細(xì)菌的耐藥性的產(chǎn)生及檢測(cè)方法

關(guān)于細(xì)菌的耐藥性的產(chǎn)生及檢測(cè)方法第1頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第2頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌定義廣義定義：是指一大類(lèi)細(xì)胞核無(wú)核膜包裹，只存在裸露DNA的原始單細(xì)胞生物，包括真細(xì)菌和古生菌兩大類(lèi)群。細(xì)菌數(shù)量：所有生物中數(shù)量最多的一類(lèi)。細(xì)菌廣泛存在我們?nèi)祟?lèi)體內(nèi)，人體內(nèi)及表皮上的細(xì)菌總數(shù)約是人體細(xì)胞總數(shù)的十倍。第3頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌與人類(lèi)關(guān)系第4頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌結(jié)構(gòu)第5頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌致病性細(xì)菌在人體內(nèi)寄生，增殖并引起疾病的特性稱(chēng)為細(xì)菌的致病性第6頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五侵襲力胞外酶血漿凝固酶游離血漿凝固酶凝聚因子鏈激酶:激活纖溶酶原或胞漿素原,破壞纖維蛋白屏障透明質(zhì)酸酶：溶解結(jié)締組織透明質(zhì)酸莢膜:抵抗吞噬其他表面活性物質(zhì):Vi抗原、K抗原等第7頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五毒素外毒素主要由革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生親組織性，選擇性地作用于某些組織和器官。破傷風(fēng)桿菌毒素麻痹運(yùn)動(dòng)神經(jīng)肉毒桿菌毒素造成眼及咽肌的麻痹白喉?xiàng)U菌引起心肌炎、腎上腺出血及神經(jīng)麻痹等。內(nèi)毒素主要由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生無(wú)組織選擇性，引起的病理變化和臨床癥狀大致相同發(fā)熱反應(yīng)糖代謝紊亂影響血管舒縮機(jī)能彌漫性血管內(nèi)凝血第8頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌侵入途徑、數(shù)量與感染多數(shù)病原菌只有經(jīng)過(guò)特定的門(mén)戶(hù)侵入，并在特定部位定居繁殖，才能造成感染。痢疾桿菌必須經(jīng)口侵入，定居于結(jié)腸內(nèi)，才能引起疾病。破傷風(fēng)桿菌，只有經(jīng)傷口侵入，厭氧條件下，引發(fā)疾病。病原菌的數(shù)量與致病能力一般成正比。第9頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五主要內(nèi)容細(xì)菌與人類(lèi)關(guān)系抗菌藥物應(yīng)用細(xì)菌耐藥產(chǎn)生細(xì)菌耐藥的檢測(cè)第10頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五抗菌藥物產(chǎn)生第11頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五抗菌藥物的定義

抗菌藥物包括：抗生素由微生物（如細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌）、植物和動(dòng)物在其生命活動(dòng)過(guò)程中所產(chǎn)生人工半合成、全合成的化學(xué)藥物第12頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五抗菌活性根據(jù)不同特性分為：抑菌劑：速效抑菌劑（四環(huán)素類(lèi)、林可霉素類(lèi)、氯霉素與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)）和慢效抑菌劑（磺胺類(lèi)）殺菌劑：繁殖期殺菌劑（青霉菌素類(lèi)及頭孢菌素類(lèi)）和靜止期殺菌劑（喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、多粘菌素類(lèi)）活性評(píng)價(jià)指標(biāo)最低抑菌濃度（MIC）指能夠抑制培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度最低殺菌濃度(MBC）指能夠殺滅培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度第13頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五抗菌藥物分類(lèi)(1)β-內(nèi)酰胺類(lèi)：青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)的分子結(jié)構(gòu)中含有β-

內(nèi)酰胺環(huán)。(2)氨基糖苷類(lèi)：包括鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素等。(3)四環(huán)素類(lèi)：包括四環(huán)素、土霉素、金霉素及強(qiáng)力霉素等。(4)氯霉素類(lèi)：包括氯霉素、甲砜霉素等。(5)大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)：紅霉素、白霉素、乙酰螺旋霉素、麥迪霉素、阿奇霉素等。(6)糖肽類(lèi)抗生素：萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素、替考拉寧。(7)喹諾酮類(lèi)：諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、加替沙星等。第14頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五抗菌藥物分類(lèi)

(8)硝基咪唑類(lèi)：包括甲硝唑、替硝唑、奧硝唑等。(9)作用于G-菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、環(huán)絲氨酸、利福平等。(10)作用于G+細(xì)菌的其它抗生素：林可霉素、氯林可霉素、桿菌肽等.(11)抗真菌抗生素：多烯類(lèi)、咪唑類(lèi)、三唑類(lèi)用于真菌細(xì)胞膜上麥角甾醇的抗真菌藥物、烯丙胺類(lèi)、氮唑類(lèi)。(12)抗結(jié)核菌類(lèi)：利福平、異煙肼、吡嗪酰胺等。(13)具有免疫抑制作用的抗生素如環(huán)孢霉素。第15頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五抗菌藥物作用機(jī)理

針對(duì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)，抗菌藥主要有5類(lèi)作用機(jī)理：阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致細(xì)菌在低滲透壓環(huán)境下膨脹破裂死亡，哺乳動(dòng)物的細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，不受這類(lèi)藥物的影響。

第16頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五抗菌藥物作用機(jī)理與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性、打開(kāi)膜上的離子通道，讓細(xì)菌內(nèi)部的有用物質(zhì)漏出或電解質(zhì)平衡失調(diào)而死亡阻礙細(xì)菌DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)菌分裂繁殖受阻。第17頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五影響葉酸代謝抑制細(xì)菌葉酸代謝過(guò)程中的二氫葉酸合成酶和二氫葉酸還原酶。導(dǎo)致核酸合成受阻，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。與細(xì)菌核糖體或其反應(yīng)底物相互作用，抑制蛋白質(zhì)的合成抗菌藥物作用機(jī)理第18頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五主要內(nèi)容細(xì)菌與人類(lèi)關(guān)系抗菌藥物應(yīng)用細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生細(xì)菌耐藥的檢測(cè)第19頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生

青霉素的廣泛使用后耐藥性很快產(chǎn)生(β-內(nèi)酰胺環(huán)被破壞后，青霉素的抗菌活性也隨之而消失)，隨后由于抗菌藥物大量使用的壓力，針對(duì)各種抗菌藥物的耐藥性逐漸產(chǎn)生。細(xì)菌耐藥性又稱(chēng)抗藥性，系指細(xì)菌對(duì)于抗菌藥物作用的耐受性，耐藥性一旦產(chǎn)生，藥物的化療作用就明顯下降。耐藥性根據(jù)其發(fā)生原因可分為獲得耐藥性和天然耐藥性。自然界中的病原體，如細(xì)菌的某一株也可存在天然耐藥性。當(dāng)長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素時(shí)，占多數(shù)的敏感菌株不斷被殺滅，耐藥菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使細(xì)菌對(duì)該種藥物的耐藥率不斷升高。第20頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌耐藥性20世紀(jì)30年代末磺胺藥上市，40年代臨床廣泛使用磺胺藥后，50年代日本報(bào)道80%～90%的志賀痢疾桿菌對(duì)磺胺藥耐藥了。20世紀(jì)40年代青霉素剛使用不久即出現(xiàn)耐青霉素金葡菌，50年代發(fā)現(xiàn)金葡菌能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶滅活青霉素，1961年,甲氧西林問(wèn)世并投入臨床應(yīng)用(抗金葡菌產(chǎn)生的青霉酶)，從甲氧西林使用10余年后，出現(xiàn)耐甲氧西林金葡菌(MRSA)報(bào)道。第21頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌耐藥性60～70年代，細(xì)菌耐藥性主要表現(xiàn)為金黃色葡萄球菌和一般腸道陰性桿菌由于能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶使青霉素類(lèi)和一代頭孢菌素抗菌作用下降。80年代后，G-桿菌產(chǎn)生的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和AmpC酶，三代頭孢菌素在內(nèi)的多種抗生素耐藥的多重耐藥革蘭陰性桿菌出現(xiàn)。近年來(lái)，出現(xiàn)了萬(wàn)古霉素中介金葡菌，2002年以來(lái),美國(guó)已先后報(bào)道了3株對(duì)萬(wàn)古霉素完全耐藥的金葡菌。1990年就有耐亞胺培南的一株陰溝腸桿菌報(bào)道，但在隨后10年期間并未有更多耐碳青霉烯類(lèi)抗生素腸桿菌報(bào)道，直到2000年后有關(guān)

CRE的報(bào)道不斷增多，一種新抗生素從研制到臨床應(yīng)用一般需要5～10年，而產(chǎn)生細(xì)菌耐藥僅需要2年。第22頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌多重耐藥多重耐藥：指細(xì)菌對(duì)常用抗菌藥物主要分類(lèi)的3類(lèi)或以上藥物耐藥。泛耐藥細(xì)菌：指對(duì)所有分類(lèi)的常用抗菌藥物全部耐藥，革蘭氏陰性桿菌對(duì)包括多黏菌素和替加環(huán)素在內(nèi)的全部抗菌藥物耐藥，革蘭氏陽(yáng)性球菌對(duì)包括糖肽類(lèi)和利奈唑胺在內(nèi)的全部抗菌藥物耐藥。第23頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五超級(jí)細(xì)菌超級(jí)細(xì)菌,目前引起特別關(guān)注的超級(jí)細(xì)菌主要有：耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬(wàn)古霉素腸球菌（VRE）、耐多藥肺炎鏈球菌（MDRSP）、多重耐藥性結(jié)核桿菌（MDR-TB）、最近新發(fā)現(xiàn)的攜帶有NDM-1基因的大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌以及多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（MRAB）等。超級(jí)細(xì)菌并非新事物，它們一直存在并且隨著人類(lèi)濫用抗生素而進(jìn)化出強(qiáng)大耐藥性?！俺?jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)，一度引起了世界的恐慌。在青霉素被發(fā)現(xiàn)后的半個(gè)世紀(jì)，人類(lèi)走了一圈又回到了原地，來(lái)到了多年前有人預(yù)測(cè)的“后抗生素時(shí)代”。我國(guó)是世界上濫用抗生素較為嚴(yán)重的國(guó)家,耐藥菌引起的醫(yī)院感染人數(shù),已占到住院感染患者總?cè)藬?shù)的30%左右。因此有專(zhuān)家預(yù)言,我國(guó)有可能率先進(jìn)入“后抗生素時(shí)代”，即回到抗生素發(fā)現(xiàn)之前的時(shí)代。第24頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌多重耐藥為此2011年世界衛(wèi)生組織（WHO）提出了“遏制細(xì)菌耐藥，今天不采取行動(dòng)，明天就無(wú)藥可用”的口號(hào)，細(xì)菌耐藥已成為一個(gè)極其重要的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題。第25頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌耐藥基礎(chǔ)固有耐藥性：是由細(xì)菌染色體基因決定、代代相傳，不會(huì)改變的，如鏈球菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素天然耐藥；腸道G-桿菌對(duì)青霉素天然耐藥；銅綠假單胞菌及嗜麥芽窄食單胞菌對(duì)多數(shù)抗生素均不敏感。獲得性耐藥性：細(xì)菌與抗生素接觸后，在抗菌藥物選擇性壓力存在下經(jīng)過(guò)基因突變、潛伏基因的表達(dá),或細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得抗性基因,或通過(guò)移動(dòng)因子包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子轉(zhuǎn)移和傳播耐藥基因而獲得的耐藥表型,通過(guò)改變自身的代謝途徑，使其不被抗生素殺滅。如金黃色葡萄球菌產(chǎn)生過(guò)多β-內(nèi)酰胺酶或過(guò)度表達(dá)mecA基因而耐藥。細(xì)菌的獲得性耐藥可因不再接觸抗生素而消失，也可由質(zhì)粒將耐藥基因轉(zhuǎn)移個(gè)染色體而代代相傳，成為固有耐藥。第26頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五獲得性耐藥性

獲得性耐藥機(jī)制更容易將耐藥基因通過(guò)水平或垂直傳播方式在不同菌株或不同菌種間傳播，加速了細(xì)菌耐藥蔓延的速度，導(dǎo)致耐藥菌株越來(lái)越多，細(xì)菌耐藥性迅速上升，使臨床上不斷出現(xiàn)多重耐藥株、泛耐藥株甚至“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)。在上世紀(jì)50～60年代，全世界每年死于感染性疾病的人數(shù)約700萬(wàn)，而現(xiàn)在這個(gè)數(shù)字上升到了2000萬(wàn)。死于敗血癥的人數(shù)上升了89%，大部分人死于超級(jí)細(xì)菌帶來(lái)的用藥困難。第27頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌耐藥機(jī)制β-內(nèi)酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)及其N(xiāo)-酰基衍生物分子中β-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺鍵的滅活酶。細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶降解是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是最常見(jiàn)的耐藥方式(80%病原菌耐藥方式之一,至今β-內(nèi)酰胺酶數(shù)量已超過(guò)350余種)Ambler等根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶分子結(jié)構(gòu)中氨基酸序列差異分為A，B，C,D。1995年Bush等提出功能分類(lèi)方案，依據(jù)酶的底物和酶的抑制物不同，主要分為青霉素酶,頭孢菌素酶，廣譜酶和超廣譜酶四種第28頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五A型β-內(nèi)酰胺酶

A型β-內(nèi)酰胺酶按Bush分類(lèi)法屬2群，向下又分為8個(gè)亞群(2a,2b,2c,2d,2e,2f,2be,2br)，因此，A型β-內(nèi)酰胺酶在底物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)上顯示多樣性。大多數(shù)青霉素類(lèi)抗生素都是A型β-內(nèi)酰胺酶的良好底物，如氨芐西林、羧芐西林、苯唑西林和甲氧西林等。從整體上看，A型β-內(nèi)酰胺酶對(duì)青霉素類(lèi)的水解率較頭孢菌素類(lèi)為高，可引起氨曲南和碳青霉烯類(lèi)耐藥。此類(lèi)酶的活性可被克拉維酸等酶抑制劑所抑制，而EDTA不能抑制，引起臨床關(guān)注和危害較大的腸桿菌科細(xì)菌A類(lèi)碳青霉烯酶主要是KPC酶。第29頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五B型β-內(nèi)酰胺酶

發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年，依賴(lài)金屬離子發(fā)揮催化活性，主要為Zn2+，此酶不被棒酸抑制，被EDTA抑制，其主要特征是除單氨類(lèi)抗生素（如氨曲南）以外，可水解碳青霉烯酶類(lèi)等各種

β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，主要包括

NDM-1、IMP、VIM、KHM-1、GIM-1和

SIM-1。對(duì)于產(chǎn)

B類(lèi)酶的菌株的尚無(wú)很好的治療手段，值得重視的是對(duì)該種酶的檢測(cè)，以防止其爆發(fā)流行。第30頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五C型β-內(nèi)酰酶

C型β-內(nèi)酰酶通常被稱(chēng)為頭孢菌素酶1989首次發(fā)現(xiàn)，按Bush分類(lèi)法屬1群。第1代頭孢菌素是C型β-內(nèi)酰胺酶的良好底物，第2、3代頭孢菌素一般對(duì)C型β-內(nèi)酰胺酶不敏感。亞胺培南和氨曲南則表現(xiàn)出對(duì)C型β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用。主要包括CMY、FOX、MOX、LAT、ACT、ACC、MIR和DHA第31頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五D型β-內(nèi)酰胺酶

D型β-內(nèi)酰胺酶Bush分類(lèi)屬2d群，它們對(duì)苯唑西林和氯唑西林的水解速度明顯大于芐青霉素，因此，它們又被稱(chēng)為“苯唑西林酶”，其中OXA-48在碳青霉烯類(lèi)耐藥中顯示出了日趨重要的碳青霉烯酶的活性。第32頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五超廣譜β-內(nèi)酰胺酶ESBLs是一大類(lèi)基于TEM-1、TEM-2和

SHV-1型β內(nèi)酰胺酶基礎(chǔ)上經(jīng)突變而成的多種β-內(nèi)酰胺酶，水解青霉素、廣譜青霉素、頭孢菌素、單環(huán)類(lèi)、第四代頭孢菌素，但不能水解碳青霉烯類(lèi)、頭霉素類(lèi)。除了對(duì)β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥外，經(jīng)常伴隨對(duì)氨基糖苷類(lèi)等其他抗生素的耐藥性。準(zhǔn)確區(qū)分ESBLs和非ESBLs菌株，不僅可指導(dǎo)臨床合理用藥，以免延誤病情和增加醫(yī)療費(fèi)用，而且有利于對(duì)ESBL菌株的管理，控制其傳播，防止爆發(fā)流行，對(duì)提高治療效果和控制醫(yī)院院內(nèi)感染均有重要意義。第33頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五AmpC酶

G-桿菌產(chǎn)生的不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶組成的一個(gè)酶家族,屬于β-內(nèi)酰胺酶分子分類(lèi)中的C類(lèi)。產(chǎn)AmpC酶的耐藥菌幾乎對(duì)所有的β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥,對(duì)第4代頭孢菌素如頭孢吡肟敏感,對(duì)碳青霉烯類(lèi)如亞胺培南、美羅培南有高度的活性。

AmpC酶可分為質(zhì)粒介導(dǎo)型和染色體介導(dǎo)型。質(zhì)粒AmpC基因來(lái)源于幾種腸桿菌科細(xì)菌染色體AmpC基因,其AmpC沒(méi)有調(diào)控基因,呈持續(xù)高表達(dá),且質(zhì)粒編碼常同時(shí)攜帶有其他的耐藥基因,因而導(dǎo)致多重耐藥,并且傳播很快,主要在大腸埃希菌、肺炎克雷白桿菌、沙門(mén)菌屬和志賀菌屬中出現(xiàn)。染色體介導(dǎo)的AmpC酶能水解第3代頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素,其高水平表達(dá)與調(diào)節(jié)基因突變有關(guān),當(dāng)AmpD基因突變產(chǎn)生有缺陷的AmpD蛋白時(shí),可引起AmpC過(guò)度表達(dá),使產(chǎn)酶量大增引起耐藥,多見(jiàn)于陰溝腸桿菌。第34頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五氨基糖苷修飾酶乙?；D(zhuǎn)移化酶(AAC)、磷酸轉(zhuǎn)化酶

(APH)和腺苷酸轉(zhuǎn)化酶(ANT)。人們一直認(rèn)為耐藥菌株產(chǎn)生的氨基糖苷類(lèi)修飾酶是主要的耐藥機(jī)制，但臨床分離致病菌株16SrRNA甲基化酶的發(fā)現(xiàn)改變了人們的觀(guān)點(diǎn)。此酶可由質(zhì)粒介導(dǎo)進(jìn)行垂直和或水平播散，使細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素產(chǎn)生多藥交叉耐藥及高水平耐藥，給臨床醫(yī)生治療革蘭氏陰性桿菌感染帶來(lái)更加嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。第35頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五抗生素作用的靶位點(diǎn)發(fā)生突變細(xì)菌通過(guò)對(duì)特定位點(diǎn)的突變，改變了與抗菌藥物結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，或產(chǎn)生了新的不能與抗生素結(jié)合的替代物質(zhì)，或產(chǎn)生了保護(hù)性的物質(zhì)阻止了抗生素的結(jié)合而逃避抗生素的作用。鏈霉素結(jié)合部位是30S亞基上的SI2蛋白,若SI2蛋白的構(gòu)型改變,使鏈霉素不能與其結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性；紅霉素靶部位是50S亞基的L4或L12蛋白,當(dāng)染色體上的ery基因突變,使L4或L12蛋白構(gòu)型改變,便會(huì)出現(xiàn)對(duì)紅霉素的耐藥性；利福平作用點(diǎn)是RNA聚合酶的β基因,當(dāng)其突變時(shí),就產(chǎn)生了耐藥性；青霉素靶部位是細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白(PBPs),PBPs具有酶活性,參與細(xì)胞壁的合成,是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的作用靶位,細(xì)菌改變了PBPs的結(jié)構(gòu),可導(dǎo)致耐藥性；喹諾酮類(lèi)藥物靶部位是DNA旋轉(zhuǎn)酶,當(dāng)基因突變引起酶結(jié)構(gòu)的改變,阻止喹諾酮類(lèi)藥物進(jìn)入靶位,可造成喹諾酮類(lèi)所有藥物的交叉耐藥。第36頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五外膜通透性改變一些具有高滲透性外膜、對(duì)抗菌藥物原來(lái)敏感的細(xì)菌,可以通過(guò)降低外膜的滲透性而出現(xiàn)耐藥性。如原來(lái)允許某種抗菌藥物通過(guò)的孔蛋白通道由于細(xì)菌發(fā)生突變而使該孔蛋白通道關(guān)閉或消失，細(xì)菌就會(huì)對(duì)該抗菌藥物產(chǎn)生很高的耐藥性。此種耐藥機(jī)制往往對(duì)抗菌藥物特異性較差，具有多重耐藥性，銅綠假單胞菌的外膜對(duì)多種抗菌藥物如β內(nèi)酰胺類(lèi)、酶抑制劑、四環(huán)素、氯霉素和喹諾酮類(lèi)的通透性極低，而導(dǎo)致先天耐藥。第37頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五主動(dòng)外排作用

主動(dòng)外排作用是微生物對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要機(jī)制，源于20世紀(jì)80年代關(guān)于大腸埃希菌對(duì)四環(huán)素耐藥機(jī)制的研究,它是由藥物外輸泵來(lái)完成的。藥物外輸泵是一類(lèi)位于細(xì)胞膜上的具有特殊結(jié)構(gòu)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，其作用機(jī)理為當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度聚集達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，藥物外輸泵系統(tǒng)相關(guān)mRNA的表達(dá)增加，結(jié)果使細(xì)胞膜上外輸泵的數(shù)量增加,使細(xì)胞內(nèi)的藥物被泵出。外排系統(tǒng)廣泛存在于G+

菌、G-菌、真菌及哺乳類(lèi)細(xì)胞(如癌細(xì)胞)中,其與細(xì)菌外膜通透性改變?cè)诙嘀啬退幹衅鹬匾饔?愈來(lái)愈受到研究者重視。第38頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌生物膜的作用細(xì)菌生物膜(BF)是指細(xì)菌吸附于生物材料或機(jī)體腔道表面,分泌多糖蛋白復(fù)合物,并將自身包繞其中形成的膜樣物質(zhì)。細(xì)菌在BF的保護(hù)下可逃避抗菌藥物的殺傷作用和免疫細(xì)胞的吞噬作用。與浮游菌比較,BF細(xì)菌對(duì)抗生素的抗藥性可提高10～1000倍,其主要取決于BF多細(xì)胞結(jié)構(gòu):①BF中的胞外多糖起屏障作用,限制抗生素分子向細(xì)菌運(yùn)輸;②BF中微環(huán)境的不同可影響抗生素的活性;③BF細(xì)菌表面生長(zhǎng)可誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)出與浮游細(xì)菌不同的基因,誘導(dǎo)產(chǎn)生BF特異性表型;④多菌種BF中各菌種的協(xié)同作用。具有生物膜的細(xì)菌多見(jiàn)于銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、變異鏈球菌。第39頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的耐藥性

轉(zhuǎn)座子(Tn)是一種比質(zhì)粒更小的DNA片段,它能夠隨意地插入或躍出其他DNA分子中,通常借助細(xì)菌的染色體、噬菌體或質(zhì)粒得以復(fù)制并插入到新的位點(diǎn),或?qū)⒆陨韽脑稽c(diǎn)剪切掉再插入到新的位點(diǎn),從而使宿主細(xì)胞失去對(duì)抗菌藥物的敏感性。在細(xì)菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥性機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)VanA基因存在于Tn1546中,這一轉(zhuǎn)座子含有9個(gè)基因,其中有2個(gè)編碼萬(wàn)古霉素耐藥基因的“VanA基因簇”。Tn還可以使位于染色體上和非接合質(zhì)粒上的基因轉(zhuǎn)移到接合質(zhì)粒中,實(shí)現(xiàn)細(xì)菌間的基因轉(zhuǎn)移或交換。此外,耐藥基因的轉(zhuǎn)移和傳播也可以通過(guò)轉(zhuǎn)座子、整合子和質(zhì)粒等可移動(dòng)的遺傳元件介導(dǎo)。第40頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌整合子系統(tǒng)

整合子(integron)是近年來(lái)發(fā)的新的可移動(dòng)基因元件,是捕獲外源基因并使之轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄曰虻谋磉_(dá)單位。整合子的基本結(jié)構(gòu)由1個(gè)編碼整合酶的基因、2個(gè)基因重組位點(diǎn)、啟動(dòng)子和耐藥基因盒組成?；蚝惺菃我坏目梢苿?dòng)的DNA分子,是由一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF基因)和一個(gè)反向不完全重復(fù)序列即59-堿基(59-be)單元組成,59-be是整合酶的識(shí)別位點(diǎn)。只有當(dāng)基因盒被整合子捕獲并整合到整合子中才能轉(zhuǎn)錄,一個(gè)整合子可以捕獲一個(gè)或多個(gè)基因盒。第41頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五主要內(nèi)容細(xì)菌與人類(lèi)關(guān)系抗菌藥物應(yīng)用細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生細(xì)菌耐藥的檢測(cè)第42頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五耐藥檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)針對(duì)每種細(xì)菌CLSI會(huì)提供質(zhì)控參考菌株的MIC，檢測(cè)的藥物種類(lèi)，敏感、中介和耐藥的濃度第43頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五瓊脂稀釋法(MIC法)

瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH瓊脂中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。第44頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五紙片擴(kuò)散法

紙片擴(kuò)散法又稱(chēng)瓊脂擴(kuò)散法，將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對(duì)數(shù)減少，從而在紙片的周?chē)纬蓾舛忍荻取＜埰車(chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)的菌株不能生長(zhǎng)，而抑菌范圍外的菌株則可以生長(zhǎng)，從而在紙片的周?chē)纬赏该鞯囊志?，不同藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴(kuò)散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測(cè)試菌對(duì)藥物的敏感程度，并與該藥物對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。第45頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五Etest試驗(yàn)

金標(biāo)準(zhǔn)的藥敏方法,它的特點(diǎn)是結(jié)合瓊脂擴(kuò)散法和稀釋法的優(yōu)點(diǎn),濃度呈連續(xù)梯度的抗菌藥物從塑料試條向瓊脂中擴(kuò)散，在試條周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)受試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成透明的抑菌圈。是用擴(kuò)散法的原理,塑料條的形式定量讀出MIC值。這比傳統(tǒng)的紙片擴(kuò)散法測(cè)抑菌圈的大小精確可靠。第46頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五自動(dòng)分析儀

自動(dòng)分析儀器待鑒定細(xì)菌藥敏卡第47頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五ESBLs檢測(cè)紙片確認(rèn)試驗(yàn)：CLSI標(biāo)準(zhǔn)，CAZ/CLA，CTX/CLA兩組藥敏紙片確認(rèn)，結(jié)果抑菌環(huán)直徑差值>5mm。E-test法：一端是CAZ(0.5-32ug/ml),另一端是CAZ(0.125-8ug/ml)/CLA(4ug/ml),CAZ與CAZ/CLA的MIC比值>4。第48頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五PCR方法檢測(cè)耐藥基因

單重PCR：細(xì)菌耐藥性的靈敏性和特異性明顯高于傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)。最大不足之處在于檢測(cè)的指標(biāo)過(guò)于單一。多重PCR方法檢測(cè)耐藥基因：多重PCR可以實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)耐藥基因的檢測(cè)。第49頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五基因芯片在耐藥基因檢測(cè)

DNA芯片與多重PCR結(jié)合,可用于多種耐藥基因的檢測(cè)。臨床革蘭氏陰性細(xì)菌,尤其腸桿菌科細(xì)菌中,由于超廣譜β-內(nèi)酰胺酶以及頭孢菌素酶的流行,導(dǎo)致致病菌對(duì)主要的一線(xiàn)常用藥β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素高度耐藥。因此對(duì)介導(dǎo)這些耐藥的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè),有很大的臨床意義。第50頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五基因測(cè)序

Sanger法因?yàn)榧群?jiǎn)便又快速，并經(jīng)過(guò)后續(xù)的不斷改良，成為了迄今為止DNA測(cè)序的主流。第二代測(cè)序技術(shù)是費(fèi)用更低、通量更高、速度更快的測(cè)序技術(shù)，應(yīng)運(yùn)而生，二代測(cè)序的基本原理是邊合成邊測(cè)序。第51頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五MRSA紙片擴(kuò)散法:苯唑西林在貯存過(guò)程中藥效不易降低，且對(duì)不均一耐藥性檢測(cè)效果更好，所以國(guó)內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都采用苯唑西林，苯唑西林含量為1μg/片，抑菌圈≤10mm為耐藥，≥13mm為敏感，11～12mm為中介。瓊脂稀釋(MIC)法:

MIC<2μg/ml為敏感，>4μg/ml為耐藥。濃度梯度(Etest)法瓊脂篩選法:即MH培養(yǎng)基加NaCl(40g/L)加苯唑西林(6μg/ml)，將菌液點(diǎn)種或畫(huà)線(xiàn)孵育24h，只要平皿有菌生長(zhǎng)，即使一個(gè)菌落也是MRSA，該法敏感度為100%。PCR技術(shù):金黃色葡萄球菌耐苯唑西林的耐藥水平與mecA基因有較好的相關(guān)性。第52頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五近3年我院血培養(yǎng)G-細(xì)菌情況革蘭陰性細(xì)菌名稱(chēng)株數(shù)（株）構(gòu)成比（%）大腸埃希菌13954.3肺炎克雷伯菌3814.84銅綠假單胞菌249.38鮑曼不動(dòng)桿菌145.47陰溝腸桿菌114.3嗜麥芽食單胞菌51.95傷寒沙門(mén)氏菌51.95其他革蘭陰性細(xì)菌207.81總計(jì)256100第53頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五近3年我院血培養(yǎng)G-菌耐藥率抗菌藥物大腸埃希菌（n=139）肺炎克雷伯菌（n=38）銅綠假單胞菌（n=24）鮑曼不動(dòng)桿菌（n=14）陰溝腸桿菌（n=11）阿米卡星15.1%（21）21.1%（8）58.3%（14）64.3%（9）36.4%（4）氨芐青霉素87.1%（121）100%（38）91.7%（22）100%（14）—氨芐青霉素/舒巴坦67.6%（94）89.5%（34）83.3%（20）100%（14）—氨曲南57.6%（80）73.7%（28）79.2%（19）85.7%（12）63.6%（7）頭孢唑啉97.1%（135）100%（38）100%（24）100%（14）100%（11）頭孢曲松61.2%（85）73.7%（28）83.3%（20）85.7%（12）90.9%（10）頭孢他啶59.7%（83）86.8%（33）58.3%（14）85.7%（12）72.7%（8）環(huán)丙沙星71.9%（100）86.8%（33）87.5%（21）100%（14）90.9%（10）頭孢吡肟20.1%（28）31.6%（12）—85.7%（12）63.6%（7）頭孢呋辛74.1%（103）78.9%（30）—92.9%（13）81.8%（9）第54頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五近3年我院血培養(yǎng)G-菌耐藥率抗菌藥物大腸埃希菌（n=139）肺炎克雷伯菌（n=38）銅綠假單胞菌（n=24）鮑曼不動(dòng)桿菌（n=14）陰溝腸桿菌（n=11）磷霉素31.7%（44）42.1%（16）——18.2%（2）慶大霉素75.5%（105）84.2%（32）—85.7%（12）63.6%（7）亞胺培南4.3%（6）5.3%（2）8.3%（2）42.9%（6）0%（0）左氧氟沙星77.7%（108）92.1%（35）95.8%（23）—90.9%（10）美羅培南4.3%（6）5.3%（2）—42.9%（6）0%（0）頭孢哌酮/舒巴坦6.5%（9）13.2%（5）—50.0%（7）45.5%（5）復(fù)方新諾明86.3%（120）97.8%（37）——81.8%（9）替加環(huán)素0%（0）0%（0）—7.1%（1）0%（0）妥布霉素36.0%（50）55.3%（21）50.0%（12）71.4%（10）45.5%（5）哌拉西林/他唑巴坦11.5%（16）28.9%（11）41.7%（10）64.3%（9）—第55頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五近3年我院血培養(yǎng)G+性細(xì)菌情況細(xì)菌種類(lèi)細(xì)菌名稱(chēng)株數(shù)（株）構(gòu)成比（%）革蘭陽(yáng)性細(xì)菌35155.28表皮葡萄球菌10416.38金黃色葡萄球菌7611.97人葡萄球菌人亞種538.36草綠色溶血性鏈球菌385.98溶血性葡萄球菌314.88腸球菌屬182.83革蘭陽(yáng)性桿菌60.94其他革蘭陽(yáng)性細(xì)菌253.94第56頁(yè)，共63頁(yè)，2023年，2月20日，星期五近3年我院血培養(yǎng)G+菌耐藥率抗菌藥物表皮葡萄球菌（n=104）金黃色葡萄球菌（n=76）人葡萄球菌人亞種（n=53）草綠色溶血鏈球菌（n=38）溶血性葡萄球菌（n=18）氨芐青霉素66.3%（69）56.6%（43）49.1%（26）—55.6%（10）阿莫西林/棒酸62.5%（65）68.4%（52）60.4%（32）—38.9%（7）頭孢曲松31.7%（33）40.8%（31）26.4%（14）18.4%（7）22.2%（4）克林霉素50.0%（52）58.0%（44）47.2%（25）50.0%（19）27.8%（5）環(huán)丙沙星37.5%（39）52.6%（40）34.0%（18）—38.9%（7）紅霉素56.7%（59）53.9%（41）49.1%（26）55.3%（21）72.2%（13）慶大霉素62.5%（65）60.5%（46）54.7%（29）—61.1%（11）左氧氟沙星44.2%（46）48.7%（37）56.7%（30）—44.4%（8）利奈唑胺0%（0）0%（0）0%（0）—0%