TCVMA 91-2022 基于惰性載體靶向D群沙門氏菌感染抗體的間接凝集檢測方法

ICS11.220CCSB41團 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/CVMA91—2022基于惰性載體靶向D群沙門氏菌感染抗體的間接凝集檢測方法InertcarrierbasedindirectagglutinationtestofantibodiesagainstGroupDSalmonellainfection2022-03-07發(fā)布 2022-03-07實施中國獸醫(yī)協(xié)會 發(fā)布T/CVMA91-2022T/CVMA91-2022PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANIII目 次前言 II引言 III范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1試劑與材料 2儀器設(shè)備 2樣品 2試驗步驟 3試驗數(shù)據(jù)處理 4附錄A（規(guī)范性）凝集試驗結(jié)果及判定 5附錄B（規(guī)范性）D群沙門氏菌陰性、陽性血清的背景及來源 7附錄C（規(guī)范性）基于惰性載體靶向D群沙門氏菌感染抗體的間接凝集檢測試劑的制備方法 8前 言本文件按照GB/T1.1—20201草。本文件涉及專利。本文件由中國獸醫(yī)協(xié)會提出并歸口。本文件起草單位：揚州大學(xué)、中國動物疫病預(yù)防控制中心、江蘇省動物疫病預(yù)防控制中心、安徽榮達(dá)生物技術(shù)有限公司、和盛食品集團有限公司。引 言本文件的發(fā)布機構(gòu)提請注意，聲明符合本文件時，可能涉及到標(biāo)準(zhǔn)正文3.1與惰性載體系統(tǒng)相關(guān)的專利（ZL201910424369.8ZL201910424381.9ZL202010427735.8ZL202010428277.X，ZL202010400163.4）的使用。本文件的發(fā)布機構(gòu)對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機構(gòu)承諾，他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，專利持有人姓名：朱國強；楊斌；羊揚；孟霞；夏芃芃；段強德；朱曉芳。地址：225009江蘇省揚州市大學(xué)南路88號請注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。涉及專利如下：一種惰性載體沙門氏菌及其潛在應(yīng)用[發(fā)明]ZL201910424369.8申請日授權(quán)公告日：2020.04.03 安徽榮達(dá)生物技術(shù)有限公司|登記生效日：2020.05.15一種惰性載體大腸桿菌及其潛在應(yīng)用[發(fā)明]ZL201910424381.922019.05.21授權(quán)公告日：2020.03.24一種泛性型惰性載體沙門氏菌及其潛在應(yīng)用[發(fā)明]ZL202010427735.8申請日：2020.05.19 權(quán)公告日：2020.12.25ZL202010428277.X惰性載體間接凝集試驗檢測系統(tǒng)及其應(yīng)用[發(fā)明]ZL202010400163.4申請日授公告日：2021.01.05T/CVMA91-2022T/CVMA91-2022PAGEPAGE1基于惰性載體靶向D群沙門氏菌感染的間接凝集檢測方法范圍本文件規(guī)定了檢測D群沙門氏菌感染抗體的惰性載體間接凝集檢測方法的試劑與材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗步驟和試驗數(shù)據(jù)處理。本文件適用于雞群D群沙門氏菌的檢測。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T1962.1 注射器、注射針頭及其他醫(yī)療器械第1部分：通用要求GB15810 一次性使用無菌注射器GB/T17999.1 SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測第1部分：SPF雞微生物監(jiān)測總則GB/T18635 動物防疫基本術(shù)語術(shù)語和定義GB/T18635界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。為了便于使用，以下重復(fù)列出了GB/T18635中的某些術(shù)語和定義。惰性載體inertcarrier（能在較高的工作濃度下與不同遺傳背景的多種雞源血清、全血不發(fā)生任何肉眼可見的凝集顆粒反應(yīng)，即與多種雞源血清、全血不產(chǎn)生非特異性凝集反應(yīng)。DinertcarrierdetectionsystemforinfectiousantibodyofGroupDSalmonella是一種可用于檢測、監(jiān)測和診斷D群沙門氏菌感染的新型專利檢測系統(tǒng)。惰性載體檢測系統(tǒng)的建立基于惰性載體S9群沙門氏菌感染產(chǎn)生的全血（血清）抗體，與D群沙門氏菌感染雞血清在工作濃度條件下產(chǎn)生肉眼可見的陽性凝集顆粒DD10μL反應(yīng)。凝集試驗agglutinationtest顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后在有電解質(zhì)存在且適宜反應(yīng)溫度條件時兩者互相結(jié)合凝集成肉眼見凝集和團凝試（aluinaon es參反的抗稱凝（aluinoen，抗體稱為凝集根據(jù)凝集反應(yīng)中抗原的性質(zhì)不同反應(yīng)的方式又分為直接凝集反（directagglutinationreaction）和間接凝集反應(yīng)（indirectagglutinationreaction）。基于惰性載體的間接凝集試驗indirectagglutinationtestbasedoninertcarrier惰性載體與相應(yīng)抗體/抗原直接反應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，當(dāng)特異性抗原表達(dá)展呈于惰性載體表面形成致敏顆粒，再與相應(yīng)抗體反應(yīng)，則出現(xiàn)凝集稱間接凝集反應(yīng)。D群沙門氏菌GroupDSalmonella是指O抗原為9，12或1，9，12的一類沙門氏菌。注：雞群中常見流行的D群沙門氏菌有雞白痢沙門氏菌（SalmonellaPullorum）、雞傷寒沙門氏菌（SalmonellaGallinarum）、腸炎沙門氏菌（SalmonellaEnteritidis）等，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，目前我國已將種雞場沙門氏菌凈化工作列入《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》中。無特定病原雞，SPF雞specificpathogenfreechicken（尤其是國內(nèi)流行的雞主要傳染病原的雞群。注：SPF雞需符合GB/T17999.1中規(guī)定的微生物學(xué)監(jiān)測要求。試劑與材料試劑診斷試劑：DDDSPFA。生理鹽水：0.9%的氯化鈉溶液。材料促凝管。無菌塑料吸頭。儀器設(shè)備透明玻璃板或玻片。白色勻光發(fā)光板。10μL～100μL10mL（帶針頭）GB15810，GB/T1962.1樣品全血樣品采用雞翼下靜脈無菌采血，直接進行現(xiàn)場檢測。血清樣品無菌采集全血2mL，室溫或37℃靜置60min，之后于4℃放置1h至過夜后，6000r/min離心5min，收集上清，4℃保存待檢，樣品采集時應(yīng)記錄翅號、采樣時間等信息。試驗步驟檢測操作臺的設(shè)置預(yù)試驗（檢驗標(biāo)準(zhǔn)）每次檢測前20min從4℃冰箱中取出DDSPF無菌生理鹽水，使其回升至室溫左右溫度(14℃~28℃)。用微量移液器吸取充分混勻的D染抗體檢測用惰性載體對照系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)各一滴(約為10μL)垂直滴加在檢測操作臺的潔凈玻璃板或SPF雞血清陰性對照和無菌生理鹽水1cm~2cm2min采血技術(shù)規(guī)范采血人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)并熟練掌握采樣技巧，遵循嚴(yán)格的無菌操作原則，遵守雞場的消毒防疫等相關(guān)規(guī)定并進行個人防護。采血場所應(yīng)有充足的光線以便于肉眼觀察判定現(xiàn)場的凝集顆粒反應(yīng)，建議夏季室溫保持在25～2814～20采血時用的注射器應(yīng)保持清潔干燥，要有足夠的強度維持操作，使用靈活且方便，外包裝未破損，并在有效期內(nèi)使用。采血一般采用雞翼下靜脈采血法，下述程序供參考。采血時，助手保定雞。助手左手抓雞的兩0.3cm45°左右，進針時針頭的切口面向上，針頭輕挑起表皮，由表皮與肌肉之10μL～20μL凝集試驗結(jié)果判定10μL～20μL2min凝集試驗成立條件：預(yù)試驗中，2minD（BB1C。出現(xiàn)明顯藍(lán)色凝集塊，背景較為清朗，判為“++”（BB.1B）。出現(xiàn)大的藍(lán)色凝集塊，背景很清朗，判為“+++”（BB.1A）。試驗數(shù)據(jù)處理DDD附錄A（規(guī)范性）D群沙門氏菌陰性、陽性血清的背景及來源本文件應(yīng)用的D群沙門氏菌陰性、陽性血清的背景及來源見表A.1。表A.1 D群沙門氏菌陰性、陽性血清的背景及來源血清類型背景來源D群沙門氏菌陰性血清SPF雞血清SPF雞為實驗動物公司采購雞白痢沙門氏菌陽性血清SPF雞感染雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC526血清實驗室感染雞傷寒沙門氏菌陽性血清SPF雞感染雞傷寒沙門氏菌疫苗株SG9R血清實驗室感染T/CVMA91-2022T/CVMA91-2022PAGEPAGE6附錄B（規(guī)范性）凝集試驗結(jié)果及判定血清樣品檢測結(jié)果判定見圖B.1。全血樣品檢測結(jié)果判定見圖B.2。序號說明：A——強陽性反應(yīng)“+++”；B——陽性反應(yīng)“++”；C——弱陽性反應(yīng)“+”；D——陰性反應(yīng)“-”。圖B.1 惰性載體檢測系統(tǒng)與雞源血清樣本凝集反應(yīng)結(jié)果示意圖序號說明：A——陽性反應(yīng)；B——陰性反應(yīng)。圖B.2 惰性載體檢測系統(tǒng)與雞源全血樣本凝集反應(yīng)結(jié)果圖附錄C（規(guī)范性）基于惰性載體靶向D群沙門氏菌感染抗體的間接凝集檢測試劑的制備方法培養(yǎng)對照系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)惰性載體菌于37℃液體LB