可使突變型產(chǎn)生回復突變成為野生型，即復原合成組氨酸的實力，于是就能在缺乏組氨酸的培育基上生長成為菌落，通過計數(shù)菌落出現(xiàn)的數(shù)目估計藥物誘變性的強弱。同時在檢測系統(tǒng)中還包括大鼠肝微粒體酶（S9）體外代謝活化系統(tǒng)，使藥物在體外受到與體內(nèi)類似的氧化活化作用，因此可測出間接誘變原。2.[試驗菌株]一、Ames試驗各種鼠傷寒沙門氏菌株對不同的致突變物敏感性不同TA100和TA98可舉薦用于大多數(shù)致突變物和致癌物的檢測。我國《新藥審批方法》中舉薦運用TA97、TA98、TA100和TA102四種標準菌株。一、Ames試驗試驗前必需進行菌株的基因型鑒定、自發(fā)回變數(shù)鑒定及對鑒別性致突變物的反應鑒定，合格后才能用于致突變試驗一、Ames試驗[菌株鑒定]基因型鑒定

A.

組氨酸需求試驗B.深粗糙型(rfa)鑒定C.urvB缺失的鑒定D.R因子的鑒定(抗生素抗性試驗)自發(fā)回變數(shù)測定對鑒別性致突變物的反應一、Ames試驗（1）基因型鑒定①組氨酸養(yǎng)分缺陷型鑒定（組氨酸需求試驗）組氨酸養(yǎng)分缺陷型菌株只能在補充有組氨酸的培育皿上生長②深粗糙型（rfa）鑒定（結晶紫抑菌試驗）深粗糙型突變細菌，缺乏脂多糖屏障，一些大分子能進入菌體菌株鑒定

一、Ames試驗③uvrB缺失的鑒定（紫外線敏感試驗）uvrB缺失，即切除修復系統(tǒng)缺失④R因子的鑒定：帶有R因子的菌株具有抗氨芐青霉素的特性菌株鑒定一、Ames試驗（2）自發(fā)回變數(shù)測定受試菌株在保存或培育過程中，能產(chǎn)生自發(fā)回變（3）對鑒別性致突變物的反應經(jīng)過體外代謝活化系統(tǒng)后的自發(fā)回變數(shù)，要比不經(jīng)體外代謝活化系統(tǒng)的自發(fā)回變數(shù)略高。

菌株鑒定一、Ames試驗確定藥物最高劑量的標準是藥物對細菌的毒性和溶解度。西藥最大劑量可達5mg/皿，中藥可超過5mg/皿最低劑量0.2μg/皿.至少5個不同劑量每劑量間隔不差過5倍每個劑量應做3個皿可用水、二甲基亞砜(DMSO)或乙醇做溶劑一、Ames試驗3.[試驗設計]DMSO≤0.4ml；乙醇≤0.1ml比照組陰性比照組陽性比照組對需運用間接誘變物作比照時，應留意平行加S9與不加S9的比照一、Ames試驗應用誘導劑處理后的S9進行體外代謝活化試驗，即在加S9和不加S9混合物平行條件下測試。為何要制備S9？為何要誘導制備S9？代謝活化一、Ames試驗S9代謝活化系統(tǒng)：經(jīng)誘導的大鼠肝臟勻漿，離心后所上清即為S9上清液，再向其中加入一些協(xié)助因子，如輔酶II（NADP）、6-磷酸葡萄糖、K+/Mg2+等，組成混合液，從而構成還原型輔酶II再生系統(tǒng)。肝S9的成分主要是混合功能氧化酶，大多數(shù)化合物在體內(nèi)經(jīng)過其代謝。一、Ames試驗(1)摻入法：(2)點試法：5.[結果評價]報告的試驗結果應是2次獨立試驗的重復結果。推斷是否是致突變物？4.[方法]一、Ames試驗（1）摻入法：Rt/Rc=誘發(fā)回變菌落數(shù)/自發(fā)回變菌落數(shù)>2為陽性(2)點試法：凡在濾紙四周長出一圈密集的回變菌落，該藥物即為致突變物質(zhì)。如在平皿上出現(xiàn)少數(shù)散在的自發(fā)菌落，則為陰性一、Ames試驗二、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗中國倉鼠肺（CHL）細胞（舉薦）、卵巢（CHO）細胞[原理]具有遺傳毒性的物質(zhì)作用于靶細胞引起較大范圍的DNA損傷，可出現(xiàn)染色體水平變更。制備中期分裂相染色體標本，在光鏡下可干脆視察染色體數(shù)目和形態(tài)的變更。通過檢測受試物誘發(fā)體外培育的哺乳動物細胞染色體畸變實力，從而評價受試物的遺傳毒性及其強度[試驗設計]1.試驗至少設4個劑量組2.最高劑量組的細胞存活率為10%-20%3.無毒性受試物最高劑量組不超過10mmol/L或5mg/ml4.應設空白比照、陽性比照和S9比照

用細胞遺傳學方法檢測受試物是否影響DNA結構或變更遺傳信息的試驗過程，從而判定受試物的遺傳毒性體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗[方法]1.在培育72小時的細胞中一次加入確定濃度的受試物、S9混合液（不加S9混合液時，需用培育液不足）及確定量不含血清的培育液，混勻后接著培育24h收獲細胞2.收獲細胞前加入秋水仙堿作用4小時3.用胰蛋白酶溶液消化并收集細胞，加入KCL溶液低滲處理10min4.離心后，用甲醇/冰醋酸液固定2次5.常規(guī)底片，染色，清洗，晾干6.每組選100個染色體分散良好的中期分裂相細胞進行染色體畸變分析哺乳動物胞染色體畸變試驗[結果及判定]鏡檢：每種濃度至少視察100個中期分裂相細胞和染色體結構，計算結構突變及多倍體出現(xiàn)率。陽性結果判定標準：1染色體畸變數(shù)增加與藥物劑量有關，單劑量組按下表判定2某一測試點呈現(xiàn)可重復的并有統(tǒng)計學意義的增加三、微核試驗[原理]骨髓細胞經(jīng)致突變物作用，其染色體可發(fā)生畸變以致斷裂。其斷裂的碎片在分裂間期留在子代細胞內(nèi)形成規(guī)則的一個或幾個圓形或橢圓形結構的小塊物質(zhì)，由于它比一般細胞核小，故稱之為微核（micronucleus）。視察骨髓細胞中的微核率，有助于檢驗藥物是否具有致突變作用。雖然骨髓和外周血各種有核細胞中均可見到微核，但只有在無核的紅細胞中才易辯認。在骨髓中無核紅細胞有嗜多染紅細胞（晚幼紅細胞）和成熟紅細胞兩種，正常狀況下，嗜多染紅細胞占多數(shù)。由于毒性物質(zhì)影響了骨髓紅細胞尤其是嗜多染紅細胞，使二者比例失衡，故在骨髓涂片中一般均在嗜多染紅細胞中進行視察。微核試驗[動物]NIH小鼠，6只/組（雄性）或10只/組（雌雄各半），。[給藥劑量及途徑]高、中、低三個劑量；高劑量以LD50/2為基準；低劑量應結合藥效學及臨床用量；一般單次給藥。[比照]陰性（溶媒）比照；陽性（環(huán)磷酰胺）。環(huán)磷酰胺不同途徑給藥對小鼠微核出現(xiàn)率的影響微核試驗[試驗設計]1.NIH小鼠，6只/組（雄性）或10只/組（雌雄各半）。2.動物體重差異應在平均體重的20%之內(nèi)。3.至少三個劑量組；高劑量以LD50/2為基準；低劑量應結合藥效學及臨床用量。4.設陽性比照組（環(huán)磷酰胺）和陰性比照組（溶劑）5.兩次染毒或多次染毒環(huán)磷酰胺不同途徑給藥對小鼠微核出現(xiàn)率的影響[方法]