雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法

雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法第1頁/共15頁雙熒光素酶報告系統(tǒng)第2頁/共15頁報告基因(reportergene):是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。一般的，把報告基因的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控。在動物基因表達調(diào)控的研究中，報告基因被廣泛應(yīng)用。如綠色熒光蛋白(GFP）和熒光素酶。一、概述第3頁/共15頁熒光素酶（Luciferase）：是能夠催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶的統(tǒng)稱，哺乳細胞無內(nèi)源性熒光素酶。熒光素酶報告基因的優(yōu)點蛋白不需要翻譯后加工，所以一旦翻譯立即產(chǎn)生報告活性。在所有的化學發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細胞及檢測試劑中均檢測不到背景發(fā)光。檢測快速，每個樣品只需幾秒鐘。第4頁/共15頁

構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細胞，適當刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。二、實驗原理

利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（fireflyluciferase）的上游，LUC

啟動子細胞內(nèi)目的基因的轉(zhuǎn)錄被激活未處理對照刺激物處理啟動子-Luc轉(zhuǎn)染細胞啟動子-Luc的啟動子被激活Luc的轉(zhuǎn)錄Luc表達量測得的熒光值第5頁/共15頁同時，為了減少內(nèi)在的變化因素（如：培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別，細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等）對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinillaluciferase）的質(zhì)粒（phRL-TK）作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試結(jié)果不受實驗條件變化的干擾。在測量過程中，當加入熒光素酶檢測試劑II(LARII)時產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶報告基因。定量螢火蟲熒光強度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo?試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應(yīng)，同時進行第二次測量。第6頁/共15頁A．檢測前相關(guān)試劑配制

1.1XPLB裂解緩沖液配制：將4×體積水或PBS加入1×體積5XPLB裂解緩沖液。（使用前在室溫平衡1X緩沖液，平衡需2-3min）。

2.LuciferaseAssayReagentII(LARII)配制：將LuciferaseAssayBufferII加入LuciferaseAssaySubstrate充分混合后，分裝，置于-20℃避光保存。（一次配好，分裝成小管，避免反復(fù)凍融），使用前將配好的LARII從-20℃拿出，并平衡至室溫（需20-30min）。三、操作程序與結(jié)果判定第7頁/共15頁3.Stop&Glo?Reagent配制：現(xiàn)用現(xiàn)配，先將Stop&Glo?Buffer放在37度溫箱中平衡至室溫（15-30min），再將1倍體積的50XStop&Glo?Substrate加入49倍體積的將Stop&Glo?Buffer中。第8頁/共15頁B．樣品制備1.仔細地將生長培養(yǎng)基從待檢細胞孔中吸出。用1XPBS漂洗細胞2-3次。此過程必須仔細，并盡量將漂洗用PBS吸盡（防止細胞掉落）。2.24孔板每孔加入100-150μl1X裂解緩沖液PLB以覆蓋細胞。然后將24孔板置搖床振搖20-30min以保證裂解緩沖液完全裂解細胞。第9頁/共15頁C．雙熒光素酶檢測（PromegaGLOMAX）(注：系統(tǒng)運行時請勿觸摸操作屏)1.重新設(shè)定系統(tǒng)：ToolsSettingsReset2.雙熒光素酶檢測程序的設(shè)定：

ProtocolsRunPromegaProtocolDLR-O-INJOK3.將50μlLARII加入1.5mlEP管中（專用的進口EP管），取10μl細胞裂解液加入裝有LARII的1.5mlEP管中，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出氣泡），置于檢測儀，點擊“Measure”開始讀數(shù)（為螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強度）。（使用前LARII要混勻，并平衡到室溫）第10頁/共15頁4.測量結(jié)束后，取出EP管，再加入50μlStop&Glo?Reagent，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出氣泡），再次置于檢測儀，點擊“Measure”開始讀數(shù)（為內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強度）。（Stop&Glo?Reagent現(xiàn)配現(xiàn)用，不能保存）5.記錄讀數(shù):每個樣品會有3個數(shù)值：RLU1——螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強度,RLU2——內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強度,Ratio——RLU1/RLU2。一般記錄Ratio值即可，但RLU1和RLU2為實際熒光強度值，可以反映細胞的轉(zhuǎn)染效率，也可根據(jù)實際熒光強度來調(diào)整報告質(zhì)粒與內(nèi)參的比例。第11頁/共15頁6.測量完畢后，請將最后檢測的EP管取出后，關(guān)閉儀器。7.實驗結(jié)果的處理與分析：采用雙樣本等方差t檢驗進行處理，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。第12頁/共15頁四、注意事項由于溫度對酶反應(yīng)有影響，所以測定時樣品和試劑均需達到室溫后再進行測定。Renilla熒光素酶檢測工作液后需配制后立即使用，不可配制成工作液后長期保存。LuciferaseAssayReagentII(LARII)不能反復(fù)凍融，保證每次用同一批次的LARII。配好的LARII在-20度可穩(wěn)定一個月，在-70度可穩(wěn)定一年。第13頁/共15頁試劑保存和