第三章液相色譜解析

§3.1概述§3.2儀器結(jié)構(gòu)及分別原理§3.3高效液相色譜分類及原理§3.4色譜分別條件的選擇與優(yōu)化§3.5高效液相色譜方法的建立和應(yīng)用第三章高效液相色譜法2023/3/21流淌相是液體的色譜法稱為液相色譜法。液相色譜可分為平板色譜和柱色譜，在液相柱色譜中，接受顆粒特別細(xì)的高效固定相，并接受高壓泵輸送流淌相，全部工作通過(guò)儀器來(lái)完成,這種色譜法稱為高效液相色譜法.1、高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜GC的比較

HPLCGC1、幾乎可以分析各種化合物只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，約20%的化合物2、可用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析3、柱效不會(huì)很高可得到很高的柱效4、流動(dòng)相有毒，費(fèi)用較高流動(dòng)相為氣體，無(wú)毒、易處理5、儀器制造難度較大儀器制造難度較小§3.1概述2023/3/22

§3.2儀器結(jié)構(gòu)

1.結(jié)構(gòu)流程2023/3/232.主要部件(1)高壓輸液泵要求：能在高壓下連續(xù)工作(>5000psi)較寬的可程序限制的流速范圍耐化學(xué)腐蝕無(wú)脈動(dòng)輸出輸出流量穩(wěn)定、重復(fù)性好易安裝維護(hù)2023/3/24(2)進(jìn)樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常運(yùn)用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2023/3/25(3)高效分別柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效，現(xiàn)在已經(jīng)有超高速高效液相色譜。2023/3/26(4)液相色譜檢測(cè)器按檢測(cè)對(duì)象分類

溶質(zhì)型檢測(cè)器：對(duì)組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)：紫外、熒光、電化學(xué)總體檢測(cè)器：對(duì)試樣或洗脫液總的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)：示差折光、介電常數(shù)、激光散射檢測(cè)器2023/3/27a.紫外檢測(cè)器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。

特點(diǎn)：1、靈敏度高；2、線形范圍高；3、流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；4、對(duì)流淌相的流速和溫度變更不敏感，可用于梯度洗脫；5、波長(zhǎng)可選，易于操作；

2023/3/28b.光電二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2023/3/29光電二極管陣列檢測(cè)器2023/3/210c.示差折光檢測(cè)器

除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流淌相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；通用型檢測(cè)器(每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù))；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；

2023/3/211d.熒光檢測(cè)器

高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；2023/3/212e.電化學(xué)檢測(cè)器

特點(diǎn)：1.靈敏度高，可測(cè)至10-15mol·L-1；

2.選擇性好，只響應(yīng)電活性物質(zhì)；

3.線性范圍寬，可達(dá)45個(gè)數(shù)量級(jí)。

HPLC-ECD法是目前多組分困難樣品分析中的一個(gè)重要手段,尤其在分析低濃度生物樣品中具有不行替代的優(yōu)勢(shì)，漸漸受到生命科學(xué)和分析科學(xué)工作者的關(guān)注2023/3/213f.質(zhì)譜儀

特點(diǎn)：1.靈敏度高，可獲得待測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)信息

2023/3/214(5)附屬部件

脫氣裝置，自動(dòng)進(jìn)樣裝置，梯度洗脫裝置，柱溫箱，衍生系統(tǒng)，餾分收集裝置以及數(shù)據(jù)處理等裝置

如運(yùn)用得當(dāng)，會(huì)大大提高儀器的功能和提高工作效率2023/3/215高效液相色譜法的類型按組分在兩相間分別機(jī)理的不同主要分為：液固吸附色譜法、液液安排色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法及分子排阻色譜法。其中：以反相的化學(xué)鍵合相色譜應(yīng)用最為廣泛§3.3高效液相色譜分類及原理16液固吸附色譜法固定相為固體硅膠silica和alumina（氧化鋁）是最常用的固定相通過(guò)一系列的吸附/脫附步驟形成分別樣品分子對(duì)固定相的吸附程度不同而形成分別固定相流淌相17液液安排色譜法固定液易流失化學(xué)鍵合固定相aqorgiiKi固定相流淌相涂布式固定相缺點(diǎn)：固定液易流失，重現(xiàn)性差，且不適合梯度洗脫和接受高速流淌相18接受化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜。用來(lái)制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基（Si-OH)與有機(jī)分子成鍵，利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面上，形成均一的、堅(jiān)固的單分子薄層而構(gòu)成各種性能的固定相。接受的鍵合反應(yīng)有酯化鍵合(Si—O—R型)、硅烷化鍵合(Si-O-Si-R型)和硅氮鍵合(Si-N型)等。以硅烷化鍵合反應(yīng)最為常用.19化學(xué)鍵合相具有以下特點(diǎn)：1）固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高。2）能耐受各種溶劑，可用于梯度洗脫。3）表面較為均一，沒(méi)有液坑，傳質(zhì)快，柱效高。4）能鍵合不同基團(tuán)以變更其選擇性，例如鍵合氰基、氨基等極性基團(tuán)用于正相色譜法，鏈合離子交換基團(tuán)用于離子色譜法，鍵合C2，C4，C6，C8，C16，C18，C22烷基和苯基等非極性基團(tuán)用于反相色譜法等。因此，它是HPLC較為志向的固定相。20離子交換色譜法固定相表面帶與被分析物相反電荷一般運(yùn)用弱離子交換樹(shù)脂依據(jù)電荷相互作用力的強(qiáng)弱產(chǎn)生分別固定相流淌相21分子排阻色譜法依照分子大小分別固定相材質(zhì)具有不同大小孔徑大分子因其經(jīng)過(guò)的路徑短，所以先流出主要應(yīng)用于聚合物、蛋白質(zhì)等分子量范圍的測(cè)定22§3.4色譜分別條件的選擇與優(yōu)化分別條件的選擇：樣品、固定相、流淌相、洗脫方式一、分別類型選擇

2023/3/2231.流淌相的基本要求（1）與色譜柱不發(fā)生不行逆化學(xué)變更，即保留柱效或柱子的保留性質(zhì)長(zhǎng)期不變；（2）能溶解被分別的樣品；（3）與所用的檢測(cè)器匹配；（4）黏度盡可能小，以獲得高的柱效；（5）價(jià)格便宜、毒性小、易于純化；

二、流淌相的選擇

2023/3/2242.流淌相選擇的基本原則原則：與固定相極性越接近的流淌相，其洗脫實(shí)力越強(qiáng)。例：接受正相液-液安排分別時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，漸漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。常用溶劑的極性依次：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2023/3/2253.流淌相處理（1）用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，以防不溶物磨損高壓泵和堵塞流路、色譜柱等；（2）對(duì)流淌相進(jìn)行脫氣處理，否則，溶于流淌相中的氣體形成氣泡會(huì)影響泵、檢測(cè)器的運(yùn)用；2023/3/226洗脫方式：等度洗脫和梯度洗脫等度洗脫：流淌相組成不隨分析時(shí)間變更，始終是均一的流淌相洗脫，適合于較簡(jiǎn)潔樣品分析梯度洗脫：洗脫方式可以是線性的或非線性的，也可以是二元的或多元的，接受二元或多元組合溶劑作為流淌相可以敏捷調(diào)整流淌相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分別或調(diào)整出峰時(shí)間三、洗脫方式的選擇2023/3/227§3.5色譜的應(yīng)用藥學(xué)：藥物質(zhì)量限制、藥材最佳采收期、炮制工藝確定、新藥研發(fā)；2.環(huán)境檢測(cè)：大氣、土壤、水體等中污染物的定性定量分析；3.食品分析：農(nóng)殘分析、獸殘分析、養(yǎng)分成分定性定量分析；4.化工：工藝探討、反應(yīng)進(jìn)度確定、產(chǎn)品質(zhì)量限制；5.臨床、藥物代謝：藥物體內(nèi)代謝探討、臨床病例探討。標(biāo)準(zhǔn)號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱GB/T18294.4-2007

火災(zāi)技術(shù)鑒定方法第4部分:高效液相色譜法

GB/T18397-2001

復(fù)合預(yù)混合飼料中泛酸的測(cè)定高效液相色譜法

GB/T18872-2002

飼料中維生素K3的測(cè)定高效液相色譜法

GB/T18932.18-2003

蜂蜜中羥甲基糠醛含量的測(cè)定方法液相色譜-紫外檢測(cè)法

GB/T18932.25-2005

蜂蜜中青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、鄰氧青霉素、雙氧青霉素殘留量的測(cè)定方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

GB/T18932.26-2005

蜂蜜中甲硝噠唑、洛硝噠唑、二甲硝咪唑殘留量的測(cè)定方法液相色譜法

GB/T18932.3-2002

蜂蜜中鏈霉素殘留量的測(cè)定方法液相色譜法

GB/T18932.4-2002

蜂蜜中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測(cè)定方法液相色譜法

GB/T18932.5-2002

蜂蜜中磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲基異噁唑、磺胺二甲氧嘧啶殘留量的測(cè)定方法液相色譜法

GB/T18932.7-2002

蜂蜜中苯酚殘留量的測(cè)定方法液相色譜法

GB/T19182-2003

咖啡咖啡因含量的測(cè)定高效液相色譜法

GB/T19267.11-2003

刑事技術(shù)微量物證的理化檢驗(yàn)第11部分:高效液相色譜法

GB/T19371.2-2003

飼料中液態(tài)蛋氨酸羥基類似物的測(cè)定高效液相色譜法

GB/T19423-2003

飼料中尼卡巴嗪的測(cè)定高效液相色譜法

標(biāo)準(zhǔn)號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱GB/T19427-2003

蜂膠中蘆丁、楊梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松屬素、苛因、高良姜素含量的測(cè)定方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法和液相色譜-紫外檢測(cè)法

GB/T19542-2004

飼料中磺胺二甲基嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶的測(cè)定高效液相色譜法

GB/T19681-2005

食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法高效液相色譜法

GB/T19684-2005

飼料中金霉素的測(cè)定高效液相色譜法

GB/T20189-2006

飼料中萊克多巴胺的測(cè)定高效液相色譜法

GB/T20362-2006

雞蛋中氯羥吡啶殘留量的檢測(cè)方法高效液相色譜法

GB/T20365-2006

硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測(cè)定液相色譜法

GB/T20379-2006

淀粉衍生物葡萄糖漿、果糖漿和氫化葡萄糖漿成分的測(cè)定高效液相色譜法

GB/T20741-2006

畜禽肉中地塞米松殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

GB/T20742-2006

牛甲狀腺和牛肉中硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、巰基苯并咪唑殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

GB/T20743-2006

豬肉、豬肝和豬腎中桿菌肽殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

GB/T20744-2006

蜂蜜中甲硝唑、洛硝噠唑、二甲硝咪唑殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1）HPLC-DAD方法的建立

1、丹參養(yǎng)分器官中丹參酮I和丹參酮IIA的測(cè)定HPLC-DAD提取條件洗脫條件檢測(cè)條件方法學(xué)考察1）HPLC-DAD方法的建立

1、丹參養(yǎng)分器官中丹參酮I和丹參酮IIA的測(cè)定HPLC-DAD提取條件洗脫條件檢測(cè)條件方法學(xué)考察★提取條件的選擇：分別考察了回流提取法和超聲提取法，結(jié)果顯示：回流提取法和超聲提取法均可達(dá)到同樣的提取效率，但超聲提取法提取時(shí)間明顯縮短，提取操作簡(jiǎn)潔便利，故本試驗(yàn)接受超聲提取法。然后，分別考察了不同比例的二氯甲烷-甲醇溶劑及不同提取時(shí)間2種成分的提取率。試驗(yàn)結(jié)果顯示：接受二氯甲烷-甲醇(1∶9)作提取溶劑效果最好，超聲提取0.5h，丹參酮I和丹參酮IIA的提取率均達(dá)到最大提取條件：二氯甲烷－甲醇（v/v=1/9）混合溶劑超聲提取0.5h色譜洗脫條件:美國(guó)ZorbaxSB-C18（150mm×4.6mm,5.0μm）色譜柱；流淌相：甲醇－水，梯度洗脫，其時(shí)間程序?yàn)?→10→13min，甲醇體積分?jǐn)?shù)相應(yīng)為72%→87%→72%，流速：1.0mL·min-1