茶樹中耐咖啡因真菌分離及其耐受機(jī)制研究

文獻(xiàn)綜述1.1咖啡因概述1.1.1咖啡因的來(lái)源與消耗咖啡因的英文名Caffeine分別由是由德語(yǔ)Kaffe和法語(yǔ)cafe兩個(gè)詞組成的單詞。早在1891年德國(guó)化學(xué)家FriedrichFerdinand分離出純咖啡因之前，人們就已經(jīng)開始以食物和飲料的形式食用咖啡因了[1]?？Х纫?caffeine)的化學(xué)名稱為1，3，7-三甲基黃嘌呤或1，3，7-三甲基-1H-嘌呤-2，6-二酮-水合物，分子式為C8H10N4O2，分子量為212.21，熔點(diǎn)為235℃-238℃，180℃大量升華成針狀結(jié)晶。結(jié)晶性白色粉末，味道微苦?？Х纫蚰苋苡谒?、易溶于80℃以上的熱水，甲醇、丙酮、氯仿、吡啶、乙酸乙酯和四氫呋喃，較難溶于乙醚、苯[2]，在272-274nm處有最大紫外吸收峰[3]?？Х纫蜃鳛橐环N植物生物堿，存在于許多植物種類的葉子和果實(shí)中[2]，在這些植物中它起著天然殺蟲劑的作用，殺死或麻痹以它們?yōu)槭车睦ハx[4]。在這些含咖啡因的植物中，大多數(shù)研究都是針對(duì)咖啡屬和山茶花屬的植物進(jìn)行的[5-6]?？Х纫?、可可堿、茶葉堿等生物堿主要來(lái)自植物可可和茶。其他不常見(jiàn)來(lái)源包括瓜拉那、巴拉圭茶冬青等，可用于含咖啡因的飲料(可樂(lè)飲料)中咖啡因的材料來(lái)源。但是，這些植物中的咖啡因含量通常是不同的。例如瓜拉那種子中的咖啡因主要存在于果皮(1.6%)和葉片(4.3%)中；茶樹中含有2-5%的咖啡因，鮮嫩茶葉比老茶葉中的含量高，夏季茶比春季茶含量高。根據(jù)干重，在瓜拉那大約含有咖啡因4-7%。可可豆大約含有0.03%的咖啡因，可可堅(jiān)果為1.5%，咖啡豆為1.1-2.2%[7-10]。人類攝入咖啡因的途徑主要包括每天攝入含咖啡因的食物和飲料（例如巧克力，咖啡，可可，茶，乳制甜點(diǎn)，軟飲料），并且咖啡因廣泛用作大量處方藥或非處方藥（例如感冒藥）的成分，據(jù)報(bào)道，現(xiàn)在全世界每年的咖啡因消費(fèi)量為12萬(wàn)噸，使其成為世界上最普遍的精神活性物質(zhì)[11-12]。據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界人均咖啡因消費(fèi)量約為70毫克/天，其中，約90%的成年人已形成規(guī)律消費(fèi)習(xí)慣，日均攝入約227毫克[13]。因此，它已被公認(rèn)為是自然環(huán)境中最普遍存在的藥物活性化合物（PhAC）之一[14-15]。2018年，世界糧農(nóng)組織預(yù)測(cè)：2027年世界紅茶產(chǎn)量能達(dá)440萬(wàn)噸，綠茶產(chǎn)量達(dá)到330萬(wàn)噸。茶葉產(chǎn)量預(yù)期比2015-2017年翻了一番。土耳其人均茶葉消費(fèi)量是世界第一，約為3.16公斤，緊隨其后的是愛(ài)爾蘭(2.19公斤)和英國(guó)(1.94公斤)。而中國(guó)人均年消費(fèi)量為0.56公斤，尚有較大市場(chǎng)潛力。這一系列結(jié)果表明每人每天平均攝入咖啡因量將增加近一倍。1.1.2咖啡因的功能咖啡因具有刺激中樞神經(jīng)，提高反應(yīng)靈敏性，增強(qiáng)心臟循環(huán)，改善循環(huán)功能，緊致肌膚，利尿消腫，抗癌抗病毒等生理和健康作用[22]它是重要的天然生物堿，具有藥理活性成分[23]。ShiX等人[24]發(fā)現(xiàn)，咖啡因可以有效地去除羥基自由基；劉立軍等[25]研究人員實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，咖啡因?qū)δ[瘤的各個(gè)階段具有不同程度的抑制作用。此外，咖啡因還對(duì)一些腸道微生物（大腸桿菌），肺炎，霍亂和痢疾細(xì)菌有相應(yīng)的抑制作用；作為減肥產(chǎn)品中麻黃堿的替代品[26]。根據(jù)Rose[32]和其他研究報(bào)告，經(jīng)常攝入咖啡因還可以預(yù)防帕金森氏病，減少記憶力喪失和預(yù)防老年癡呆癥。另外，咖啡因還具有外部刺激作用，可用于增強(qiáng)骨骼肌體外收縮力和改善神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)的作用，以縮短反應(yīng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)時(shí)間，從而提高短跑和短距離游泳者的表現(xiàn)[33]?？Х纫蜻€能刺激人體的神經(jīng)系統(tǒng)。小劑量可以消除疲勞并刺激神經(jīng)，改善思維活動(dòng)，并增強(qiáng)對(duì)外界的敏感性。如果大劑量長(zhǎng)期使用它不僅會(huì)導(dǎo)致對(duì)人體的成癮，而且還會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生有害影響[27]。過(guò)量攝入咖啡因也會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[28]，抑制DNA修復(fù)，抑制某些酶活性，突變，導(dǎo)致孕期胎兒畸形，可能降低生育力等[29-31]。2015年，研究還證明咖啡因會(huì)引起細(xì)胞不對(duì)稱分裂，但并不會(huì)影響其子代細(xì)胞的染色體分布[34]。1.1.3咖啡因所造成的壞境危害在高濃度下，咖啡因?qū)Νh(huán)境中重要的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中所涉及的腐生微生物具有毒性，導(dǎo)致環(huán)境穩(wěn)定性紊亂[35]。環(huán)境中咖啡因的主要來(lái)源通常有食用咖啡因的排泄殘?jiān)?，已過(guò)期或不需要的含咖啡因的藥物的隨意丟棄，植物殘枝，醫(yī)療垃圾等[36]。而含有咖啡因的食品工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)，使得茶葉廢渣和可可、咖啡豆?jié){果等廢棄物劇增。由于咖啡因難以降解，現(xiàn)已被視為一種環(huán)境污染物。因此，大量含有咖啡因的食品工業(yè)廢料也相繼帶來(lái)了許多環(huán)境污染問(wèn)題。而咖啡因又是一種既具有親水性又具有親脂性的物質(zhì)，當(dāng)被施用于人類或動(dòng)物時(shí)，咖啡因可以分布在所有體液中并穿過(guò)所有生物膜[37]。攝入后，大約1–10%的咖啡因被人體代謝后從尿液中排出。排出的咖啡因隨后會(huì)到達(dá)廢水處理廠（WWTP），然后進(jìn)入水循環(huán)[38]。由于據(jù)報(bào)道環(huán)境中咖啡因的殘留濃度很高，因此咖啡因殘留物對(duì)生態(tài)安全和人類健康的潛在不利影響引起了人們的極大關(guān)注。但是，目前尚無(wú)規(guī)范的方法來(lái)估計(jì)咖啡因?qū)σ吧锏牟焕绊?。在中?guó)市場(chǎng)上，高純度的咖啡因是國(guó)家規(guī)定管制的二類精神藥品，但咖啡因天然的廣泛存在于100多種植物中，如可可、咖啡豆、蘇丹可樂(lè)果中[23]。隨著農(nóng)產(chǎn)品工業(yè)的迅猛發(fā)展，茶葉、可可、咖啡豆種植，加工環(huán)節(jié)產(chǎn)生的廢棄物的數(shù)量也隨之大量增加[39]?？Х纫蜃鳛橐环N工業(yè)廢棄物的污染物，因其溶于水，能在周圍水體中釋放，現(xiàn)已在地下水[41]、地表水[42]中檢測(cè)到咖啡因。作為與人類活動(dòng)密切相關(guān)的新興污染物，環(huán)境中的咖啡因可作為人為污染的指標(biāo)，也是地表水中廢水的特定來(lái)源指標(biāo)[15,36,43]。因此，在廢水樣品中觀察到了咖啡因殘留物的較高濃度和檢測(cè)頻率。例如，在新加坡，廢水中咖啡因的最高濃度高達(dá)3594μg/L[44]。有研究表明，一些水生生物在含有咖啡因的水體中會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育異常[45]。此外，高濃度的咖啡因?qū)Ω锞哂卸竞ψ饔肹46]，還對(duì)許多昆蟲[47]、草本植物[48]具有生長(zhǎng)抑制作用。甚至，咖啡因還會(huì)降低土壤肥力，抑制種子幼苗的萌發(fā)與生長(zhǎng)[49]。因此，消除食品工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境中的咖啡因污染，對(duì)促進(jìn)人類健康和社會(huì)效益的提高具有重大意義[50]。脫咖啡因技術(shù)，已成為當(dāng)今乃至未來(lái)食品加工與環(huán)境研究領(lǐng)域中一個(gè)不容忽視且亟待解決的重要課題。圖1-SEQ圖1-\*ARABIC1咖啡因的主要來(lái)源，污染和危害Fig.1-1Themainsources,pollutionandharmofcaffeine1.1.4脫咖啡因技術(shù)迄今為止，國(guó)內(nèi)外科研工作者對(duì)脫咖啡因技術(shù)進(jìn)行了很多的研究，其中因很多人喜茶卻不耐受咖啡因，故大多數(shù)研究集中于茶產(chǎn)業(yè)的脫咖啡因技術(shù)[51]。迄今為止，咖啡因脫除技術(shù)主要包括物理化學(xué)吸附分離法、溶劑萃取法、超臨界二氧化碳萃取法以及新興的微生物酶降解法等[52]。這些方法各有利弊，適用范圍不同：咖啡因可溶于某些有機(jī)溶劑，通過(guò)溶劑萃取法使用二氯甲烷和氯仿去除咖啡因[53]。該方法簡(jiǎn)單且去除效率高，但所用溶劑有毒且易于殘留。后續(xù)處理不當(dāng)會(huì)嚴(yán)重的環(huán)境污染，因此該法已在生產(chǎn)中逐步取消。利用材料特性的差異通過(guò)物理化學(xué)吸附分離法開發(fā)的脫咖啡因技術(shù)[54]具有去除選擇性好，效率高的特點(diǎn)，但樹脂價(jià)格高，使用壽命不長(zhǎng)，能耗高，在大型食品工業(yè)脫咖啡因生產(chǎn)中不適用。新興的超臨界CO2提取方法可以高選擇性地提取咖啡因，無(wú)毒，安全，工藝簡(jiǎn)單。但是，這種技術(shù)設(shè)備需要大量投資和較高的運(yùn)行成本[54]，也不適用于食品工業(yè)脫咖啡因以及廢棄物咖啡因的處理。微生物酶降解法是通過(guò)耐較高濃度咖啡因的微生物產(chǎn)生的特異性酶來(lái)降解咖啡因的方法。上個(gè)世紀(jì)70年代，研究表明：咖啡因?qū)ξ⑸镉卸尽?970年代初，首次報(bào)道了咖啡因的微生物降解[55]?？Х纫蛟谖⑸锛?xì)胞中降解的相關(guān)酶學(xué)和生物化學(xué)已經(jīng)得到了很好的研究[21]。室內(nèi)培養(yǎng)基培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)咖啡因濃度高于0.0025g/mL時(shí)，它可以抑制許多細(xì)菌的生長(zhǎng)[56]。當(dāng)將含咖啡因的介質(zhì)添加到抗菌劑（如氯霉素）中時(shí)，觀察到一定的協(xié)同作用。從那以后，關(guān)于利用咖啡因的微生物的生長(zhǎng)的研究取得了進(jìn)展[55-58]。微生物降解法是一種新興的脫咖啡因技術(shù)。該技術(shù)優(yōu)勢(shì)為：條件溫和、設(shè)備簡(jiǎn)單、選擇性好，因而具有良好的開發(fā)潛力和市場(chǎng)前景[59-60]。研究者試圖利用咖啡漿作為動(dòng)物飼料來(lái)源已經(jīng)從經(jīng)濟(jì)的角度做到了環(huán)境的角度。因此，去除抗?fàn)I養(yǎng)成分，如咖啡因，成為必不可少的工序[61]。而微生物脫咖啡因的技術(shù)相比較于物理和化學(xué)技術(shù)更溫和，更簡(jiǎn)單，也更清潔。Mazzafera(2002)和Hakil(1999)等人分離出了相當(dāng)數(shù)量的細(xì)菌，這些細(xì)菌能夠利用咖啡因作為碳和氮的唯一來(lái)源，這些細(xì)菌可能是生物脫咖啡因的目標(biāo)[19,62]?？Х纫蚪到馔緩街挟a(chǎn)生的黃嘌呤類生物堿，同咖啡因一樣，有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有功效用途。因此，微生物對(duì)咖啡因的降解不僅成為克服環(huán)境問(wèn)題的重要手段，而且可以作為其他重要商業(yè)產(chǎn)品[61]的回收方法。正因?yàn)槿绱?，微生物脫咖啡因在一般環(huán)境和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義[63]。近年來(lái)，許多關(guān)于微生物對(duì)咖啡因生物降解的研究報(bào)道表明，生物轉(zhuǎn)化咖啡因已成為一項(xiàng)全球性的議程[29]。1.2咖啡因與微生物的關(guān)系1.2.1耐咖啡因的微生物早在上世界60年代，C.V.SundarRaj等科研工作者就發(fā)現(xiàn)咖啡因具有抑菌作用。近年來(lái)的研究中，許多科研工作者針對(duì)咖啡因抑菌及其效果進(jìn)行了詳細(xì)研究。2004年，嚴(yán)贊開等人[64]結(jié)果表明：7種不同濃度的咖啡因（0.07%，0.09%，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%）對(duì)五種被測(cè)細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、漢遜式酵母、青霉菌）的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，其最佳抑菌濃度為0.3%-0.7%。PH值和溫度也影響咖啡因?qū)?xì)菌的抑制作用。2006年，Almeida等研究表明，沙雷氏菌會(huì)被咖啡因抑制生長(zhǎng)[65]。2007年的研究表明，咖啡因可抑制黑曲霉菌絲的放射狀生長(zhǎng)，菌絲的產(chǎn)生和分生孢子的萌發(fā)。隨著咖啡因濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)[66]。2010年，戚麗和張華艷等發(fā)現(xiàn)，咖啡因的濃度為10mg/mL時(shí)，對(duì)茶樹常見(jiàn)的病原菌（茶樹云紋葉枯病、輪斑病、赤葉斑病和炭疽病）具有顯著的抑菌作用，證明咖啡因在體外具有很強(qiáng)的抗菌作用[67]。2013年，Kim等人研究發(fā)現(xiàn)綠茶提取物中的咖啡因可以抑制白色念珠菌[68]。咖啡因?qū)λ箍凭纳L(zhǎng)具有很強(qiáng)的抑制作用，濃度為0.2％時(shí)，生長(zhǎng)完全抑制[69]，它也對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌，腸桿菌科和匍枝根霉的生長(zhǎng)具有抑制作用[70-71]。國(guó)內(nèi)外研究表明，咖啡因?qū)σ恍┪⑸锏拇_具有生長(zhǎng)抑制，因而具有抗菌作用。此外，咖啡因還不同程度地抑制口腔微生物的生長(zhǎng)[72]。此外，研究表明，咖啡因的抑菌作用與其濃度呈正相關(guān)，低濃度咖啡因僅能短期抑菌，而高濃度咖啡因能強(qiáng)而持久的抑菌作用[73]。已知咖啡因在較低的濃度水平下會(huì)對(duì)不同生物產(chǎn)生多種生理作用，最顯著的作用是抑制磷酸二酯酶，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平增加，對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣水平的影響以及腺苷受體的拮抗作用[74]。對(duì)于微生物，低濃度咖啡因也具有抗菌性。添加了咖啡因的情況下，細(xì)菌菌株（如大腸桿菌和其他細(xì)菌菌株）的生長(zhǎng)收到抑制[75]。這可以歸因于對(duì)大腸桿菌的研究發(fā)現(xiàn)，其中咖啡因通過(guò)抑制胸苷激酶抑制了DNA的合成，而胸苷激酶又抑制了胸苷向DNA的摻入，并損害了RNA[76]?？Х纫蚩稍鰪?qiáng)某些抗菌劑（如青霉素，四環(huán)素）對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用[77]和呋喃唑酮對(duì)弧菌的抑制作用[78]。Sundarraj和Dhala[79]研究了咖啡因和其他相關(guān)甲基黃嘌呤對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高濃度咖啡因具有殺菌作用，而較低濃度下則具有抑菌作用。注意到咖啡因影響大腸桿菌的吲哚合成和乳糖發(fā)酵，其作用只是暫時(shí)的。濃度為1g/L的咖啡因?qū)θ魏螠y(cè)試生物均無(wú)影響。因此，可以假設(shè)降解咖啡因的細(xì)菌菌株具有耐受高濃度咖啡因的能力，這是由于專門的蛋白質(zhì)和大分子可以防止咖啡因引起的細(xì)胞損傷。一般耐咖啡因微生物能利用咖啡因作為碳源或氮源，甚至某些微生物能以咖啡因作為唯一碳源和氮源。研究表明，在富含咖啡因的環(huán)境中，有些微生物可改變自身信號(hào)通路，合成新物質(zhì)[29]，或直接分解利用咖啡因[80]，也可通過(guò)間接途徑提高自身對(duì)環(huán)境的耐受力[81]。1.2.2微生物降解咖啡因的途徑綜合前人研究，細(xì)菌降解咖啡因的主要途徑是N-去甲基化途徑，且該途徑已經(jīng)比較清晰，如圖1-2所示[7]。咖啡因N-去甲基化每脫一個(gè)甲基需消耗一個(gè)氧分子，并生成一分子甲醛，先生成黃嘌呤，后生成其它的含氮化合物[82]。N-去甲基化途徑可歸結(jié)為：咖啡因→可可堿(副黃嘌呤)→7-甲基黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸→尿囊素→尿囊酸→尿素[62]。植物和真菌咖啡因降解過(guò)程中的主要中間物質(zhì)為茶葉堿，但在細(xì)菌降解咖啡因的過(guò)程中卻很少檢測(cè)到，或者含量非常低[83-84]。然而，Chi等發(fā)現(xiàn)，假單胞CBB5細(xì)菌具有高降解咖啡因能力，能利用茶堿作為底物，茶堿除通過(guò)脫甲基化途徑，還可以通過(guò)C-8氧化途徑降解茶葉堿生成了1，3-二甲基尿酸，后生成1-甲基尿酸或3-甲基尿酸[55]。研究還顯示，細(xì)菌也可能同時(shí)利用脫甲基和氧化兩種途徑利用可可堿和副黃嘌呤，但生成的甲基尿酸并未繼續(xù)代謝[62]。這表明，有時(shí)候細(xì)菌可能同時(shí)采用N-去甲基化途徑和C-8氧化途徑這兩種途徑來(lái)利用黃嘌呤類物質(zhì)。植物體內(nèi)的老葉是咖啡因的分解代謝主要場(chǎng)所，其分解后生成的尿酸、尿囊素可作為儲(chǔ)備物質(zhì)留在植物體內(nèi)。人和動(dòng)物體內(nèi)分解尿酸的能力較低，常以尿酸為最終產(chǎn)物。人體代謝咖啡因自然和植物有所不同。由于人體內(nèi)缺乏分解尿酸的能力，咖啡因在人體內(nèi)除脫去部分甲基外，就被氧化成尿酸，因此大部分是以甲基尿酸或尿酸的形式排出體外，而不再體內(nèi)積累，所以不會(huì)對(duì)人體造成危害[3]。細(xì)菌降解咖啡因的輔助途徑是C-8氧化途徑。研究發(fā)現(xiàn)，紅球菌屬和克雷伯氏菌的混合培養(yǎng)物可以將咖啡因直接氧化為1，3，7-三甲基尿酸（TMU），而無(wú)需經(jīng)過(guò)N-去甲基化步驟，然后將其降解為3，6，8-三甲基尿囊素（TMA），進(jìn)而產(chǎn)生二甲基脲[85]。同時(shí)，混合細(xì)菌不能使用黃嘌呤類物質(zhì)作為碳源或氮源，這表明混合細(xì)菌不能通過(guò)N-去甲基途徑使用這些生物堿。Osman等研究指出，咖啡因可以導(dǎo)致真菌或細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。這是關(guān)于咖啡因抑制真菌生長(zhǎng)的機(jī)制的首次報(bào)道[86]。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，曲霉屬真菌中的咖啡因分解途徑為：首先將咖啡因降解為茶葉堿，然后降解為3-甲基黃嘌呤[87]。綜上所述，目前咖啡因降解的機(jī)理主要是N-去甲基化途徑，氧化途徑以及兩者交叉。但是，真菌如何分解咖啡因的機(jī)制尚不清楚。此外，其他代謝產(chǎn)物還有待研究。圖1-SEQ圖1-\*ARABIC2咖啡因在細(xì)菌（假單胞菌）中的代謝Fig.1-2Caffeinemetabolismproposedinbacteria(Pseudomonasputida).Possibleenzymes:(1)7N-demethylase;(2)1N-demethylase;(3)3N-demethylase,and(4)caffeinedehydrogenase,caffeineoxidaseorrelatedenzymes.1.2.3真菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白三磷酸腺苷結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是最大的蛋白家族之一。從細(xì)菌到人類，所有的生物中都有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[88]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要位于線粒體、過(guò)氧化物酶體、液泡和質(zhì)膜上[89]，通過(guò)利用水解ATP激活底物穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)行物質(zhì)跨膜運(yùn)輸。其運(yùn)輸?shù)牡孜锇ò被?、多肽類、無(wú)機(jī)離子、代謝物、糖類、抗癌藥物、真菌毒素、抗生素、維他命、脂肪酸衍生物、激素、有機(jī)離子和磷脂等。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為輸出蛋白和輸入蛋白。原核生物中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白既可以作為輸出蛋白也可作為輸入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)底物。真核生物中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最初被認(rèn)為只是輸出蛋白，但部分研究顯示，包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的真核生物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，還能夠作為輸入蛋白，將底物從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)[90]。隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)表達(dá)具有“解毒”功能的基因是提高植物對(duì)真菌毒素耐受性的可行策略之一。植物中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在有毒物質(zhì)解毒過(guò)程中扮演著重要角色。該類蛋白可將有毒物質(zhì)與谷胱甘肽結(jié)合形成的軛合物轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中儲(chǔ)存或降解降低有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的傷害。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與生物體內(nèi)諸多生理過(guò)程，在次級(jí)代謝物積累、細(xì)菌耐藥性、生物脅迫和非生物脅迫及腫瘤細(xì)胞抗藥性中發(fā)揮著十分重要的作用。在真菌毒素產(chǎn)生與耐受方面，Seunghoon等人發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum）的ZRA1與真菌毒素玉米烯酮（ZEA）產(chǎn)生相關(guān)。在該研究中，對(duì)添加或不添加ZEA的野生型菌株和不產(chǎn)生ZEA的菌株—zeb2進(jìn)行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)zeb2中有3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因下調(diào)，轉(zhuǎn)運(yùn)啟動(dòng)子ZEB2活性也下降。但是，在添加ZEA的野生型菌株中，ZRA1表達(dá)顯著上調(diào)，敲除該基因后，ZEA產(chǎn)量降低。而敲除另外兩個(gè)基因后，ZEA產(chǎn)量卻與野生型菌株相似。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ZRA1為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，此研究說(shuō)明禾谷鐮刀菌的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZRA1與真菌毒素ZEA產(chǎn)生有關(guān)[91]。Margaret的研究指出，尾孢菌（Cercosporanicotianae）中ATR1編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與尾孢素的產(chǎn)生相關(guān)。敲除ATR1后，固體及液體培養(yǎng)基中的尾孢素產(chǎn)量分別下降25%和20%。同時(shí)，突變菌株對(duì)尾孢素變得更為敏感。在突變體中回復(fù)表達(dá)ATR1后，恢復(fù)了尾孢素的合成和對(duì)尾孢素的耐受性[92]。另外，前人研究發(fā)現(xiàn)，人類肺癌細(xì)胞中的MRP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白即能轉(zhuǎn)運(yùn)黃曲霉毒素AFB1環(huán)氧化物，也能直接轉(zhuǎn)運(yùn)AFB1或在GSH作用下提高M(jìn)RP轉(zhuǎn)運(yùn)AFB1的效率[93]。1.3真菌降解咖啡因的研究進(jìn)展微生物可降解咖啡因，但代謝途徑有所不同?？山到饪Х纫虻奈⑸镅芯孔畛醢l(fā)現(xiàn)是真菌，但迄今為止，真菌降解咖啡因的途徑尚不完整，可能原因是中間代謝產(chǎn)物會(huì)迅速被分解成一些新物質(zhì)，以致中間步驟不清晰。此外，真菌降解咖啡因生成的第一個(gè)產(chǎn)物是茶葉堿，說(shuō)明真菌分解咖啡因的第一步可能是N-7去甲基[57]。1998年，Hakil等研究發(fā)現(xiàn)了可以利用咖啡因作為唯一氮源的7株絲狀真菌（主要為曲霉屬和青霉屬）。降解途徑為：咖啡因→茶堿→3-甲基黃嘌呤；可可堿→3-甲基黃嘌呤；副黃嘌呤→1-甲基黃嘌呤/7-甲基黃嘌呤[87]。除此之外，也有研究報(bào)道，真菌中的青霉菌（Penicillium）[94]和烏龍茶中擬青霉菌（Paecilomycesgunnii）[57]能有效將咖啡因N-脫甲基化為茶葉堿和擬黃嘌呤。普洱茶發(fā)酵中分離篩選并鑒定出的曲霉菌（Aspergillussydowii，A.niger）[83]能高效降解咖啡因，其先經(jīng)N-脫甲基反應(yīng)將咖啡因降解成茶葉堿和擬黃嘌呤，再經(jīng)N-脫甲基生成3-甲基黃嘌呤和7-甲基黃嘌呤。研究表明，鐮刀菌屬能利用外源添加的蔗糖作為碳源，將咖啡因脫甲基有效降解為茶葉堿，繼而脫甲基生成3-甲基黃嘌呤。大量研究結(jié)果顯示，醬油曲霉屬（A.tamari）[95]、溜霉屬、團(tuán)青霉[83]等也能有效降解咖啡因。但1-甲基黃嘌呤類物質(zhì)的代謝途徑尚不明晰，因?qū)嶒?yàn)中無(wú)甲基尿酸生成而無(wú)法確定。Gummadi等研究者認(rèn)為，絲狀真菌降解咖啡因的途徑為：脫甲基作用首先形成茶葉堿，然后形成尿酸，最后分解成CO2和NH3途徑，該途徑與植物中有相似之處。但這需要更多的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。圖1-SEQ圖1-\*ARABIC3咖啡因在真菌（絲狀真菌）中的代謝Fig.1-3Caffeinemetabolismproposedinfungus.Possiblepathway:(1)degradationbyA.sydowii,A.niger,P.gunnii,F.solani;(2)dimethylxanthinesbyfilamentousfungi;(3)BiodegradationbyA.sydowii,A.niger2引言2.1研究目的及意義咖啡因主要來(lái)自于茶，可可等雙子葉植物中?，F(xiàn)實(shí)生活中食品和醫(yī)藥行業(yè)生產(chǎn)量大，會(huì)產(chǎn)生含咖啡因的各種廢棄物。而咖啡因由于代謝困難，導(dǎo)致環(huán)境污染嚴(yán)重，已被視為環(huán)境污染物之一。因此，消除食品工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境中的咖啡因污染，已成為當(dāng)今乃至未來(lái)食品加工與環(huán)境研究領(lǐng)域中一個(gè)不容忽視且亟待解決的重要課題。微生物和酶降解法是現(xiàn)階段研究最多的一種的脫咖啡因法。該方法條件設(shè)備簡(jiǎn)單，選擇性好，生產(chǎn)成本低，因而具有良好的開發(fā)潛力和市場(chǎng)前景。研究表明，低濃度的咖啡因具有一定的抑菌作用，但自然界中，些微生物能在高濃度的咖啡因環(huán)境中生存，且能以咖啡因作為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。基于微生物降解咖啡因這一科學(xué)問(wèn)題，結(jié)合大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，已有報(bào)道的篩選出來(lái)的具有咖啡因降解能力的真菌都是來(lái)自非生物性環(huán)境，例如普洱茶渥堆發(fā)酵的真菌、烏龍茶中的曲霉菌、土壤中篩選的假單細(xì)胞桿菌等。本研究首次在生物體上（茶樹葉片）篩選降咖啡因的菌株并對(duì)其降解途徑進(jìn)行探索。因?yàn)椴桴r葉的咖啡因含量可以達(dá)到5-12mg/mL，在一些幼嫩組織中甚至含量更高[1]。一是因?yàn)椴铇淙~片自身就含有咖啡因，其真菌本身就耐咖啡因。二來(lái)，微生物中的真菌，其咖啡因代謝途徑是復(fù)雜而且多樣化的，通過(guò)探究茶葉真菌的耐咖啡因機(jī)制及其相關(guān)酶，為未來(lái)發(fā)掘咖啡因代謝途徑酶的基因信息，脫咖啡因技術(shù)奠定良好的基礎(chǔ)。此外，咖啡因降解途徑中間體（可可堿，擬黃嘌呤，茶葉堿等）也具有一定的價(jià)值和用途。因此，微生物對(duì)咖啡因的降解不僅成為克服環(huán)境問(wèn)題的重要手段，且可以作為其他重要商業(yè)產(chǎn)品[61]的回收方法。正因?yàn)槿绱?，微生物脫咖啡因在一般環(huán)境和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義[63]。近年來(lái)，許多關(guān)于微生物對(duì)咖啡因生物降解的研究報(bào)道表明，生物轉(zhuǎn)化咖啡因已成為一項(xiàng)全球性的議程[29]。因此本實(shí)驗(yàn)從茶樹葉片中篩選耐受咖啡因的真菌，來(lái)探究真菌降解咖啡因及其代謝途徑，為咖啡因這一研究的經(jīng)典和熱點(diǎn)課題添磚加瓦，在微生物降解咖啡因及其工程菌治理方面具有一定的理論和實(shí)際意義，為微生物途徑脫咖啡因新技術(shù)開發(fā)條件，也為未來(lái)解決工業(yè)廢渣中的咖啡因提供優(yōu)勢(shì)工程菌奠定基礎(chǔ)[82]。2.2研究?jī)?nèi)容2.2.1茶樹葉片真菌的分離、鑒定和篩選（1）從合肥、池州、六安霍山的茶園篩選分離真菌（2）形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定（3）茶樹葉片耐咖啡因真菌的篩選2.2.2草酸青霉菌的生物學(xué)特性和降解咖啡因的研究（1）耐咖啡因真菌的分子生物學(xué)鑒定（2）草酸青霉菌培養(yǎng)體系的優(yōu)化及其生長(zhǎng)曲線（3）降解咖啡因的代謝產(chǎn)物檢測(cè)和代謝途徑分析2.2.3耐咖啡因真菌比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析（1）轉(zhuǎn)錄組及材料處理（2）生物信息學(xué)分析（3）ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的熒光定量PCR結(jié)果2.3技術(shù)路線

3材料與方法3.1試驗(yàn)材料3.1.1菌株來(lái)源茶樹真菌2017和2018年是從合肥、霍山、池州各地茶園中的茶樹葉片上分離鑒定的，主要的茶葉品種為：舒茶早，蝸牛早，黃山毛峰，如表3-1所示為實(shí)驗(yàn)菌株清單。菌株主要來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室博士后kuberanThangaraj的前期茶樹真菌的分離工作。表3-SEQ表3-\*ARABIC1供試菌株清單Table3-1.BacteriastrainsusedinthisworkNAMEAREAAlternariaalternateHefeiBotryosphaeriadothideaHefeiAlternariaalternateHefeiColletotrichumgloeosporioidesHefeiFusariumincarnatumChizhouPhomaherbarumChizhouPhyllostictacapitalensisChizhouFusariumconcentricumChizhouArthriniumarundinisLu’anPestalotiopsissp.Lu’anPestalotiopsissp.Lu’anPestalotiopsissp.Lu’anPenioillumsp.Lu’anPenioillumsp.Lu’anAlternariasp.Lu’anAlternariasp.Lu’an3.1.2主要儀器設(shè)備

表3-SEQ表3-\*ARABIC2本實(shí)驗(yàn)所用儀器設(shè)備Table3-2Theinstrumentsandequipmentsusedinthiswork儀器名稱儀器公司恒溫?fù)u床武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限公司HQL150C超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司離心干燥器LNG-T83/Speedvaeconcentrator超菌工作臺(tái)上海市三發(fā)科學(xué)儀器有限公司精密pH計(jì)上海理達(dá)儀器廠PHS-3C型真空干燥箱上海一恒科技有限公司DZF-6020型電熱恒溫水槽上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司DK-8B型低溫冷凍離心機(jī)美國(guó)Beckman公司真菌恒溫培養(yǎng)箱上海市三發(fā)科學(xué)儀器有限公司壓力蒸汽滅菌器上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)尤尼柯UV-2102型液質(zhì)聯(lián)用色譜美國(guó)安捷倫（Angelens）公司超高效液相色譜美國(guó)Waters公司電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司PCR儀Bio-Rad公司、德國(guó)Biometra公司恒溫振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司Darkreader熒光透射儀ClareChemicalResearch公司DYY-6C型電泳儀北京市六一儀器廠超低溫冰箱日本三洋公司核酸定量?jī)xThermo公司凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad公司高速冷凍離心機(jī)Eppendorf公司、Beckman公司電熱恒溫鼓風(fēng)培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司U-5100型分光光度計(jì)HITACHI公司電子天枰METILERTOLEDO公司3.1.3培養(yǎng)基及試劑實(shí)驗(yàn)試劑：SYBRPrimeScriptTMRT-PCRKitII(PerfectRealTime)試劑盒，AgaroseGelDNAPurificationKit試劑盒，pMDIM18-TSimpleVector連接試劑盒，均購(gòu)自大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司；植物總RNA提取試劑盒(DP432)購(gòu)買自天根生化科技(北京)有限公司；咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma試劑公司；色譜級(jí)甲醇購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。培養(yǎng)基的配制：具體請(qǐng)見(jiàn)附錄C.3.2茶樹葉片真菌的分離、鑒定3.2.1茶樹葉片真菌的分離取滅菌干凈的玻璃培養(yǎng)皿若干，并標(biāo)記分離日期和材料。后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作均在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，以防止細(xì)菌污染。第一步，將融化的PDA倒入玻璃培養(yǎng)皿種，以備用；第二步，用滅菌干凈的鑷子，輕輕地從茶樹葉片邊緣取出真菌感染部分，在感染交界處切2-3mm*2mm，將其放在70%酒精中浸潤(rùn)3s左右，再移入0.1%的升汞液中處理3-5min，最后用無(wú)菌水沖洗3次；第三步，用滅菌干凈的鑷子將感染組織3塊呈“品”字形移入培養(yǎng)皿，并輕壓葉片，觀察培養(yǎng)。完成上述操作后，將培養(yǎng)皿倒置，放入25℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，4-5d后，用接種環(huán)在菌落周圍挑取無(wú)雜菌污染的菌絲，在無(wú)菌操作條件下移入斜面培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)1周后觀察病原菌形態(tài)特征，要保存可移入4℃的冰箱中[96]。3.2.2茶樹葉片真菌的鑒定（1）真菌的形態(tài)學(xué)觀察菌株鑒定：根據(jù)《真菌學(xué)鑒定手冊(cè)》，用點(diǎn)接法挑取少量的孢子接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，12h觀察一次，觀察記錄菌落形態(tài)，色澤及其生長(zhǎng)速度[97]。（2）真菌的分子生物學(xué)鑒定真菌DNA的提?。壕唧w操作步驟請(qǐng)見(jiàn)試劑盒。核酸定量?jī)x檢測(cè)DNA質(zhì)量：先吸取1.0-2.0μLDNA樣品，用核酸定量?jī)x測(cè)定A260/A280比值、A260/A230比值及DNA濃度(ng/μL)結(jié)果。再判斷DNA質(zhì)量是否滿足下一步實(shí)驗(yàn)需要。若A260/A280<1.9，則可能是蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)污染;A260/A230<2.0，則可能有糖類、鹽類或有機(jī)試劑污染，這兩種情況需重新純化DNA樣品。通用引物擴(kuò)增rDNA基因簇ITS全序列：測(cè)序?qū)嶒?yàn)的酶購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。采用通用引物ITS1、ITS4，以β-tubulin為內(nèi)參。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成通用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。上游引物為ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，下游引物為ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。后續(xù)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。最后將的PCR產(chǎn)物要進(jìn)行回收純化和序列分析。blast序列比對(duì)：將生工測(cè)序的結(jié)果在http：//的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)判斷真菌種類，若序列比對(duì)結(jié)果不理想，則要進(jìn)一步構(gòu)建真菌系統(tǒng)進(jìn)化樹。3.3茶樹葉片耐咖啡因真菌的篩選3.3.1不同濃度咖啡因篩選真菌運(yùn)用不同濃度咖啡因篩選，經(jīng)過(guò)平板分離篩選。將咖啡因濃度設(shè)定為：0mg/mL，1mg/mL，3mg/mL，5mg/mL，7mg/mL5個(gè)濃度，加入PDA中，微波爐中加熱，振蕩混勻，待冷卻到平板。先挑取少量孢子，再用點(diǎn)接法接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，輕壓孢子使之與培養(yǎng)基接觸，最后置于實(shí)驗(yàn)室的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，28℃倒置培養(yǎng)一周，隔天觀察平板菌落形態(tài)。運(yùn)用不同濃度咖啡因篩選，經(jīng)過(guò)平板分離篩選。將咖啡因濃度設(shè)定為：0mg/mL，1mg/mL，3mg/mL，5mg/mL，7mg/mL5個(gè)濃度，加入PDA中，微波爐中加熱，振蕩混勻，待冷卻到平板。先挑取少量孢子，再用點(diǎn)接法接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，輕壓孢子使之與培養(yǎng)基接觸，最后置于實(shí)驗(yàn)室的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，28℃倒置培養(yǎng)一周，隔天觀察平板菌落形態(tài)。3.3.2UPLC檢測(cè)耐咖啡因真菌的代謝產(chǎn)物(1)培養(yǎng)耐咖啡因的真菌首先選擇能在含5mg/mL咖啡因的PDA培養(yǎng)基上存活的菌株，接著將這些菌株再次接種于含1mg/mL咖啡因的PDB液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后用超高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中的咖啡因的含量及代謝產(chǎn)物。最后將培養(yǎng)一周后發(fā)酵液進(jìn)行制樣，并用超高效液相色譜檢測(cè)。(2)樣品制備在超凈工作臺(tái)，將培養(yǎng)了7d的PDB液體培養(yǎng)基，用滅菌槍頭吸取1mL至5mLdorf試管中，向其加入80%甲醇振蕩混勻，水浴超聲30min，然后4℃低溫超高速離心30min，用一次性針頭吸取，過(guò)有機(jī)相膜，置于液相小瓶中，4℃?zhèn)溆谩?3)超高效液相色譜（UPLC）檢測(cè)流動(dòng)相的優(yōu)化：分別配置60%，70%，75%，80%，85%，90%的甲醇水(V/V)作為檢測(cè)Cf的流動(dòng)相，測(cè)定Cf標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間及峰面積。比較不同比例的流動(dòng)相時(shí)，Cf的出峰時(shí)間快慢、峰型形狀及分離情況。剩余參數(shù)設(shè)置為：Cf濃度25ppm，流速為0.3mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)256nm，進(jìn)樣量為1μL，柱溫為室溫。流速的優(yōu)化：分別設(shè)置為：0.05mL/min，0.1mL/min，0.15mL/min，0.2mL/min，0.25mL/min，0.3mL/min，測(cè)定Cf的出峰時(shí)間及檢測(cè)峰面積。比較不同比例的流動(dòng)相時(shí)，Cf的出峰時(shí)間快慢、峰型形狀及分離情況。波長(zhǎng)的優(yōu)化：分別在256nm、260nm和274nm，這三個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)定Cf的出峰時(shí)間及檢測(cè)峰面積，比較不同比例的流動(dòng)相時(shí)，Cf的出峰時(shí)間快慢、峰型形狀及分離情況。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：在儀器最佳工作條件下，將Cf標(biāo)準(zhǔn)品溶液按濃度從低到高進(jìn)行測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量。取Cf標(biāo)準(zhǔn)品制備液，用甲醇分別稀釋成濃度為100ppm，50ppm，20ppm，10ppm，5ppm，1ppm的梯度標(biāo)準(zhǔn)品，制備樣品，用UPLC檢測(cè)，超高效液相色譜（UPLC）檢測(cè)方法如上所示。表3-SEQ表3-\*ARABIC3超高效液相中咖啡因的檢測(cè)方法Table3-3Methodfordeterminationofcaffeineinultrahighperformanceliquidphase時(shí)間流速（mL/min）%A有機(jī)相%B有機(jī)相曲線初始0.394663.50.392864.50.3901067.50.38218610.50.37426613.50.380206170.39466咖啡因Cf含量的計(jì)算方法：用標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間/保留時(shí)間來(lái)進(jìn)行定性分析，從而確定樣品中Cf色譜峰，計(jì)算出樣品中峰面積，帶入樣品對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定其具體濃度?？Х纫虻暮堪聪铝泄接?jì)算：C=m/M公式中，C-樣品中Cf含量（μg/kg）；m-進(jìn)樣溶液中Cf含量(μg)；M-進(jìn)樣溶液相當(dāng)于所需樣品的質(zhì)量(kg)。3.4耐咖啡因真菌降解機(jī)制探究3.4.1草酸青霉菌生物學(xué)特性分析（1）不同培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)觀察選取經(jīng)篩選后降解效果較為顯著的草酸青霉菌在不用的培養(yǎng)基（PDA、CA、CYA、MEA）上培養(yǎng)。選用合適孔徑大小的打孔器在真菌培養(yǎng)基上打孔，然后將菌餅接種于上述4種固體培養(yǎng)基平皿中倒置培養(yǎng)。采用十字交叉法固定時(shí)間每日測(cè)量菌落直徑，并觀察其特性。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。恒溫恒濕培養(yǎng)一周，拍照觀察，進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析[98]。（2）培養(yǎng)體系的簡(jiǎn)單優(yōu)化結(jié)果分析首先將14號(hào)青霉菌在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)一周，用打孔器制備菌餅并接種于PDA平板中央。根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，將平板置于不同培養(yǎng)條件。光照影響：將接菌的平板放于三種不同光照條件：全光照、全黑暗、12h光暗交替，每組3個(gè)技術(shù)重復(fù)。36h后十字交叉法測(cè)量菌落直徑，7d后取出培養(yǎng)皿采用烘干法測(cè)量菌絲體重量。溫度影響：將接菌平板分別置于5℃、15℃、25℃、30℃、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組3個(gè)技術(shù)重復(fù)。每天固定時(shí)間在菌絲用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算其日均生長(zhǎng)速度。10d后測(cè)定其菌絲體重量?？棺贤饽芰Φ臏y(cè)定：分別配置濃度為2*102個(gè)/mL、2*103個(gè)/mL的孢子懸浮液。分別取0.1mL配置的孢子懸浮液接種到裝有PDA培養(yǎng)基的平皿中，用玻璃棒涂布涂勻。然后放置入無(wú)菌操作臺(tái)中，分別用紫外線照射1min、3min、5min、7min、9min，不處理的作為對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，然后在25℃條件下培養(yǎng)3d，統(tǒng)計(jì)單菌落個(gè)數(shù)。計(jì)算致死率，綜合比較不同紫外線照射時(shí)間對(duì)青霉菌孢子萌發(fā)抑制率。（3）草酸青霉菌的生長(zhǎng)曲線分析先將實(shí)驗(yàn)探究得到的優(yōu)化培養(yǎng)體系培養(yǎng)草酸青霉菌。挑取少量草酸青霉菌孢子于50mLPDB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床恒溫培養(yǎng)，每隔12h觀察稱量一次，每組實(shí)驗(yàn)三個(gè)重復(fù)。再用稱重法測(cè)定生長(zhǎng)曲線：①將液體培養(yǎng)基中的真菌用紗布過(guò)濾，靜置30min備用；同時(shí)將洗凈的鋁盒置于100℃烘箱中烘干30min;②取出鋁盒置于干燥皿中冷卻15min，稱重記錄凈重m1;③將靜置后的真菌置于鋁盒中，并稱重記錄濕重m2;然后置于100℃烘箱中烘干4h；④4h后拿出鋁盒置于干燥皿冷卻15min，再稱重記錄為m3;⑤將鋁盒再次放入100℃烘箱中烘干1h，再次稱重，直到m3重量不變?yōu)橹?；⑥?jì)算真菌重量：m=m3-m2-m1，將數(shù)據(jù)繪制成生長(zhǎng)曲線。3.4.2草酸青霉菌降解咖啡因及其代謝產(chǎn)物的研究（1）外緣添加咖啡因，固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，UPLC檢測(cè)其代謝產(chǎn)物外緣添加咖啡因，固體培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)草酸青霉菌：配置含咖啡因1mg/mL固體培養(yǎng)基PDA，在超凈工作臺(tái)中，從事先培養(yǎng)了7d的不含咖啡因的固體培養(yǎng)基PDA上挑取少量孢子置于平板中央。所有試劑需滅菌。然后置于28℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7d。真菌樣品的制備：①首先10mL滅菌的試管裝有刮取的菌絲，標(biāo)記好后加純甲醇至10mL刻度線處，超聲浸提30min；②用玻璃棉（glasswool）過(guò)濾菌液，濾液用滅菌的試管收集，并標(biāo)記好；③將濾液平均分裝至2mL滅菌的dorf試管，置于真空濃縮儀濃縮2h;④最后向濃縮后的試管中加80%甲醇1mL，4℃低溫高速離心20min，過(guò)有機(jī)相濾膜后置于液相小瓶中，4℃短期存放，-20℃長(zhǎng)期存放。樣品的UPLC檢測(cè)方法：按照沃特世（Waters）的H-CLASS超高效液相色譜優(yōu)化系統(tǒng)和方法進(jìn)行操作。首先Waters操作系統(tǒng)界面選用Q-quickly連接，進(jìn)入個(gè)人操作系統(tǒng)；其次點(diǎn)擊“方法”，設(shè)置方法參數(shù)為：紫外波長(zhǎng)256nm，最高流速0.3mL/min，最大壓強(qiáng)10000psi，進(jìn)樣量為1μL，具體流速方法設(shè)置如下，參考3.2.2。（2）外緣添加咖啡因，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，LC-MS/MS確定代謝產(chǎn)物及其途徑外緣添加咖啡因，液體培養(yǎng)基PDB培養(yǎng)草酸青霉菌：配置含咖啡因1mg/mL液體培養(yǎng)基PDB，在超凈工作臺(tái)中，從事先培養(yǎng)了7d的固體培養(yǎng)基PDA上挑取少量孢子入瓶中，搖勻。所有試劑需滅菌。然后置于28℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7d。真菌樣品的制備：①首先10mL滅菌的試管裝有刮取的菌絲，標(biāo)記好后加純甲醇至10mL刻度線處，超聲浸提30min；②其次用玻璃棉（glasswool）過(guò)濾菌液，濾液用滅菌的試管收集，并標(biāo)記好；③將濾液平均分裝至2mL滅菌的dorf試管，置于真空濃縮儀濃縮2h;④最后向濃縮后的試管中加80%甲醇1mL，4℃低溫高速離心20min，過(guò)有機(jī)相濾膜后置于液相小瓶中，4℃短期存放，-20℃長(zhǎng)期存放。樣品的UPLC檢測(cè)方法如上3.4.2（1），再將上述樣品進(jìn)行LC-MS/MS進(jìn)樣，儀器為安捷倫三重四極桿，選擇正離子模式，能量18ev。表3-SEQ表3-\*ARABIC4黃嘌呤類物質(zhì)液相-液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)信息Table3-4DetectioninformationofxanthinesinLC-MS物質(zhì)保留時(shí)間相對(duì)分子質(zhì)量母離子子離子定量沖擊能量identifyRT:minMParentionFragmentionMRMcollisionenergy黃嘌呤2.425152153110187-甲基黃嘌呤3.769166167124183-甲基黃嘌呤4.371166167124181-甲基黃嘌呤4.94916616711018可可堿7.07118018111018擬黃嘌呤9.69818018112418茶葉堿10.15018018112418咖啡因13.61219419513818液相-液質(zhì)聯(lián)用（安捷倫三重四極桿）方法：流動(dòng)相中有機(jī)相為色譜級(jí)的純甲醇，水相為0.2%乙酸水（V:V=1:1）。設(shè)置方法參數(shù)為：紫外波長(zhǎng)256nm，最高流速0.2mL/min，最大壓強(qiáng)600bar，進(jìn)樣量為1μL，具體參數(shù)方法設(shè)置如下，參考表3-3和3-4。（3）外緣添加茶葉堿、可可堿，UPLC檢測(cè)其代謝產(chǎn)物及其途徑外緣添加茶葉堿，可可堿，液體培養(yǎng)基PDB培養(yǎng)草酸青霉菌：分別配置含茶葉堿1mg/mL和可可堿0.5mg/mL的液體培養(yǎng)基PDB，在超凈工作臺(tái)中，從事先培養(yǎng)了7d的固體培養(yǎng)基PDA上挑取少量孢子入瓶中，搖勻。所有試劑需滅菌。然后置于28℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7d。真菌樣品的制備：①首先10mL滅菌的試管裝有刮取的菌絲，標(biāo)記好后加純甲醇至10mL刻度線處，超聲浸提30min；②其次用玻璃棉（glasswool）過(guò)濾菌液，濾液用滅菌的試管收集，并標(biāo)記好；③將濾液平均分裝至2mL滅菌的dorf試管，置于真空濃縮儀濃縮2h;④最后向濃縮后的試管中加80%甲醇1mL，4℃低溫高速離心20min，過(guò)有機(jī)相濾膜后置于液相小瓶中，4℃短期存放，-20℃長(zhǎng)期存放。最后樣品的UPLC檢測(cè)方法如上3.4.2（1）。3.5耐咖啡因真菌外排機(jī)制探究3.5.1轉(zhuǎn)錄組及材料處理（1）材料處理將實(shí)驗(yàn)室保存的耐咖啡因菌株，重新接種到含咖啡因PDA中，置于28℃恒溫恒濕倒置培養(yǎng)7d，再轉(zhuǎn)移少量孢子至PDB中進(jìn)行擴(kuò)繁，于28℃搖床培養(yǎng)3d，再然后分別吸取1mL菌液于100mL含不同濃度咖啡因液體培養(yǎng)基PDB中。菌液加入比例為1:100，所有操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。敏感型真菌:0mg/mL，1mg/mL，3mg/mL；耐受型真菌：0mg/mL，3mg/mL，7mg/mL。每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，一共18個(gè)樣品，培養(yǎng)7d，按照真菌提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行制樣，-80℃保存，用于轉(zhuǎn)錄組分析。（2）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法比較轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：按照試劑盒提取樣品總RNA，再進(jìn)行后續(xù)處理；構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent2100Bioanalyzer和ABIStepOnePlusReal-TimePCRSystem質(zhì)檢，合格后使用IlluminaHiSeq4000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序所得數(shù)據(jù)稱為rawreads。完整的分析流程圖見(jiàn)圖3-1.圖3-SEQ圖3-\*ARABIC1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究流程圖Fig.3-1Transcriptomesequencingresearchprocess測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾：測(cè)序的原始數(shù)據(jù)包含不合格的reads，數(shù)據(jù)分析之前需要進(jìn)行過(guò)濾，具體步驟如下：①去除包含接頭的reads(接頭污染)；②去除未知堿基N含量大于5%的reads；③除去不及格的低質(zhì)量reads。3.5.2生物信息學(xué)分析（1）差異剪接基因檢測(cè)差異剪接基因分兩類，一類是該基因亞型的相對(duì)豐度發(fā)生了差異。另一類是，如果基因表達(dá)量發(fā)生差異。本實(shí)驗(yàn)使用rMATS檢測(cè)不同處理之間的差異剪接基因(DSG)。（2）基因表達(dá)量分析本實(shí)驗(yàn)使用Bowtie2將cleanreads比對(duì)到該參考序列，再使用RSEM計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，綜合R軟件里的cor函數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析和hclust函數(shù)進(jìn)行層次聚類分析，并配合維恩圖來(lái)展示樣品間基因表達(dá)分布。（3）差異表達(dá)基因檢測(cè)與分析根據(jù)需求，本實(shí)驗(yàn)使用NOIseq算法進(jìn)行差異基因檢測(cè)。根據(jù)差異基因檢測(cè)結(jié)果，主要是p值。多組差異基因同時(shí)聚類時(shí)，需要對(duì)組間交集差異基因與并集差異基因分別進(jìn)行聚類分析。并對(duì)差異基因進(jìn)行功能分類和phyper函數(shù)富集分析。3.5.3ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的熒光定量PCR結(jié)果（1）熒光定量PCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)既用于驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性也用來(lái)分析差異基因的表達(dá)[99]。（2）熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方法選取BD/CG的ACTIN基因作為內(nèi)參基因，根據(jù)測(cè)序拼接所得cDNA序列，挑選ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子基因并隨即挑選其它幾個(gè)差異表達(dá)基因，其中5個(gè)下調(diào)，7個(gè)上調(diào)。利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，如表所示，引物由上海生工公司合成。每一個(gè)樣品分別設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。退火溫度60℃，使用qPCR儀自動(dòng)選取的Ct閾值。定量PCR使用BioRadIQ5qPCR儀，選用熒光染料SYBRGreen，反應(yīng)體系為20μL，加入cDNA模板量為5μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min40個(gè)循環(huán)（95℃10sec60℃30sec72℃30sec），反應(yīng)末尾進(jìn)行qPCR產(chǎn)物熔解曲線分析來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物的單一性。所有操作在超凈工作臺(tái)完成，酶和各種試劑需放在冰盒里。當(dāng)擴(kuò)增完成時(shí)，根據(jù)擴(kuò)增曲線和溶解曲線確定此次PCR反應(yīng)是否具有特異性。（3）熒光定量PCR結(jié)果分析利用2-ΔΔCt法（ΔCt=Ct（目標(biāo)基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt(n)-ΔCt(1)）計(jì)算qRT-PCR基因的相對(duì)表達(dá)量，分析數(shù)據(jù)，與RNA-Seq中基因的表達(dá)模式進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)RNA-Seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，以便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。4結(jié)果與分析4.1茶樹葉片真菌的鑒定4.1.1茶樹葉片真菌的形態(tài)學(xué)觀察描述從形態(tài)學(xué)角度觀察，我們判斷：1、2、3號(hào)為鏈格孢屬：前期為灰色，后期變暗，菌落絮狀，菌絲及分生孢子梗褐色。4、5、6、7號(hào)為擬盤多毛孢屬：菌絲為淡褐色至褐色，分生孢子梗長(zhǎng)短不一。8號(hào)為刺盤孢屬：菌絲為黑褐色分，分生孢子剛毛褐色至黑褐色、有隔膜，平滑，較堅(jiān)硬。10、11號(hào)為鐮刀屬：菌株顏色差異較大，10號(hào)為淡黃色，11號(hào)菌絲為淡粉色，菌絲有隔，分枝。13號(hào)為葉點(diǎn)霉屬：菌絲體灰褐色至黑色，分生孢子器扁球形。14、16號(hào)為青霉屬：菌絲體呈橄欖綠至灰綠色，分生孢子梗分枝呈帚狀枝，氣生菌絲密氈狀、松絮狀。15號(hào)為孢霉屬：菌落呈絨毛狀或絮狀，生長(zhǎng)迅速，菌絲體暗綠色、橄欖綠色，后變成褐綠以至黑色。如圖4-1。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC1茶園中分離的茶樹葉片真菌Fig.4-1Tealeaffungusisolatedfromteaplantation4.1.2茶樹葉片真菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果本實(shí)驗(yàn)用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)從不同茶園產(chǎn)地分離獲得的茶樹葉片真菌進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明16株菌株主要分為8個(gè)屬，分別為：鏈格孢屬，擬盤多毛孢屬，刺盤孢屬，鐮刀屬，草莖點(diǎn)霉屬，葉點(diǎn)霉屬，青霉屬，孢霉屬。根據(jù)生物學(xué)鑒定，相應(yīng)的測(cè)序結(jié)果整理，并將NCBI比對(duì)結(jié)果整理如表4-1。表4-SEQ表4-\*ARABIC1真菌分子生物學(xué)鑒定清單Table4-1.ThefungulistidentifybymolecularbiologyS.NONAMEAREA1AlternariaalternateHefei2AlternariaalternateLu’an3AlternariaalternateLu’an4AlternariaalternateHefei5Pestalotiopsissp.Lu’an6Pestalotiopsissp.Lu’an7Pestalotiopsissp.Lu’an8ColletotrichumgloeosporioidesHefei9BotryosphaeriadothideaHefei10FusariumconcentricumChizhou11FusariumincarnatumChizhou12PhomaherbarumChizhou13PhyllostictacapitalensisChizhou14Penioillumsp.Lu’an15ArthriniumarundinisLu’an16Penioillumsp.Lu’an4.2茶樹葉片耐咖啡因真菌的篩選4.2.1不同濃度咖啡因篩選真菌通過(guò)不同濃度的咖啡因培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將只能在3mg/mL咖啡因濃度下生長(zhǎng)的真菌暫定為“咖啡因敏感型真菌”；將能在5-7mg/mL咖啡因濃度下生長(zhǎng)的真菌暫定為“咖啡因耐受型真菌”，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，整理成表4-2。表4-SEQ表4-\*ARABIC2咖啡因敏感與耐受型真菌分類Table4-2.ThefungulistidentifybydifferentconcentrationcaffeineTYPES.NONAMEAREA咖啡因耐受型1AlternariaalternateHefei2AlternariaalternateLu’an3AlternariaalternateLu’an8ColletotrichumgloeosporioidesHefei10FusariumconcentricumChizhou12PhomaherbarumChizhou14Penioillumsp.Lu’an咖啡因敏感型4AlternariaalternateHefei5Pestalotiopsissp.Lu’an6Pestalotiopsissp.Lu’an7Pestalotiopsissp.Lu’an9BotryosphaeriadothideaHefei11FusariumincarnatumChizhou13PhyllostictacapitalensisChizhou15ArthriniumarundinisLu’an16Penioillumsp.Lu’an4.2.2UPLC檢測(cè)耐咖啡因真菌的代謝產(chǎn)物通過(guò)UPLC檢測(cè)“咖啡因耐受型真菌”，其中結(jié)果表明能降解咖啡因的真菌有三株，分別為10號(hào)伏馬菌屬，14號(hào)青霉菌和16號(hào)青霉菌。然而，10號(hào)降解效率低，16號(hào)不能進(jìn)行降解，故只能確定14號(hào)青霉菌能有效降解咖啡因。如圖4-2.圖4-SEQ圖4-\*ARABIC214號(hào)青霉菌降解咖啡因的超高效液相圖Fig.4-2TheUPLCresultofnum.14Penioillumsp.indegreeingcaffeine注：標(biāo)準(zhǔn)品（standard）：黃嘌呤(X)、7-甲基黃嘌呤(7mx)、3-甲基黃嘌呤(3mx)、1-甲基黃嘌呤(1mx)、可可堿(Tb)、擬黃嘌呤(Pa)、茶葉堿(Tp)、咖啡因(Cf)；對(duì)照(control)：1mg/mL的咖啡因的PDA；樣品（sample）：1mg/mL的咖啡因的PDA培養(yǎng)的青霉菌4.3真菌耐咖啡因機(jī)制之降解機(jī)制4.3.1草酸青霉菌的鑒定（1）rDNA-ITS序列分析以14號(hào)青霉菌的DNA作為模板，用通用引物擴(kuò)增出約500bp的rDNA-ITS序列。然后將所測(cè)得的序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果與P.oxalicum8A7相似性最大，為99％。（2）同源性比較及其發(fā)育關(guān)系分析為了進(jìn)一步確定14號(hào)青霉菌在種水平上的分類，將ITS4，ACT，CAL三個(gè)基因串聯(lián)進(jìn)行多基因位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析。選取12株青霉屬真菌為參考菌株，以AspergillusnigerJ8M32為外緣參考菌株，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖4-3。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析可以發(fā)現(xiàn)，14號(hào)青霉菌與P.oxalicum8A8、P.oxalicumPo-5、P.oxalicumA28三個(gè)菌株緊密聚在一起成為一簇，因此，將14號(hào)青霉菌鑒定為P.oxalicum。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC314號(hào)青霉菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4-3Thephylogenetictreeofnum.14Penicillium4.3.2草酸青霉菌生物學(xué)特性分析（1）不同培養(yǎng)基上的形態(tài)觀察14號(hào)青霉菌在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)，日均生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢子量、菌絲體顏色以及菌落厚度各有不同。PDA既有助于菌絲體的健康生長(zhǎng)，也有助于孢子的產(chǎn)生。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC4草酸青霉菌電子顯微鏡圖Fig.4-4ElectronmicroscopyofP.oxalate圖4-SEQ圖4-\*ARABIC5不同培養(yǎng)基上的草酸青霉菌Fig.4-5ThegrowthofP.oxalateondifferentculturemediumPDA培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)觀察：25℃培養(yǎng)7d，草酸青霉菌呈現(xiàn)絨狀，生長(zhǎng)快，菌絲體初為白色，略帶粘性且較寬，然后變成綠色的霉菌層，基質(zhì)的顏色不變。其分生抱子梗無(wú)色，較短，帚狀枝大而不規(guī)則小梗中部稍寬，分生孢子串生，單孢，無(wú)色，卵圓形或圓形，較大，如圖4-4所示。CA培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)觀察：菌落在CA上25℃培養(yǎng)7d，直徑40-70mm，平坦或近于平坦，分生孢子易脫落；質(zhì)地絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)通常大量產(chǎn)生，分生孢子面呈灰綠色或暗綠色，近于鼠尾草綠，深石板綠色或俄羅斯綠，也有的分離物在菌落中部的分生孢子結(jié)構(gòu)少或較少；菌絲體通常白色或微黃色，也有的分離物在中部面上帶紫褐色；滲出液缺乏；反面近于無(wú)色，微紅色或橙黃色；可溶性色素缺乏。CYA培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)觀察：在CYA上25℃培養(yǎng)7d，生長(zhǎng)繁茂，直徑25-47mm，中心有臍狀突起而其它部分平坦或有放射狀溝紋；質(zhì)地絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)較多或大量產(chǎn)生，分生孢子面暗綠色，近于暗淡黃綠色，暗常春藤綠色或紫杉綠色；滲出液缺乏；反面黃褐色，棕褐色；無(wú)可溶性色素。MEA培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)觀察：菌落在MEA上25℃培養(yǎng)7d，直徑30-70mm，質(zhì)地絨狀；平坦或近于平坦，分生孢子易脫落，帚狀枝通常彼此較緊貼，分生孢子典型的橢圓形且大等特征突出；分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，壁平滑，幼齡時(shí)呈現(xiàn)瓶狀至披針狀，充分成熟時(shí)近圓柱狀，梗頸通常明顯。綜合分析發(fā)現(xiàn)，草酸青霉菌在不同培養(yǎng)基上菌落顏色差異較大。（2）培養(yǎng)體系的簡(jiǎn)單優(yōu)化結(jié)果分析光照影響：選取草酸青霉菌，觀測(cè)光照對(duì)它們生長(zhǎng)的影響。由圖4-6可以看出，不同光照處理后，14號(hào)草酸青霉菌的生物量均無(wú)顯著性差異。培養(yǎng)5d后，不同光照條件下菌落生長(zhǎng)無(wú)顯著性差異。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC6不同光照下生長(zhǎng)的草酸青霉菌Fig.4-6ThegrowthofP.oxalateondifferentlight從圖中亦可看到在全光照、全黑暗、光暗交替這種不同光照條件培養(yǎng)后，不同處理間差異并不顯著。24h-L全光照菌絲生物量最多，24h-D全黑暗次之，12h-L-12h-D最少。綜上所述，草酸青霉菌菌落的菌絲生長(zhǎng)量與光照與否并不敏感。而光照有利于菌絲體的生長(zhǎng)。溫度影響：將草酸青霉菌分別在培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，培養(yǎng)測(cè)定其菌落直徑量。由圖4-7可以看出14號(hào)青霉菌在40℃與45℃下，菌落生長(zhǎng)直徑要高于其它溫度處理?xiàng)l件下的菌落直徑。而在60℃條件下菌株的菌絲體均停止生長(zhǎng)。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC7不同溫度的草酸青霉菌的生長(zhǎng)Fig.4-7ThegrowthofP.oxalateondifferenttemperature總體而言，不同青霉菌株在不同溫度條件下的菌落生長(zhǎng)速率差異顯著。因此，應(yīng)該選擇菌絲體生長(zhǎng)速率最大的溫度作為最佳溫度。本試驗(yàn)使用28℃作為青霉菌株生長(zhǎng)的最佳溫度。由圖4-7的試驗(yàn)結(jié)果可以看出草酸青霉菌的致死溫度為55-60℃左右菌株即可完全致死?？傮w而言，草青霉的死亡率隨著溫度的升高而逐漸增加。但是當(dāng)溫度上升到較高的溫度值時(shí)，青霉菌基本會(huì)停止生長(zhǎng)，這也反映出青霉對(duì)不同環(huán)境的強(qiáng)烈適應(yīng)性。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC8不同紫外照射時(shí)間下草酸青霉菌的生長(zhǎng)Fig.4-8ThegrowthofP.oxalateondifferentultraviolettime抗紫外能力的測(cè)定：對(duì)草酸青霉菌株分別進(jìn)行1min，5min，9min的紫外線輻照處理，觀察菌落的致死率。由圖4-8，相同時(shí)間的紫外輻照條件下，隨著紫外輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，草酸青霉菌的致死率逐漸增加，當(dāng)增加到一定程度，草酸青霉菌將死亡近半。綜合分析總結(jié)，短時(shí)間內(nèi)輻照時(shí)致死率較低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率增加幅度最大，輻照9min后致死率達(dá)近60%。（2）青霉菌的生長(zhǎng)曲線分析草酸青霉菌的生長(zhǎng)曲線和其他絲狀真菌類似，也分為三個(gè)階段：初期適應(yīng)期，快速生長(zhǎng)期，衰亡期。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC9草酸青霉菌的生長(zhǎng)曲線Fig.4-9ThegrowthcurveofP.oxalate結(jié)果如圖4-9所示。前0-1.5d左右為草酸青霉菌的生長(zhǎng)適應(yīng)期，基本肉眼看不出變化，1.5-6d為快速生長(zhǎng)期，數(shù)量幾乎呈直線增加，因?yàn)檫@段時(shí)間孢子快速增殖，7-10d衰亡很快。4.3.3草酸青霉菌降解咖啡因的代謝途徑探究（1）外緣添加咖啡因，固態(tài)/液態(tài)培養(yǎng)青霉菌，UPLC檢測(cè)其代謝產(chǎn)物及LC-MS/MS確定產(chǎn)物外緣添加咖啡因，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14號(hào)草酸青霉菌，通過(guò)UPLC檢測(cè)到疑似為茶葉堿和1-甲基黃嘌呤等代謝產(chǎn)物的生成，，如圖4-2所示。繼而在液體培養(yǎng)基中添加咖啡因，培養(yǎng)14號(hào)草酸青霉菌，通過(guò)LC-MS/MS檢測(cè)真菌的代謝產(chǎn)物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間和二級(jí)子離子信息得到青霉菌降解咖啡因的產(chǎn)物主要為茶葉堿和少量的可可堿，微量的擬黃嘌呤，以及1-甲基黃嘌呤，最后降解為黃嘌呤，如圖4-12所示。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC10黃嘌呤類生物堿含量變化Fig.4-10Thechangesinxanthinealkaloids圖4-SEQ圖4-\*ARABIC11草酸青霉菌生物降解咖啡因途徑Fig.4-11TheSchemeofBiotransformationofcaffeinebyPenioillumoxalicum（2）外緣添加茶葉堿、可可堿，UPLC檢測(cè)其代謝產(chǎn)物及其途徑實(shí)驗(yàn)表明，草酸青霉菌通過(guò)脫甲基方式降解咖啡因，先將其脫甲基為茶葉堿和少量的可可堿，再進(jìn)一步脫甲基為1-甲基黃嘌呤，最后脫甲基為黃嘌呤。實(shí)驗(yàn)繼續(xù)外緣添加茶葉堿，可可堿培養(yǎng)草酸青霉菌，通過(guò)UPLC檢測(cè)其代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步確定了其代謝產(chǎn)物。4.4真菌耐咖啡因機(jī)制之外排機(jī)制4.4.1BD、CG的轉(zhuǎn)錄組的生物信息學(xué)分析利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)IlluminaHiseq平臺(tái)分別對(duì)培養(yǎng)了7d的不同咖啡因濃度處理的BD/CG進(jìn)行測(cè)序。一共測(cè)了18個(gè)樣品，其中BD/CG各9個(gè)。BD每個(gè)樣品平均產(chǎn)出2.29Gb數(shù)據(jù)。在將測(cè)序讀數(shù)與參考基因組進(jìn)行比較并重建轉(zhuǎn)錄本后，共檢測(cè)到4，628個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，其中4，264個(gè)是已知蛋白質(zhì)編碼基因的可變剪接亞型，9個(gè)是新的蛋白編碼基因，其余355個(gè)是長(zhǎng)鏈非編碼RNA；CG每個(gè)樣本平均產(chǎn)生2.27Gb數(shù)據(jù)。在將測(cè)序reads與參考基因組進(jìn)行比較并重建轉(zhuǎn)錄本后，共檢測(cè)到5，623個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本，其中已知蛋白質(zhì)編碼基因的可變剪接亞型有3，214個(gè)，新的蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本有266個(gè)。剩下的2，143個(gè)屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的各項(xiàng)數(shù)據(jù)均表明測(cè)序質(zhì)量良好。樣品的SNP和INDEL信息SNP（SingleNucleotidePolymorphisms）是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在群體中的出現(xiàn)頻率不少于1％。轉(zhuǎn)換頻率居多，主要是C2T轉(zhuǎn)換。INDEL表示插入或缺失。在本實(shí)驗(yàn)中與參考基因組進(jìn)行比較后，使用GATK檢測(cè)每個(gè)樣品的SNP和INDEL信息，并將最終結(jié)果以VCF格式存儲(chǔ)。然后統(tǒng)計(jì)每個(gè)SNP和INDEL的位點(diǎn)區(qū)域信息，如圖4-12和4-13。結(jié)果表明對(duì)比轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC12SNP類型統(tǒng)計(jì)圖(X軸代表變異類型，Y軸代表相應(yīng)的SNP)Fig.4-12SNPtypestatisticalgraph圖4-SEQ圖4-\*ARABIC13INDEL位點(diǎn)的區(qū)域分布圖(Up2k指?個(gè)基因上游2000bp內(nèi)的區(qū)域，Down2k指?個(gè)基因下游2000bp內(nèi)的區(qū)域。)Fig.4-13TheregionaldistributionoftheINDELlocus.差異剪接基因檢測(cè)我們繼參考基因組比對(duì)后，又利用rMATS來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組樣品間的差異剪接基因(DSG)。DSG由可變剪接事件進(jìn)行調(diào)控，樣品間同?基因的亞型相對(duì)豐度比例發(fā)生差異（不管表達(dá)量是否發(fā)生差異），說(shuō)明該基因受剪接機(jī)制調(diào)控。我們檢測(cè)其中5種可變剪接事件調(diào)控的DSG，分別為SkippedExon(SE)，Alternative5’SplicingSite(A5SS)，Alternative3’SplicingSite(A3SS)，Mutuallyexclusiveexons(MXE)和RetainedIntron(RI)，每組比對(duì)方案檢測(cè)到的DSG的GeneOntoloty功能分類如圖4-14所示。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC14DSG的GO功能分類圖(X軸代表GO功能類型，Y軸代表相應(yīng)的DSG數(shù)目。)Fig.4-14TheGOFunctionalclassificationdiagramofDSG基因表達(dá)量分析在獲得新的轉(zhuǎn)錄本后，將預(yù)測(cè)具有蛋白質(zhì)編碼潛力的新的轉(zhuǎn)錄本添加到參考基因序列中，以獲得完整的參考序列信息。然后使用Bowtie2將cleanreads與參考序列進(jìn)行比對(duì)，然后使用RSEM計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，根據(jù)比對(duì)結(jié)果和表達(dá)量信息計(jì)算樣品間兩兩的相關(guān)性系數(shù)，分析結(jié)果見(jiàn)圖4-15。結(jié)果表明：不同處理下基因表達(dá)量差異顯著，為后期代謝通路分析提供依據(jù)。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC15樣品間相關(guān)性分析熱圖(X、Y軸均代表每個(gè)樣品。顏色代表相關(guān)性系數(shù)(顏色越藍(lán)代表相關(guān)性越高，顏色越白代表相關(guān)性越低)。)Fig.4-15Intersamplecorrelationanalysisheatmap差異表達(dá)基因檢測(cè)與分析我們根據(jù)生物信息學(xué)分析方法對(duì)其進(jìn)行差異基因分析。本實(shí)驗(yàn)BD篩選出628條差異基因，CG篩選出1137條差異基因，并進(jìn)行VEEN圖分析，結(jié)果如圖4-16所示。然后再按照q值進(jìn)行排序，縮小范圍，q越小說(shuō)明差異越顯著，受處理?xiàng)l件影響的越深。然后從q值較小的基因里篩選與研究目的相關(guān)的基因，進(jìn)行差異基因的熱圖和差異基因的qRT-PCR驗(yàn)證，如圖4-17所示。圖4-SEQ圖4-\*ARABIC16樣品間基因上下調(diào)關(guān)系和韋恩圖Fig.4-16Genomicdown-regulationrelationshipandVenndiagrambetweensamples.圖4-SEQ圖4-\*ARABIC17差異基因的熱圖和差異基因的qRT-PCRFig.4-17HeatmapofdifferentialgenesandqRT-PCRofdifferentialgenes圖4-SEQ圖4-\*ARABIC18差異基因GO功能分類圖（X軸代表DEG數(shù)目，Y軸代表GO功能分類）Fig.4-18GOfunctionclassificationofdifferentialgenes圖4-19差異基因Pathway分類圖(X軸代表DEG數(shù)目，Y軸代表KEGG通路)Fig.4-19Thepathwayofdifferentialgenes圖4-20差異基因Pathway富集結(jié)果（X軸代表富集因?值，Y軸代表通路名稱。顏色代表qvalue(顏色越白值越?，越藍(lán)值越?)，值越?代表富集結(jié)果越顯著。點(diǎn)的?代表DEG數(shù)目(點(diǎn)越?代表數(shù)目越?，越?代表數(shù)目越少)。Fig.4-20TheresultsofdifferentialgenePathwayenrichment篩選得到目的相關(guān)的差異基因，再進(jìn)行GO和KEGG分析。GO和KEGG是注釋基因功能的兩個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)庫(kù)，GO關(guān)注某個(gè)基因分子功能、生物學(xué)過(guò)程和參與的細(xì)胞組分，而KEGG是更具體的說(shuō)明了該基因參與的代謝通路，如圖4-18，4-19和4-20。4.4.2ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的熒光定量PCR結(jié)果本實(shí)驗(yàn)中，CG是咖啡因耐受型真菌，轉(zhuǎn)錄組分析：梯度濃度的咖啡因處理后的CG真菌，其基礎(chǔ)代謝（oxidativephosphorylation、carbonmetabolism）下降，次級(jí)代謝（Sulfurrelaysystem、pyrimidinemetabolism、glycine，serineandthreoninemetabolism、endocytosis）上升；而BD是咖啡因敏感型真菌，轉(zhuǎn)錄組分析表明：梯度濃度的咖啡因處理后的BD真菌，其基礎(chǔ)代謝（carbonmetabolism）上升，能量消耗也相應(yīng)增加，次級(jí)代謝（Sulfurmetabolism、pyrimidinemetabolism、glycine，serineandthreoninemetabolism、endocytosis）卻相對(duì)下降。此外，CG真菌的ABCtransporter顯著上調(diào)，而BD真菌無(wú)此途徑。根據(jù)差異基因檢測(cè)結(jié)果，我們對(duì)其進(jìn)行KEGG生物通路分類以及富集分析。實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)咖啡因的耐受性與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子成正相關(guān)。如圖4-21所示。并對(duì)其進(jìn)行了熒光定量PCR的驗(yàn)證，其ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子基因熒光定量PCR結(jié)果如圖4-22所示。圖4-21ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子基因（18738972）的GO分析結(jié)果Fig.4-21TheresultofABCtransportbyGOanalysis圖4-22ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子基因（18738972）的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果Fig.4-22TheresultofABCtransportbyRT-qPCR

5結(jié)論與討論5.1結(jié)論5.1.1茶園分離的耐咖啡因的真菌數(shù)量及種類通過(guò)平板分離培養(yǎng)和含1mg/mL咖啡因的篩選，從茶樹葉片上共分離得到16株真菌，分別為：鏈格孢屬，擬盤多毛孢屬，刺盤孢屬，鐮刀屬，草莖點(diǎn)霉屬，葉點(diǎn)霉屬，青霉屬，孢霉屬等8個(gè)屬。根據(jù)不同濃度梯度的培養(yǎng)基篩選，將分離得到的16株真菌劃分為“咖啡因耐受型真菌”，該6株耐咖啡因真菌濃度能達(dá)到7mg/mL；“咖啡因敏感型真菌”：該10株敏感型真菌濃度僅為3mg/mL。5.1.2草酸青霉菌降解咖啡