發(fā)酵工程下游加工過程概論

第十二章發(fā)酵工程下游加工過程簡(jiǎn)介當(dāng)前1頁，總共36頁。一、發(fā)酵工程下游加工過程概論1、發(fā)酵工程下游加工過程的特點(diǎn)

1）所需產(chǎn)物在培養(yǎng)液中濃度較低，且穩(wěn)定性差2）普遍存在下游工程代價(jià)高，回收率較低等問題發(fā)酵液是復(fù)雜的多相系統(tǒng)當(dāng)前2頁，總共36頁。2、發(fā)酵工程下游加工過程的一般程序成品加工發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾提取精制采用凝聚和絮凝技術(shù)加速固、液分離；如產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)，還要進(jìn)行細(xì)胞破碎提?。ǔ醪郊兓┠康氖浅ヅc目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)差異大的雜質(zhì)精制（高度純化）是采用對(duì)產(chǎn)品有高度選擇性的分離技術(shù)，除去與產(chǎn)物化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)相近的雜質(zhì)最終獲得質(zhì)量合格的產(chǎn)品當(dāng)前3頁，總共36頁。3、主要操作單元：絮凝離心過濾細(xì)胞破碎萃取沉淀層析結(jié)晶干燥當(dāng)前4頁，總共36頁。二、發(fā)酵液預(yù)處理和過濾為什么要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理？預(yù)處理的目的是什么？當(dāng)前5頁，總共36頁。發(fā)酵液的基本特性

產(chǎn)物濃度低具有極性黏度大表面張力大性質(zhì)不穩(wěn)定當(dāng)前6頁，總共36頁。一）發(fā)酵液的預(yù)處理1、目的：

發(fā)酵液中雜質(zhì)多且成分復(fù)雜，其中對(duì)純化影響最大的是高價(jià)無機(jī)離子(Ca2+、Mg2+、Fe3+等)和雜蛋白等改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，加快懸浮液中固形物沉降的速度；盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于以后處理的相中；（一般為液相）能夠除去部分雜質(zhì)。當(dāng)前7頁，總共36頁。2、高價(jià)無機(jī)離子的去除鎂離子的去除：常用草酸與鈣離子生成草酸鈣沉淀草酸為弱酸，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的破壞較小，草酸鈣沉淀還能促進(jìn)蛋白質(zhì)凝固，有利于提高濾液的過濾速度；草酸的溶解度較小，需大用量時(shí)，可用草酸鈉取代；草酸價(jià)格較高，生產(chǎn)上一般需回收鈣離子的去除：鐵離子的去除：常用三聚磷酸鈉與鎂離子形成可溶性絡(luò)合物Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+常用黃血鹽與鐵離子形成普魯氏藍(lán)沉淀3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+當(dāng)前8頁，總共36頁。3、可溶性雜蛋白的去除

雜蛋白的存在會(huì)降低離子交換樹脂和大網(wǎng)格樹脂的吸附量，如采用溶劑萃取，會(huì)發(fā)生乳化，影響兩相分離。此外，在常規(guī)過濾和膜過濾時(shí)，還會(huì)使濾速下降，使膜受到污染。當(dāng)前9頁，總共36頁。1）沉淀法

調(diào)等電點(diǎn)

因羧基的電離度比氨基大，所以大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍(pH4.0-5.5)

但僅靠調(diào)等電點(diǎn)還不能使大部分蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在酸性溶液中，能與一些陰離子物質(zhì)如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽和過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等形成沉淀2）變性法

變性蛋白溶解度較小

最常用加熱法

加熱不僅能使蛋白變性，還可降低液體黏度，提高過濾速率；

其他方法：

大幅度調(diào)節(jié)pH，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑

變性法存在一定的局限

如加熱法只適用于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且需消耗大量酸堿，而有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。3）吸附法加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白而將其除去

如四環(huán)素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白；在枯草芽孢桿菌發(fā)酵中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去當(dāng)前10頁，總共36頁。

凝聚和絮凝都是發(fā)酵液預(yù)處理的重要方法，其處理過程就是將化學(xué)藥劑預(yù)先投加到懸浮液中，改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進(jìn)行分離。

發(fā)酵液預(yù)處理的方法—凝聚和絮凝當(dāng)前11頁，總共36頁。

凝聚指在投加的化學(xué)物質(zhì)（如水解的凝聚劑：鋁、鐵的鹽類或石灰等）作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成1mm大小塊狀凝聚體的過程。

電解質(zhì)的凝聚能力可用凝聚值表示，即使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（mmol/L）。一般反離子的價(jià)數(shù)越高，凝聚值越小，即凝聚能力越強(qiáng)。

如

Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+

當(dāng)前12頁，總共36頁。

絮凝指使用絮凝劑（通常是天然或合成的大分子量聚電解質(zhì)）將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團(tuán)的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用，工業(yè)上使用到的有聚丙烯酰胺類衍生物、聚合鋁鹽、海藻酸鈉、殼聚糖等，目前最常用的是聚丙烯酰胺類衍生物。當(dāng)前13頁，總共36頁。1）板框(plateandframe)壓濾機(jī)板框過濾機(jī)結(jié)構(gòu)圖

1-尾板2-濾框3-濾板4-主梁5-頭板6-緊壓裝置二）發(fā)酵液過濾常用設(shè)備當(dāng)前14頁，總共36頁。板框過濾機(jī)當(dāng)前15頁，總共36頁。

Plateshifter1500x1500FilterPress

Clothwashing當(dāng)前16頁，總共36頁。1）板框(plateandframe)壓濾機(jī)2）帶式壓濾機(jī)二）發(fā)酵液過濾常用設(shè)備當(dāng)前17頁，總共36頁。發(fā)酵后期要少加消泡劑和少進(jìn)行補(bǔ)料，防止消泡劑和未用完的培養(yǎng)基增加過濾難度；菌體自溶前放罐可防止因菌體自溶釋放出的代謝產(chǎn)物增加發(fā)酵液黏度影響發(fā)酵液過濾的因素1）菌體細(xì)胞體積真菌菌絲體較粗大，發(fā)酵液不需特殊處理，易過濾；放線菌菌絲細(xì)而分支，交織成網(wǎng)格狀，較難過濾，發(fā)酵液需經(jīng)預(yù)處理，凝固蛋白質(zhì)等膠體物質(zhì)，提高過濾速度；細(xì)菌菌體更小，發(fā)酵液如不經(jīng)絮凝等預(yù)處理，很難用常規(guī)過濾設(shè)備進(jìn)行過濾操作。2）培養(yǎng)基組成黃豆餅粉、花生餅粉等會(huì)增加過濾難度3）放罐時(shí)機(jī)當(dāng)前18頁，總共36頁。當(dāng)發(fā)酵液中有不溶性多糖時(shí)，會(huì)使發(fā)酵液的黏度增大而影響過濾速度；可用酶將其轉(zhuǎn)化成可溶性單糖，提高濾速。提高過濾性能的方法1）加助濾劑

助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，從而增加濾速；

常用硅藻土、珍珠巖等；

加入方法有兩種：a)預(yù)先在濾布上鋪上一層1-2mm厚的助濾劑；b)直接把助濾劑加入發(fā)酵液中。2）添加填充凝固劑如CaSO4、AlPO4等本身就是助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固3）酶解法當(dāng)前19頁，總共36頁。（沉淀、吸附、萃取、超濾、結(jié)晶）發(fā)酵液初步純化細(xì)胞碎片分離細(xì)胞破碎細(xì)胞分離高度純化成品加工預(yù)處理胞外產(chǎn)物（加熱、調(diào)pH、絮凝）（過濾、離心分離、膜分離)（勻漿、研磨、酶解）（離心分離、雙水相萃取、膜分離）（重結(jié)晶、離子交換、色譜分離、膜分離）（濃縮、無菌過濾、干燥、成型）胞內(nèi)產(chǎn)物提取精制——產(chǎn)品的收得率和質(zhì)量控制。當(dāng)前20頁，總共36頁。細(xì)胞破碎

目的代謝產(chǎn)物并非都是分泌型的，許多是存在于細(xì)胞內(nèi)的，特別是基因工程菌在細(xì)胞內(nèi)形成的包含體是不分泌的，故需進(jìn)行細(xì)胞破碎。當(dāng)前21頁，總共36頁。大規(guī)模破碎細(xì)胞常用方法；利用高壓使細(xì)胞懸液通過針型閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)，造成細(xì)胞破碎。影響破碎的主要因素是壓力、溫度和循環(huán)次數(shù)1）高壓勻漿法高壓勻漿器排出閥2）高速球磨法高速球磨機(jī)1-物料進(jìn)口2-物料出口3、4-冷卻水進(jìn)、出口5、6-夾套冷卻水進(jìn)、出口由于圓盤的高速旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使細(xì)胞得以破碎。3）超聲波法常用超聲波頻率15-25kHz；原理：由于超聲波產(chǎn)生極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，引起黏滯性旋渦在介質(zhì)中的細(xì)胞上造成了剪切力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，造成細(xì)胞破碎；超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作時(shí)需冷卻；通常桿菌比球菌易破，陰性菌比陽性菌易破4）酶解法

專一性強(qiáng)，條件溫和；但費(fèi)用較高

酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用大多數(shù)微生物都能產(chǎn)生一種可以水解自身細(xì)胞壁的酶；當(dāng)改變一定的環(huán)境條件，可誘發(fā)這種酶的過量產(chǎn)生或激發(fā)其他自溶酶產(chǎn)生，而發(fā)生自溶現(xiàn)象。5）滲透壓沖擊法

將細(xì)胞先放入高滲透壓的介質(zhì)中，如高濃度的甘油或蔗糖液，在達(dá)到平衡后，介質(zhì)突然被稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，水就會(huì)迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，致使細(xì)胞膨脹，引起細(xì)胞壁的破裂；此法適用于細(xì)胞壁較脆弱的，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理的，或細(xì)胞壁合成受到抑制的微生物；6）反復(fù)凍結(jié)-融化法將細(xì)胞反復(fù)在低溫下突然冷凍后在室溫下融化，引起細(xì)胞破裂；低溫冷凍一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)斷裂，從而增加細(xì)胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度發(fā)生變化，引起細(xì)胞突然膨脹而破裂。該法適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞細(xì)胞破碎方法當(dāng)前22頁，總共36頁。二、提取（初步分離）（一）沉淀法（Precipitation）沉淀是通過改變條件或加入某種試劑，使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龅倪^程。方法簡(jiǎn)單、成本低、使用廣泛，初步分離的常用手段。鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法非離子型聚合物沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法生成鹽復(fù)合物沉淀法熱變性及酸堿變性沉淀法當(dāng)前23頁，總共36頁。

中性鹽的加入能破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而析出。1.鹽析法(Saltingout)破壞了蛋白質(zhì)在水中存在的兩個(gè)因素(水化層和電荷),從而使蛋白質(zhì)沉淀。將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。當(dāng)前24頁，總共36頁。鹽溶(saltingin)：許多蛋白在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶現(xiàn)象（比在純水中的溶解度大大增加）；高鹽濃度則鹽析，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低；由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。

1）蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。2）離子強(qiáng)度和種類3）溫度溫度是影響溶質(zhì)溶解度的重要因素，升高溫度可以增加許多無機(jī)鹽和小分子有機(jī)化合物的溶解度；4）pH由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)最易沉淀，故可選擇等電點(diǎn)的pH作為鹽析pH影響鹽析的因素當(dāng)前25頁，總共36頁。2.等電點(diǎn)沉淀法原理：利用兩性電解質(zhì)在電中性時(shí)溶解度最低優(yōu)點(diǎn)：許多蛋白的等電點(diǎn)都在偏酸范圍內(nèi)，而許多無機(jī)酸的價(jià)格低廉；缺點(diǎn)：酸化時(shí)易引起蛋白失活

不少蛋白質(zhì)與金屬結(jié)合后會(huì)發(fā)生等電點(diǎn)偏移，如胰島素的等電點(diǎn)為5.3，在與Zn2+結(jié)合形成胰島素鋅鹽，其等電點(diǎn)升為6.2；故加入金屬離子后選擇等電點(diǎn)沉淀時(shí)，要注意調(diào)整pH。當(dāng)前26頁，總共36頁。二、提?。ǔ醪椒蛛x）（二）結(jié)晶法（crystallization）

物質(zhì)從液態(tài)（液體或熔融體）或氣態(tài)形成晶體的過程叫結(jié)晶。當(dāng)前27頁，總共36頁。當(dāng)前28頁，總共36頁。

加入能使結(jié)晶溶質(zhì)溶解度降低的物質(zhì)，讓結(jié)晶溶質(zhì)形成過飽和液；例如卡那霉素不溶于乙醇，向卡那霉素脫色液中加入終濃度為60%-80%的乙醇，就結(jié)晶析出;在普魯卡因青霉素結(jié)晶時(shí)，加入一定量的食鹽，可使結(jié)晶更易析出結(jié)晶方法（過飽和溶液形成的方法）1）濃縮結(jié)晶減壓蒸發(fā)濃縮，達(dá)到過飽和2）冷卻結(jié)晶適用于溶解度隨溫度變化很大的物質(zhì)；先加熱使其溶解，然后冷卻結(jié)晶；3）化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶

加入反應(yīng)劑或調(diào)pH，使生成更低可溶性物質(zhì)；

如在青霉素醋酸丁酯提取液中，加入乙醇-醋酸鉀，因形成的青霉素鉀鹽難溶于醋酸丁酯而結(jié)晶析出。4）解析結(jié)晶（drowningout）當(dāng)前29頁，總共36頁。三、精制（高度純化）（一）離子交換法(Ionexchange)當(dāng)前30頁，總共36頁。離子交換工作原理

根據(jù)物質(zhì)的酸堿性、極性不同，在